Les ATPases-P4 sont des transporteurs membranaires couplant l'hydrolyse de l'ATP au transport de lipides dans les membranes cellulaires eucaryotes. Avec leurs partenaires, les protéines CDC50, les ATPases-P4 transportent les phospholipides, en particulier la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyléthanolamine (PE), du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes, assurant ainsi le maintien de l'asymétrie membranaire.Drs2p est l'une des cinq ATPases-P4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle est localisée dans les membranes du trans-Golgi (TGN), et elle a comme partenaire la protéine Cdc50p, qui est nécessaire à l'adressage correct et probablement au transport catalysé par Drs2p. Drs2p est principalement responsable du transport de la phosphatidylsérine (PS) dans les membranes du TGN et son activité est essentielle pour le maintien de la PS dans le feuillet cytosolique de ces membranes. En raison du rôle crucial de la PS dans de nombreuses voies de signalisation, aussi bien à l’extérieur (au cours de l’apoptose par exemple) qu’à l’intérieur de la cellule (par le recrutement de protéines impliquées dans des processus cellulaires essentiels), il est important de comprendre le mécanisme par lequel l’asymétrie de la PS est établie.Afin de progresser dans la compréhension du mécanisme moléculaire du transport de lipides, nous avons mis au point une procédure qui nous a permis de co-exprimer Drs2p et Cdc50p dans Saccharomyces cerevisiae. La purification de Drs2p par chromatographie d'affinité sur résine streptavidine a permis d'obtenir une fraction purifiée contenant très majoritairement Drs2p et Cdc50p, à raison de 1-2 mg/L de culture. Les deux protéines sont sous forme de complexe avec une stœchiométrie d'association de 1:1. Le complexe purifié est fonctionnel, et présente une activité d’hydrolyse de l’ATP stimulée par son substrat, la PS. Cette stimulation n’est cependant possible qu’en présence de PI4P, un phosphoinositide impliqué dans la régulation du trafic membranaire.De par leur rôle crucial dans le maintien de l'asymétrie membranaire, les ATPases-P4 ne peuvent qu'être régulées. Comme de nombreuses ATPases de type P sont soumises à une auto-régulation de leur activité, nous avons examiné la possibilité d’une telle auto-régulation dans le cas des ATPases P4. Pour ce faire, une approche par mutagenèse dirigée et protéolyse ménagée associée à l’identification par spectrométrie de masse des peptides ont été effectuées. La protéolyse ménagée du complexe purifié Drs2p/Cdc50p montre une activité ATPasique dépendante au PI4P de 30-50 fois plus importante. La protéolyse par la thrombine engendre un Drs2p dépourvu d'une partie N-terminale (R104) et d'une partie C-terminale (R1290) qui reste toujours associé à Cdc50p. Ce résultat montre qu'une coupure appropriée au niveau des extrémités terminales de Drs2p peut augmenter de façon significative, en présence du PI4P, l'activité ATPasique du complexe, nous amenant ainsi à identifier un rôle auto-inhibiteur des extrémités N- et/ou C-terminales de Drs2p.Ce travail ouvre des perspectives quant à la caractérisation structurale et fonctionnelle du mécanisme de transport de lipides par le complexe. Par ailleurs, il laisse entrevoir la possibilité d’étudier les bases moléculaires des pathologies associées aux mutations de certaines ATPases P4 humaines. / Maintenance of phospholipid asymmetry in eukaryotic cell membranes is essential for cellular integrity and function. P4-ATPases, from the P-type ATPases family, are energy-dependent transporters, together with their CDC50 accessory subunits couple ATP hydrolysis to lipid transport from the exoplasmic to cytoplasmic leaflet to maintain membrane asymmetry.Drs2p is one of these P4-ATPases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Drs2p is localised in trans-Golgi (TGN) membranes in association with its binding partner Cdc50p, which contributes to the correct addressing of Drs2p and probably in the catalyzed transport by Drs2p. Drs2p transport principally phosphatidylserine (PS) in TGN membranes. The PS is important for a several signalling pathways, for example, in apoptosis and recruitment of the proteins implied in various essential cellular process, so, it's very important to understand the mechanism that establishes this asymmetry.To gain in comprehension of molecular mechanism of lipid transport, robust protocols for expression and purification are required. In this work, we present a procedure for high-yield co-expression of Drs2p and Cdc50p. The purification of Drs2p and Cdc50p is achieved in a single step by affinity chromatography on streptavidin beads, yielding, 1-2 mg purified Drs2p/Cdc50p per liter of culture. This procedure allows purification of the complex Drs2p/Cdc50p with stoichiometry to 1:1. Our complex is functional, overal ATP hydrolysis by the complex is dependent of PS, favourite substrate of Drs2p. This hydrolyze is critically dependent on the presence of PI4P, a phosphoinositide involved in regulation of membrane trafficking.Like many P-type ATPases auto-regulate their activity, we examined the possibility that P4-ATPases are auto-regulated. In this work, we use directed mutagenesis and limited proteolysis associated with mass spectrometry for identify peptides. We show that limited proteolysis of a purified complex Drs2p/Cdc50p resulted in up to a 30-50 fold increase of it ATPase activity, which however remained dependent on PI4P. Using thrombin as the protease, Cdc50p remained intact and in complex with Drs2p, which was cleaved at two positions, namely after R104 and after R1290. Our results therefore reveal that trimming off appropriate regions of the terminal extensions of Drs2p can increase its ATPase activity in the presence of PI4P by an enormous factor, thereby identifying a role of N and/or C-terminal extensions in auto-inhibition of Drs2p.Our results open perspectives on the structural and the functional characterization of the lipid transport mechanism by the complex Drs2p/Cdc50p. Furthermore, our procedures open up the possibility of studying the molecular bases of the pathologies associated with the mutations of human P4-ATPases.

