L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est synthétisé par la plante en réponse à des stress abiotiques et biotiques dont l’infection par le pathogène bactérien A. tumefaciens. Des travaux antérieurs ont montré que le GABA induit, chez A. tumefaciens C58, l’expression d’une lactonase BlcC (=AttM) qui inactive ses propres signaux quorum-sensing (QS), donc module le transfert horizontal du plasmide Ti. La protéine périplasmique de liaison (Periplasmic Binding Protein, PBP) Atu2422 et le transporteur ABC Bra sont respectivement impliqués dans la perception et le transport du GABA. L’importation du GABA est nécessaire à l’induction de l’expression de BlcC, donc à la dégradation des signaux QS. Les caractéristiques structurales des récepteurs/senseurs du GABA ne sont connus ni chez les bactéries, ni chez les eucaryotes.Ce travail de doctorat a permis de définir la structure et la fonction de deux senseurs du GABA, les PBPs Atu2422 et Atu4243 d’A. tumefaciens C58.La structure cristalline d’Atu2422 a été résolue en présence de GABA ou d’acides aminés antagonistes de la liaison au GABA comme la proline et l’alanine. L'analyse structurale du site de fixation du ligand d’Atu2422 a permis d’identifier deux résidus clés, Phe77 et Tyr275, respectivement impliqués dans la sélectivité du ligand et la liaison du GABA. L’analyse phénotypique de mutants ponctuels a révélé le rôle crucial de ces deux résidus aminés dans l’interaction entre A. tumefaciens C58 et deux plantes hôtes, tomate et tabac. De plus, ces travaux ont défini les caractéristiques moléculaires d’une sous-famille de PBPs présentes chez différentes protéobacteries interagissant avec des hôtes eucaryotes et capables de fixer le GABA et des acides aminés compétiteurs comme la proline ou l’alanine.Ce travail a également révélé une deuxième PBP (appelée GABA2) impliquée dans la perception et l’importation du GABA chez A. tumefaciens. Cette PBP a été identifiée grâce au séquençage du génome et l’analyse du transcriptome de mutants spontanés, issus d’un mutant-KO atu2422 d’A. tumefaciens C58, mais devenus capables de transporter le GABA. La construction d’un mutant défectif pour la PBP GABA2 a permis d’évaluer son rôle dans la signalisation GABA et l’interaction A. tumefaciens-plante hôte. La structure cristalline de cette PBP en présence de GABA a permis d’identifier les résidus clés impliqués dans la fixation du GABA dont le rôle a été validé par l’analyse de mutations ponctuelles. Enfin, une analyse phylogénétique des orthologues de GABA2 a révélé leur présence au sein de nombreuses protéobactéries pathogènes et symbiotiques interagissant avec les plantes. L’ensemble de ces travaux aboutit à la proposition de deux modèles de référence quant aux mécanismes moléculaires associés à la perception du GABA, médiateur de communications inter-cellulaires et inter-organismes. Ce travail illustre l’association des approches de biologie structurale et de génétique pour la compréhension des interactions plantes-microorganismes. / Γ-aminobutyric acid (GABA) is synthesized by plants in response to abiotic and biotic stresses, including infection with A. tumefaciens. Previous works have revealed that GABA induces the expression of the A. tumefaciens BlcC (=AttM) lactonase, which cleaves quorum-sensing (QS) signals, thus modulates QS-regulated functions such as horizontal transfer of the plasmid Ti. Periplasmic binding protein (PBP) Atu2422 and ABC transporter Bra of A. tumefaciens are involved in GABA transport from plant to A. tumefaciens. The structural characteristics of the receptors/sensors of GABA are still unknown in bacteria or eukaryotes.I have studied two GABA-binding PBPs of A. tumefaciens C58, Atu2422 and Atu4243 by a combination of structural, genetic and functional approaches.The crystal structure of Atu2422 was solved in the presence of GABA and competitive amino acids, such as proline and alanine. Structural analysis of the ligand binding site revealed two key residues, Phe77 and Tyr275, which are involved in the ligand selectivity and GABA binding, respectively. Analysis of two constructed point-mutants confirmed the critical role of these two residues in the interaction between A. tumefaciens C58 and two host plants, tomato and tobacco plants. Using characteristics of the GABA-binding site, a subfamily of GABA-PBPs was identified in Proteobacteria of which most of them interact with eukaryotic hosts.This work also revealed a second PBP (GABA2) involved in the GABA uptake in A. tumefaciens. This PBP was identified by whole-genome sequencing and transcriptomic analysis of two spontaneous mutants, which derived from the atu2422 mutant. A mutant GABA2 was constructed to validate GABA2 involvement in the transport of GABA, degradation of QS signal, conjugal transfer of the plasmid Ti, and aggressiveness of A. tumefaciens. X-ray structure of GABA-liganded PBP GABA2 revealed key-residues required for GABA-binding. Their role in the GABA uptake has been confirmed by analysis of point mutations. A phylogenetic approach showed that all GABA2-related proteins exhibiting these key-residues were clustered in the same PBPs subfamily.This study has contributed to a better understanding of the A. tumefaciens-plant host interaction, and has permitted to determine two GABA binding modes for PBPs.