Traffic generators, as an indispensable tool to test devices under test and networking protocols, help researchers to execute performance inspection and optimization. Among all traffic generators, TRex is an open-source, high-performance, and low-cost traffic generator which is built on Data Plane Development Kit (DPDK). It supports stateless traffic generation patterns and the modification of fields and length for each packet. More importantly, it can emulate realistic TCP stateful traffic. Although DPDK can greatly improve the packet processing speed, the maximum throughput of the system is limited by the bandwidth of network interface cards (NICs). This thesis combines TRex traffic generator and a P4 programmable switch to construct a high-speed, feature-rich, and cost-effective traffic generation system. Our basic idea is to ”shift” the bottleneck of NICs’ bandwidth to a P4 programmable switch. In particular, TRex only generates small packet headers while the payloads of the packets are generated on the P4 programmable switch by fast recirculations. Since sending small packets consumes less bandwidth, TRex can reach a higher packet rate. Thanks to the enormous bandwidth provided by the programmable switches and the higher packet rate, our design can generate traffic beyond the bandwidth of the NICs. Besides, we build upon the original TRex and completely inherit its toolchain, which exhibits high transparency. That is to say, the users do not need to modify the profiles that generate traffic to use our system. We establish and test our design on Virtual Machines, and then perform a real-world performance evaluation on a physical server with 2×100Gbps Mellanox NICs. The evaluation results show that our system can achieve more than 2x throughput for Advanced Stateful mode than the TRex without any modification when the average packet size reaches 1367 bytes. / Trafikgeneratorer, som är ett oumbärligt verktyg för att testa testade enheter och nätverksprotokoll, hjälper forskare att utföra prestandainspektion och optimering. TRex är en trafikgenerator med öppen källkod, hög prestanda och låg kostnad som bygger på Data Plane Development Kit (DPDK). Den stöder statslösa trafikgenereringsmönster och modifiering av fält och längd för varje paket. Ännu viktigare är att den kan emulera realistisk TCP stateful-trafik. Även om DPDK kan förbättra paketbehandlingshastigheten avsevärt, begränsas systemets maximala genomströmning av bandbredden hos nätverksgränssnittskorten (NIC). Denna avhandling kombinerar TRex trafikgenerator och en P4 programmerbar switch för att konstruera ett höghastighets, funktionsrikt och kostnadseffektivt system för trafikgenerering. Vår grundläggande idé är att ”flytta” flaskhalsen i NIC:s bandbredd till en programmerbar P4-switch. TRex genererar endast små paketrubriker medan paketens nyttolast genereras på den programmerbara P4-växeln genom snabba återcirkulationer. Eftersom små paket förbrukar mindre bandbredd kan TRex nå en högre paketfrekvens. Tack vare den enorma bandbredd som de programmerbara switcharna ger och den högre paketfrekvensen kan vår design generera trafik som överskrider NIC:ernas bandbredd. Dessutom bygger vi vidare på den ursprungliga TRex och ärver helt dess verktygskedja, som uppvisar hög transparens. Det innebär att användarna inte behöver ändra de profiler som genererar trafik för att använda vårt system. Vi etablerar och testar vår design på virtuella maskiner och utför sedan en verklig prestandautvärdering på en fysisk server med 2×100Gbps Mellanox NIC. Utvärderingsresultaten visar att vårt system kan uppnå mer än 2x genomströmning för Advanced Stateful-läge än TRex utan någon modifiering när den genomsnittliga paketstorleken når 1367 byte.

Les membranes plasmiques et les membranes du trans-Golgi des cellules eucaryotes présentent une asymétrie des lipides qui les composent, avec les aminophospholipides (APLs : phosphatidylsérine et phosphatidyléthanolamine) enrichis dans le feuillet cytosolique. La dissipation de cette asymétrie est impliquée dans de nombreux processus (patho)physiologiques. Plusieurs études suggèrent que les ATPases P4 sont les candidats les plus probables pour le transport des APLs et le maintien de leur distribution asymétrique ; leur délétion dans la levure inhibe le trafic membranaire. En outre, des études ont montré que les ATPases P4 interagissaient avec les protéines de la famille CDC50 ; cette interaction est essentielle pour l’adressage et peut-être aussi la fonction des ATPases P4. Afin de contribuer à la compréhension du mécanisme de transport des lipides par les ATPases P4, l’objectif de ce travail a été de mettre au point la co-expression fonctionnelle, dans la levure, de l’ATPase P4 Drs2p et de sa protéine partenaire Cdc50p. Nous avons obtenu une fraction membranaire enrichie à 3% avec la protéine Drs2p, majoritairement en complexe avec Cdc50p. L’étude fonctionnelle du complexe nous a permis de mettre en évidence un rôle crucial du phosphatidylinositol-4-phosphate (PI(4)P), un important régulateur du trafic membranaire, au cours d’une étape particulière du cycle catalytique. Nous avons également développé un protocole de purification sur résine streptavidine du complexe Drs2p/Cdc50p. Enfin, comme un site potentiel d’interaction avec le PI(4)P est présent sur l’extrémité C-terminale de Drs2p, nous avons engendré différentes constructions de Drs2p, dans lesquelles une partie de l’extrémité C-terminale a été délétée ; dans une autre construction, l’extrémité N-terminale a également été délétée. Notre travail ouvre la voie à la caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée du complexe Drs2p/Cdc50p, et à l’étude du rôle du transport de lipides dans le trafic membranaire. / Trans-Golgi membranes and plasma membranes of eukaryotic cells are asymmetric, with their cytosolic leaflet enriched in aminophospholipids (APLs: phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine). Dissipation of this asymmetry is involved in many (patho)physiological processes. P4 ATPases are prime candidates for APL transport and for maintaining asymmetry across membranes. In addition, yeast deleted for P4 ATPases display membrane trafficking defects. Besides, CDC50 proteins have been shown to interact physically with P4 type ATPases, and this interaction is important for addressing the complex to the right destination, and possibly also for its function. To gain insight into the molecular mechanism of lipid transport by P4 ATPases, the goal of my thesis was to develop the co-expression, in yeast, of a functional P4 ATPase, Drs2p, together with its partner, Cdc50p. The strategy we developed allowed us to obtain a membrane fraction enriched in Drs2p (~3%), mainly in complex with Cdc50p. Functional characterization of the complex identified phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P), a major regulator of membrane trafficking, as a crucial component for rapid completion of the Drs2p/Cdc50p catalytic cycle. We also purified the complex in one step on streptavidin beads. Finally, we started investigating the potential auto-inhibitory roles of the C-terminus (as the C-terminus of Drs2p contains a PI4P binding site) and the N-terminus of Drs2p, by expressing various truncated versions of Drs2p. Our work sets the stage for detailed functional and structural characterization of the Drs2p/Cdc50p complex and its role in membrane traffic.

Les opérateurs de réseau sont confrontés à de grands défis en termes de coût et de complexité pour intégrer les nouvelles technologies de communication (e.g., 4G, 5G, fibre optique) et pour répondre aux demandes croissantes des nouveaux services réseau adaptés aux nouveaux cas d’utilisation. La "softwarization" des opérations réseau à l'aide des paradigmes SDN (Software Defined Networking) et NFV (Network Function Virtualization) est en mesure de simplifier le contrôle et la gestion des réseaux et de fournir des services réseau de manière efficace. Les réseaux programmables SDN permettent de dissocier le plan de contrôle du plan de données et de centraliser le plan de contrôle pour simplifier la gestion du réseau et obtenir une vision globale. Cependant, ceci amène des problèmes de passage à l'échelle difficiles à résoudre. Par ailleurs, en dissociant la partie matérielle de la partie logicielle des routeurs, NFV permet d'implanter de manière flexible et à moindre coût toutes sortes de fonctions réseau. La contrepartie est une dégradation des performances due à l'implantation en logiciel des fonctions réseau qui sont déportées des routeurs. Pour aborder les problèmes de passage à l'échelle et de performance des paradigmes SDN/NFV, nous proposons dans la première partie de la thèse, une architecture modulaire de gestion et de contrôle du réseau, dans laquelle le contrôleur SDN délègue une partie de ses responsabilités à des fonctions réseau spécifiques qui sont instanciées à des emplacements stratégiques de l'infrastructure réseau. Nous avons choisi un exemple d'application de streaming vidéo en direct (comme Facebook Live ou Periscope) utilisant un service de multicast IP car il illustre