Les opines sont des molécules produites dans les cellules végétales transformées par l’ADN-T d’A. tumefaciens. Ces opines peuvent être utilisées comme nutriments par le phytopathogène et certaines d’entre elles agissent comme signaux moléculaires contrôlant la dissémination du plasmide de virulence Ti via la signalisation quorum-sensing. Le présent travail vise à une compréhension élargie du rôle des opines au cours des interactions A. tumefaciens-plantes hôtes. En se basant d’abord sur des analyses transcriptomiques, le régulon AccR d’A. tumefaciens C58, contrôlé par les opines agrocinopines, a été défini : celui-ci inclut des fonctions associées (i) à l’assimilation des agrocinopines, (ii) à l’assimilation de la nopaline, (iii) à la signalisation quorum-sensing et la conjugaison du plasmide Ti, (iv) à la conjugaison du plasmide At. La corrélation entre la co-régulation des conjugaisons des plasmides Ti et At et le co-transfert des deux réplicons a en outre été mise en évidence. Dans un second temps, associant des approches de génétique fonctionnelle à des travaux collaboratifs en biologie structurale, l’avantage sélectif conféré par les opines nopaline et octopine à A. tumefaciens au sein des tumeurs végétales a été quantifié. Les bases moléculaires sous-jacentes à cet avantage sélectif, notamment celles associées à la perception et l’importation des deux opines dans le cytoplasme bactérien, ont été décrites. Enfin, en combinant des approches de métabolomique et de génétique inverse avec des tests de conjugaison in planta, les effets opposés de la signalisation GABA d’une part et des signalisations opine et quorum-sensing d’autre part sur la dissémination du plasmide Ti ont été démontrés. En conclusion, nos résultats révèlent l’intrication des signalisations opine, quorum-sensing et GABA au cours de l’interaction A. tumefaciens-plantes hôtes. Ils soulignent en particulier les impacts de cette intrication sur la colonisation de l’hôte ainsi que sur la dissémination des gènes de virulence et d’adaptation à l’environnement tumeur portés par les plasmides Ti et At. / Opines are produced in plant cells transformed with the A. tumefaciens T-DNA. These opines can be used as nutrients by the phytopathogen and some of them act as signaling molecules controlling Ti plasmid dissemination through quorum-sensing. The present study aims at an enlarged understanding of the roles of opines during A. tumefaciens/plant host interactions. First, based on transcriptomic investigations, the agrocinopine-controled AccR regulon from A. tumefaciens C58 was thoroughly characterized. This one includes functions associated with (i) agrocinopines assimilation, (ii) nopaline assimilation, (iii) quorum-sensing and Ti plasmid conjugation, (iv) At plasmid conjugation. Moreover our analysis showed that co-regulation of Ti and At plasmid conjugations correlated with the co-transfer of the two replicons. In a second step using functional genetic and structural biology we quantified the selective advantage conferred to colonizing A. tumefaciens populations by the assimilation of the opines nopaline and octopine. The molecular basis which underlies this selective advantage, especially regarding the sensing and import of the two opines within the bacterial cytoplasm, were also described. Finally combining metabolomics and reverse genetic with in planta conjugation assays we demonstrated the opposite effects of GABA and opine/quorum-sensing signaling on the dissemination of Ti plasmids. In conclusion our results reveal the interlink between opine, quorum-sensing and GABA signaling during A. tumefaciens/plant host interactions. They noticeably highlight the impact of this interlink on host colonization and the dissemination of Ti and At plasmid genes which are critical for the virulence and the adaption of the bacteria to the tumor lifestyle.