bien les problèmes de passage à l'échelle des réseaux programmables. Notre solution exploite les avantages du paradigme NFV pour résoudre le problème de scalabilité du plan de contrôle centralisé SDN en délégant le traitement du trafic de contrôle propre au service multicast à des fonctions réseau spécifiques (appelées MNF) implantées en logiciel et exécutées dans un environnement NFV localisé à la périphérie du réseau. Notre approche fournit une gestion flexible des groupes multicast qui passe à l'échelle. De plus, elle permet de bénéficier de la vision globale du contrôle centralisé apportée par SDN pour déployer de nouvelles politiques d'ingénierie du trafic comme L2BM (Lazy Load Balance Multicast) dans les réseaux de fournisseurs d’accès à Internet (FAI) programmables. L'évaluation de cette approche est délicate à mettre en œuvre car la communauté de recherche ne dispose pas facilement d'infrastructure SDN à grande échelle réaliste. Pour évaluer notre solution, nous avons élaboré l'outil DiG qui permet d'exploiter l'énorme quantité de ressources disponibles dans une grille de calcul, pour émuler facilement de tels environnements. DiG prend en compte les contraintes physiques (mémoire, CPU, capacité des liens) pour fournir un environnement d'évaluation réaliste et paramétrable avec des conditions contrôlées. La solution que nous proposons délègue le contrôle et la gestion du réseau concernant le service de multicast aux fonctions spécifiques MNF exécutées dans un environnement NFV. Idéalement, pour davantage d'efficacité, toutes ces fonctions spécifiques devraient être implantées directement au sein des routeurs avec du hardware programmable mais cela nécessite que ces nouveaux routeurs puissent exécuter de manière indépendante plusieurs fonctions réseau à la fois. Le langage de programmation P4 est une technologie prometteuse pour programmer le traitement des paquets de données dans les routeurs programmables (hardware et logiciels). / Network operators are facing great challenges in terms of cost and complexity in order to incorporate new communication technologies (e.g., 4G, 5G, fiber) and to keep up with increasing demands of new network services to address emerging use cases. Softwarizing the network operations using SoftwareDefined Networking (SDN) and Network Function Virtualization (NFV) paradigms can simplify control and management of networks and provide network services in a cost effective way. SDN decouples control and data traffic processing in the network and centralizes the control traffic processing to simplify the network management, but may face scalability issues due to the same reasons. NFV decouples hardware and software of network appliances for cost effective operations of network services, but faces performance degradation issues due to data traffic processing in software. In order to address scalability and performance issues in SDN/NFV, we propose in the first part of the thesis, a modular network control and management architecture, in which the SDN controller delegates part of its responsibilities to specific network functions instantiated in network devices at strategic locations in the infrastructure. We have chosen to focus on a modern application using an IP multicast service for live video streaming applications (e.g., Facebook Live or Periscope) that illustrates well the SDN scalability problems. Our solution exploits benefits of the NFV paradigm to address the scalability issue of centralized SDN control plane by offloading processing of multicast service specific control traffic to Multicast Network Functions (MNFs) implemented in software and executed in NFV environment at the edge of the network. Our approach provides smart, flexible and scalable group management and leverages centralized control of SDN for Lazy Load Balance Multicast (L2BM) traffic engineering policy in software defined ISP networks. Evaluation of this approach is tricky, as real world SDN testbeds are costly and not easily available for the research community. So, we designed a tool that leverages the huge amount of resources available in the grid, to easily emulate such scenarios. Our tool, called DiG, takes into account the physical resources (memory, CPU, link capacity) constraints to provide a realistic evaluation environment with controlled conditions. Our NFV-based approach requires multiple application specific functions (e.g., MNFs) to control and manage the network devices and process the related data traffic in an independent way. Ideally, these specific functions should be implemented directly on hardware programmable routers. In this case, new routers must be able to execute multiple independently developed programs. Packet-level programming language P4, one of the promising SDN-enabling technologies, allows applications to program their data traffic processing on P4 compatible network devices. In the second part of the thesis, we propose a novel approach to deploy and execute multiple independently developed and compiled applications programs on the same network device. This solution, called P4Bricks, allows multiple applications to control and manage their data traffic, independently. P4Bricks merges programmable blocks (parsers/deparsers and packet processing pipelines) of P4 programs according to processing semantics (parallel or sequential) provided at the time of deployment.

Le paludisme est une maladie dévastatrice causée par un parasite du genre Plasmodium. Du fait de la propagation de souches résistantes aux actuels antipaludéens, il est nécessaire de comprendre les fonctions physiologiques essentielles du parasite afin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Les transporteurs membranaires sont une classe importante de cibles chez l'homme du fait de leur rôle physiologique essentiel pour la cellule. Cependant, chez les parasite du genre Plasmodium, seulement quelques transporteurs ont été biochimiquement caractérisés. Des études récentes de délétion de gènes dans un model murin ont montrées que l’ATPase de type P4, ou flippase, ATP2 de Plasmodium est essentielle pour le parasite. Chez les Eucaryotes, l’activité de translocation des lipides des ATPases de type P4 est nécessaire pour maintenir l’asymétrie des membranes, un élément clé dans de nombreux processus essentiels comme la formation de vésicules ou l’apoptose. Les flippases forment des complexes hétéromériques avec les protéines de la famille Cdc50 qui sont également trouvées dans le génome de Plasmodium. Pour comprendre le rôle fonctionnel de ces transporteurs putatifs durant l’infection par le parasite, nous avons besoin d’étudier leur mécanisme de transport et d’identifier leur (s) substrat (s). Nous avons entrepris l’expression hétérologue chez Saccharomyces cerevisiae d’ATP2, en complexe avec les sous unités Cdc50, de trois espèces différentes de Plasmodium. Nous avons réussi à co-exprimer l’orthologue ATP2 de P. chabaudi (PcATP2) et les sous unités PcCdc50 correspondantes. Par co-immunoprécipitation et une chromatographie d’exclusion stérique détectée par fluorescence, nous sommes parvenus à identifier la sous unité s’associant à PcATP2 : PcCdc50.1. Nous avons ensuite purifié le complexe PcATP2/PcCdc50.1 en utilisant des nanobodies reconnaissant la GFP fusionnée à l’extrémité C-terminale de PcATP2 et nous avons initié la caractérisation fonctionnelle avec des tests de phosphorylation et d’activité ATPasique. / Malaria is a devastating disease caused by a parasite of the genus Plasmodium. Due to the spread of strains resistant to current antimalarial drugs, it is necessary to understand essential physiological functions of the parasite in order to find new drug targets. Membrane transport proteins are an important class of drug targets in humans, as they perform essential physiological roles of the cell. However, for Plasmodium parasites, just a few membrane transporters have been biochemically described. Recent gene-deletion studies in malaria mouse models have shown that the Plasmodium P4-ATPase, or lipid flippase, ATP2 is essential for the parasite. In eukaryotes, the phospholipid translocation activity of P4-ATPases is needed to maintain the asymmetric distribution of membranes, a key element in many essential processes like vesicle budding or apoptosis. Lipid flippases form heteromeric complexes with members of the Cdc50 protein family, also found in the genomes of Plasmodium parasites. To understand the functional role of these still putative transporters during malaria infection we need to study their transport mechanism and identify their substrate(s). We have conducted the heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae of ATP2 in complex with the Cdc50 subunits from three different Plasmodium species. We succeeded to co-express the ATP2 ortholog of P. chabaudi (PcATP2) and the related putative PcCdc50 proteins. By co-immunoprecipitation and Fluorescence-detection Size Exclusion Chromatography, we have managed to identify the Cdc50 β-subunit that associates to PcATP2: PcCdc50.1. We then purified the complex PcATP2/PcCdc50.1 using immobilized nanobodies that recognize the GFP fused at the C-terminal end of PcATP2 and we initiated the functional characterization using ATPase and phosphorylation activity assays.

The activation and functionalization of white phosphorus remains a challenging task in order to obtain short and efficient routes to synthetically useful phosphorus reagents. Oxidative onionation is a new concept provided by this work which allows for the transformation of white phosphorus into highly reactive mono- and oligophosphorus building blocks using oniosubstituted main group element compounds.