L’acquisition du phosphate du milieu extracellulaire est un processus biologique primordial pour toute les cellules vivantes. Durant ce travail nous nous sommes intéressé à deux famille de phosphate-binding proteins, les protéines DING et DING-like. Les protéines DING sont des protéines ubiquitaires nommées ainsi en raison de leur extrémité N-terminal très conservée DINGGG-. Bien que largement représentées chez les bactéries, ces protéines ont été identifiées initialement chez l’homme en vertu de leurs propriétés biologiques ou leur implication dans les maladies, y compris dans l’inhibition du VIH. La présence chez l’homme de telles protéines soulève plusieurs questions quant à leur rôle lors de l’infection par ce virus. Nous avons entrepris une étude visant à quantifier ces protéines chez une population d’individus infectés par le VIH. Nos résultats montrent une augmentation surprenante de leur concentration chez ces derniers par rapport aux sujet sains. D’autre part, nos travaux sur les protéines DING nous ont amené à nous intéresser à la famille des DING-like, très proche de la famille des protéines DING. Inversement, les protéines DING-like sont exclusivement bactériennes. En plus de leur capacité à fixer le phosphate, certains membres de cette famille semblent jouir d’une activité phosphatase. Durant ce travail nous avons caractérisé structuralement et enzymatiquement deux représentants de ces protéines isolés à partir de Pseudomonas aeruginosa. L’analyse structurale de ces protéines ainsi de la caractérisation de leurs activités pourraient être d’un grand intérêt afin de comprendre leur rôle dans le schéma d’acquisition du phosphate chez cette bactérie. / Phosphate acquisition from the extracellular environment is a key process for all living cells. In bacteria, its importation is ensured, in part, by high affinity phosphate binding proteins (PBP). During this work, we are interested to two families of PBPs named DING and DING like proteins. DING proteins are ubiquitous proteins, so named due to their highly conserved N-terminal sequence DINGGG-. Although widely represented in bacteria, these proteins were initially identified in human by virtue of their biological properties or their involvement in diseases, including in HIV-inhibition. Currently, the anti-HIV activity has been shown for two human members of the DING family, HPBP and X-DING CD4. The presence in human of such proteins raises numerous questions about their role during HIV-infection. Thus, we undertook a study to evaluate their serum concentration in HIV-infected patients. Our results shows a surprising increase of the concentration of DING proteins in this population, compared to controls. On the other hand, our work on the DING proteins family led us to be interested on the family of DING-like proteins, closely related to the DING family. Unlike DING proteins, DING-like members were identified exclusively in bacteria. In addition to their ability to bind phosphate, some DING-like members appear to have a phosphatase activity. In this work we have characterize structurally and enzymatically two members of this family isolated from Pseudomonas aeruginosa. The structural analysis of these proteins combined with activities characterization could be of a great interest in order to understand their role in phosphate acquisition in this bacterium.

Undersökningens utgångspunkt ligger i interoperabiliteten mellan den svenska planeringsmodellen, PUT och den norska planeringsmodellen, PBP. Arbetet syftar till att undersöka om ett samarbete i en stab på taktisk nivå går att realisera, utan nämnvärd utbildning. Bakgrunden till arbetet ligger i grunden i propositionen ett användbart försvar där riktlinjerna visar på att svenska försvarsmakten ska verka och samarbeta med andra nationer och organisationer där fokus ligger på det nordiska samarbetet. Planering är den viktigaste faktorn vid all verksamhet och således en grundläggande faktor för ett väletablerat samarbete. Metoden som används i undersökningen är en teorikonsumerande metod, där en teori om interoperabilitet ska bidra till att analysera interoperabiliteten i modellerna. Genom teorin har variablar identifierats och blivit utgångspunkten för det empiriska materialet. Det empiriska materialet renderar i en jämförandeanalys mellan planeringsmodellerna som syftar till att svara på frågeställningarna i arbetet. Slutsatserna som dragits av undersökningen är att planeringsmodellerna inte är tillräckligt interoperabla med varandra för att i dagsläget realisera ett samarbete i en taktisk stab. Dock finns det en bra grund att stå på för ett vidare arbete mot en full interoperabilitet. Norge är sedan tidigare ett medlemsland i Nato och Sverige är med i partnerskap för fred. Det ligger i Sveriges intresse att även bli interoperabla med fler organisationer, således torde Sverige anpassa sig till den norska modellen, då den är influerad av Nato.