Die Umkehrung von Lipiden und die asymmetrische Verteilung in Membranbilayern sind häufige Phänomene bei Eukaryoten, katalysiert durch P4-ATPasen. Ihr Auftreten und ihre Bedeutung bei apikomplexen Parasiten sind jedoch wenig erforscht. Wir zeigen, dass Toxoplasma gondii Phosphatidylserin (PtdSer) und Phosphatidylethanolamin (PtdEtn) aus seiner Umgebung aufnehmen kann, jedoch keine Phosphatidylcholin (PtdCho)-Sonden. Die flusszytometrische Quantifizierung bestätigte die Selektivität des Phospholipidtransports und dessen Abhängigkeit von Energie (ATP) und Protein.Wir identifizierten fünf P4-ATPasen (TgP4-ATPase1-5) und ihre Untereinheiten - das Ligandeffektormodul (TgLem1-3) im Genom von T. gondii. TgP4-ATPase1 ist in der apikalen Plasmamembran mit TgLem1 vorhanden; TgP4-ATPase3 und TgLem3 sind im Golgi-Netzwerk lokalisiert, während TgP4-ATPase2 und TgP4-ATPase5 in der Plasmamembran und den Endo-/Zytomembranen vorkommen. Die Depletion von TgP4-ATPase1-3 beeinträchtigte das Wachstum des Parasiten in humanen Wirtszellen und offenbarte deren entscheidende Rolle. Zusätzlich zeigten unsere Arbeiten, dass TgP4-ATPase1 und TgLem1 zusammenarbeiten, um PtdSer über die Plasmamembran zu translozieren. Ein genetisches Ausschalten von P4-ATPase1 und eine bedingte Depletion von TgLem1 in Tachyzoiten störten die asexuelle Reproduktion und die Translokation von PtdSer erheblich. Die phänotypische Analyse einzelner Mutanten zeigte, dass die Lipidumkehrung für die Motilität, den Ausbruch und die Invasion der Tachyzoiten notwendig ist. Biotinylierungsbasierte Nähe-Assays und reziproke Immunpräzipitationsexperimente zeigten die physische Interaktion von P4-ATPase1 und Lem1. Unsere Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung der Lipidumkehrung während des lytischen Zyklus eines Modellpathogens und identifizieren P4-ATPase1 als potenzielles Wirkstoffziel in T. gondii. / Lipid flipping and asymmetric distribution in membrane bilayers is a common eukaryotic phenomenon catalyzed by various P4-ATPases. However, its occurrence, mechanism, and significance in apicomplexan parasites are not well understood. We demonstrate that Toxoplasma gondii, a clinically relevant intracellular parasite, can salvage phosphatidylserine (PtdSer) and phosphatidylethanolamine (PtdEtn) but not phosphatidylcholine (PtdCho) probes. Flow cytometric quantitation of NBD-lipid probes confirmed the selectivity of phospholipid transport and its dependence on energy (ATP) and protein. We identified five P4-ATPases (TgP4-ATPase1-5) and their subunits—ligand effector module (TgLem1-3) in the T. gondii genome. During the lytic cycle, TgP4-ATPase1 is located in the apical plasmalemma with its partner TgLem1; TgP4-ATPase3 and TgLem3 are in the Golgi network, while TgP4-ATPase2 and TgP4-ATPase5 are found in the plasmalemma and endo/cytomembranes. Depletion of TgP4-ATPase1-3 impaired parasite growth in human host cells, revealing their crucial roles. Further work showed that TgP4-ATPase1 and TgLem1 cooperate to translocate PtdSer across the plasma membrane. Genetic knockout of P4-ATPase1 and conditional depletion of TgLem1 in tachyzoites disrupted asexual reproduction and translocation of PtdSer. Additionally, phenotypic analysis of mutants indicated that lipid flipping is essential for the motility, egress, and invasion of tachyzoites. Proximity-dependent biotinylation and reciprocal immunoprecipitation assays confirmed the physical interaction of P4-ATPase1 and Lem1. Our findings highlight the significance of lipid flipping during the lytic cycle of a model pathogen and identify P4-ATPase1 as a potential drug target in T. gondii.

Lung cancer is one of the most important causes of 'avoidable deaths' globally and is responsible for approximately 900,000 deaths per year. However, lung cancer rates tend to be higher for males than for females and the disease also varies geographically, as rates are far higher in developed countries compared to developing countries. Scotland has the highest rate of lung cancer of any country where lung cancer data is available. However, explaining the spatial distribution of this disease is difficult because lung cancer has a number of known causes that operate at a range of different spatial scales. This is further complicated by the lag time between the period of exposure to a risk factor and the date of diagnosis. This thesis examines the causes of lung cancer across Scotland, using lung cancer registrations for the period 1988 to 1991. Exploratory methods are presented for examining the geographical distribution of the disease in small areas using methods of age-standardisation and cluster detection to identify areas with unusual rates. Estimates of the key risk factors potentially associated with lung cancer are calculated for the same small areas. These include estimates of smoking behaviour, air pollution levels in 1971 and 1991, radon gas potential, coal mining activity, quarrying activity and area deprivation. The risk factors are incorporated into a set of regression models to examine which factors are significant in explaining lung cancer incidence. Finally, the residual values derived from the optimum model of lung cancer incidence in Scotland are examined to identify areas where lung cancer incidence is particularly high and low. This study revealed that there were marked geographical differences in lung cancer rates, with higher rates in the large urban areas, especially Glasgow, and also the more deprived areas of Scotland. Smoking was consistently significant in explaining lung cancer incidence for all cohorts, types of lung cancer and urban-rural areas. The estimated air pollution levels in 1971 were also found to be significant, but the 1991 estimates were not. Exposure to radon was only significant in explaining lung cancer in the younger age groups. However, the coal mining and quarrying variables did not independently influence the incidence of the disease. Area deprivation and measure of urbanness both had a significant effect on lung cancer incidence in Scotland that was independent of the key risk factors. The analysis of the residual values showed that, having controlled for the key risk factors, lung cancer incidence is higher than expected in rural rather than urban areas.

La síntesi de poliéters constitueix un important tema d'estudi per les seves bones propietats físiques i químiques. Així, a més de la seva importància en el camp dels poliuretans, recentment, la polimerització de monòmers epoxídics funcionalitzats ha permès dissenyar polímers d'alta tecnologia amb propietats específiques.El treball de tesi que es presenta estudia la síntesi i caracterització de polièters obtinguts mitjançant un sistema iniciador que es basa en la combinació de la base de poliiminofosfazè t-Bu-P4 amb un compost hidroxílic com el 3,5-di-terc-butilfenol. El t-Bu-P4 es un compost descrit recentment, que es caracteritza per ser una de les bases neutres més fortes que es coneixen. Per aquesta raó, aquest compost està trobant nombroses aplicacions en el camp de la síntesi orgànica i més recentment en la polimerització de monòmers amb excel·lents resultats. No obstant, actualment només hi ha un grup de treball que l'hagi utilitzat per a la polimerització d'oxirans i ho ha fet en el cas del monòmer més senzill, l'òxid d'etilè.En aquest treball, s'ha estudiat la cinètica i el mecanisme de polimerització del fenilglicidiléter, amb aquest sistema iniciador, i s'ha comparat amb altres iniciadors aniònics convencionals. Per això, s'ha estudiat l'evolució del pes molecular del polímers mitjançant tècniques cromatogràfiques de SEC. També s'han determinat el pesos moleculars mitjançant RMN de 1H utilitzant un nou procediment de derivatització dels polímers que permet augmentar considerablement la sensibilitat d'aquesta tècnica. Així mateix, s'ha dut a terme un estudi detallat de la microestructura de tots els polímers obtinguts, determinant característiques com la seva tacticitat, regiorregularitat i naturalesa del extrems de cadena. Per fer això, s'han sintetitzat compostos model, s'han fet seguiments cinètics per RMN, reaccions de derivatització i experiències de correlació bidimensional de RMN. Així mateix, per a investigar la estructura de cadascuna de les cadenes de la distribució de pesos moleculars s'ha utilitzat avantatjosament la moderna tècnica de MALDI-TOF MS. La correlació dels resultats obtinguts, no només ha permès establir el mecanisme bàsic de polimerització, sinó també identificar i avaluar diferents els processos competitius que es produeixen i que no han estat descrits fins ara a la literatura. D'aquestos, cal destacar la formació de unions irregulars i la existència de reaccions de substitució nucleòfila aromàtica quan en el anell aromàtic hi han substituents electroaceptors. També, s'han identificat processos de fragmentació de cadena quan el iniciador es el terc-butóxid potàssic.Finalment, s'ha aconseguit aplicar, amb èxit, aquest sistema iniciador a la polimerització de diferent monòmers funcionalitzats amb potencial aplicació en el camp de la fotònica i l'electro-òptica. / The polyethers synthesis is an interesting subject of study due to the good physical and chemical properties. Therefore, these polymers are widely used in the polyurethanes chemistry and, recently, in the polymerization of functionalized epoxidic monomers to design and obtain Hi-Tech polymers with specific properties.In this present thesis is studied the synthesis and characterization of polyethers obtained through a initiator system which is based in the mixture of phosphazene base t-Bu-P4 and 3,5-di-tert-buthylphenol. The t-Bu-P4 is a recent reported compound, which is one of the strongest neutral bases known. So, this compound have found different uses in the organic synthesis and, recently, in the polymerization of monomers with very good results. There is only one group reporting the polymerization of epoxides using this base, and they polymerized the simplest monomer, the ethylene oxide.We did the kinetic and mechanistic studies to polymerize the glicidilphenilether, with this initiator system, and we have compared the results with those obtained using conventional anionic initiators. Some of these studies are the evolution of the polyethers' molecular weight using GPC techniques. Also, we determined the molecular weights using 1H NMR after a derivatization of the polyethers that can increase the sensitivity with respect to the end-groups. We studied deeply the microstructure of all the polymers obtained, determining the tacticity, regio-regularity and origin of the end-groups. It was done by the model compounds syntheses, the NMR kinetic studies, derivatization reactions and bidimensional correlation NMR experiments. In the same way, we studied the chain structure and the molecular weight distribution using a MALDI-TOF mass spectrometry, a technique with an increasing interest in the polymer field.The correlation of the obtained results has helped us to state a basic polymerization mechanism and to identify and evaluate different competitive processes in the polymerization which are not reported in the literature yet. Two of these competitive processes are the regio-irregular links formation and the aromatic nucleophilic substitution when the monomer has an electron-withdrawing group in the aromatic ring. We have identified a chain fragmentation processes in the polymerization using the potassium tert-butoxide as initiator.Finally, we applied this initiator system to polymerize monomers with different functionalities, obtaining polymers potentially actives in technological fields.

OLIVEIRA, Ana Karolinna Maia de. Estudo de casos de complexidade de colorações gulosa de vértices e de arestas. 2011. 58 f. Dissertação (Mestrado em ciência da computação)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-08T18:03:48Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_akmoliveira.pdf: 520341 bytes, checksum: b0c0d48f19d7c3e376c2c79c3a815b08 (MD5) / Approved for entry into archive by Rocilda Sales (rocilda@ufc.br) on 2016-07-13T12:34:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_akmoliveira.pdf: 520341 bytes, checksum: b0c0d48f19d7c3e376c2c79c3a815b08 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T12:34:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_akmoliveira.pdf: 520341 bytes, checksum: b0c0d48f19d7c3e376c2c79c3a815b08 (MD5) Previous issue date: 2011 / The vertices and edges colorings problems, which consists in determine the smallest number of colors needed to color the vertices and edges of a graph, respectively, so that adjacent vertices and adjacent edges, respectively, have distinct colors, are computationally hard problems and recurring subject of research in graph theory due to numerous practical problems they model. In this work, we study the worst performance of greedy algorithms for coloring vertices and edges. The greedy algorithm has the following general principle: to receive, one by one, the vertices (respect. edges) of the graph to be colored by assigning always the smallest possible color to the vertex (resp. edge) to be colored. We note that so greedy coloring the edges of a graph is equivalent to greedily coloring its line graph, this being the greatest interest in research on greedy edges coloring. The worst performance of the Algorithms is measured by the greatest number of colors they can use. In the case of greedy vertex coloring, this is the number of Grundy or greedy chromatic number of the graph. For the edge coloring, this is the greedy chromatic index or Grundy index of the graph. It is known that determining the Grundy number of any graph is NP-hard. The complexity of determining the Grundy index of any graph was however an open problem. In this dissertation, we prove two complexity results. We prove that the Grundy number of a (q,q−4)-graph can be determined in polynomial time. This class contains strictly the class of cografos P4-sparse for which the same result had been established. This result generalizes so those results. The presented algorithm uses the primeval decomposition of graphs, determining the parameter in linear time. About greedy edge coloring, we prove that the problem of determining the Grundy index is NP-complete for general graphs and polynomial for catepillar graphs, implying that the Grundy number is polynomial for graphs of line of caterpillars. More specifically, we prove that the Grundy index of a caterpillar is D or D+1 and present a polynomial algorithm to determine it exactly. / Os problemas de coloracão de vértices e de arestas, que consistem em determinar o menor número de cores necessárias para colorir os vértices e arestas de um grafo, respectivamente, de forma que vértices adjacentes e arestas adjacentes, respectivamente, possuem cores distintas, são problemas computacionalmente difíceis e são objeto de pesquisa recorrente em teoria do grafos em virtude de inúmeros problemas práticos que eles modelam. No presente trabalho, estudamos o pior desempenho dos algoritmos gulosos de coloração de vértices e de arestas. O algoritmo guloso tem o seguinte princípio geral: receber, um a um, os vértices (respect. as arestas) do grafo a ser colorido, atribuindo sempre a menor cor possível ao vértice (resp. aresta) a ser colorido. Observamos que colorir de forma gulosa as arestas de um grafo equivale a colorir de forma gulosa o seu grafo linha, tendo sido este o maior interesse na pesquisa em coloração gulosa de arestas. O pior desempenho dos algoritmos é medido pelo maior número de cores que eles podem utilizar. No caso da coloração gulosa de vértices, esse é o número de Grundy ou número cromático guloso do grafo. No caso da coloração de arestas, esse é o íındice cromático guloso ou íındice de Grundy do grafo. Sabe-se que determinar o número de Grundy de um grafo qualquer é NP-difícil. A complexidade de determinar o índice de Grundy de um grafo qualquer era entretanto um problema em aberto. Na presente dissertação, provamos dois resultados de complexidade. Provamos que o número de Grundy de um grafo (q,q−4) pode ser determinado em tempo polinomial. Essa classe contém estritamente a classe dos cografos e P4-esparsos para os quais o mesmo resultado havia sido estabelecido. Esse resultado generaliza portanto aqueles resultados. O algoritmo apresentado usa a decomposição primeval desses grafos, determinando o parâmetro em tempo linear. No que se refere à coloração de arestas, provamos que o problema de determinar o índice de Grundy é NP-completo para grafos em geral e polinomial para grafos caterpillar, implicando que o número de Grundy é polinomial para os grafos linha desses. Mais especificamente provamos que o índice de Grundy dos caterpillar é D ou D+1 e apresentamos um algoritmo polinomial para determiná-lo exatamente.