Agrobacterium tumefaciens est une bactérie du sol responsable de la galle du collet chez les plantes lorsqu'elle possède le plasmide Ti (Tumor inducing) dit de virulence (pTi). La bactérie transfère un morceau d’ADN du pTi dans le génome de la plante qui code d'une part la production d’hormones de plantes, à l’origine de la formation de tumeurs colonisées par les bactéries et d'autre part la production de petites molécules (opines) qui servent de nutriment à A. tumefaciens. L'opine, agrocinopine A induit la production de signaux quorum sensing à l’origine de la dissémination du plasmide de virulence vers des bactéries non pathogènes. Agrobacterium radiobacter K84, une bactérie non pathogène, produit de l’agrocine 84, un antibiotique qui tue A. tumefaciens.L’import et le catabolisme de l’agrocinopine A sont réalisés par l’opéron acc présent sur le pTi. La protéine périplasmique (PBP) AccA associée à un transporteur ABC importe l’opine dans le cytoplasme qui est ensuite dégradée par AccF et AccG. AccR régule l’expression de l’opéron acc et celle du facteur de transcription TraR, central dans la signalisation quorum sensing. AccA importe l’agrocine 84 qui est activée par AccF. Mon travail de doctorat a permis par des études structure-fonction de caractériser la spécificité d'AccA et d’AccF et d’initier l’étude du facteur de transcription AccR. L’étude structurale de la PBP en complexe avec l’agrocinopine A, l’agrocine 84 et des dérivés de ces molécules a révélé que seul le motif pyranose-2-phosphate commun aux 2 molécules était reconnu par AccA. Cela a été confirmé par microcalorimétrie et autofluorescence. Le motif pyranose-2-phosphate permettrait donc l’entrée de toute molécule qui le possède à une extrémité. La structure de l’enzyme AccF a montré que là encore seul le groupement pyranose-2-phosphate est reconnu. A partir de la structure obtenue et de modélisation du substrat dans le site actif, un mécanisme enzymatique original pour l’hydrolyse de la liaison phosphodiester est proposé. Les mesures d’affinité par microcalorimétrie montrent que seuls l’arabinose-2-phosphate et le glucose-2-phosphate sont capables de fixer AccR. Des expériences in cellulo ont confirmé qu'ils régulent bien l'expression du QS.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l’import et l'utilisation de l’agrocinopine chez A. tumefaciens. La spécificité de reconnaissance de la PBP pour une partie de la molécule importée est observée chez d’autres PBP, et ouvre la voie à la conception de molécules antibiotiques qui, à l’image de l’agrocine 84, utilisent une stratégie de type « cheval de Troie ». / Agrobacterium tumefaciens is a soil bacterium responsible of the crown gall in plants when it possesses the Tumor inducing plasmid (pTi) which is also the virulence plasmid. The bacterium transfers a piece of DNA from the pTi into the plant genome. The transferred DNA codes for plant hormone synthesis, leading to the formation of tumors which are colonized by bacteria, on one hand, and on the other hand, for the synthesis of small molecules (opines) that are used as nutrients by A. tumefaciens. The opine agrocinopine A induces the production of quorum sensing signals responsible for the spread of the virulence plasmid from pathogenic to nonpathogenic bacterium. Agrobacterium radiobacter K84, a nonpathogenic bacterium, produces the agrocin 84, an antibiotic that kills A. tumefaciens.Import and catabolism of agrocinopine A are operated by acc operon, present on the pTi. The periplasmic binding protein AccA (PBP AccA) associated with the ABC transporter imports the opine into the periplasm where it is degraded by AccF and AccG. AccR regulates the expression of the acc operon and that of the transcription factor TraR, central in quorum sensing signaling. AccA also imports agrocin 84, which is activated by AccF. My PhD work focused on AccA and AccF specificity through structure-function studies and I initiated the study of the transcription factor AccR. The structural study of AccA in complex with agrocinopine A, agrocin 84 and derivatives from these molecules revealed that only the pyranose-2-phosphate motif, common in these two molecules, was recognized. Microcalorimetry and autofluorescence measurements confirmed this conclusion. The pyranose-2-phosphate motif would allow any compound possessing this motif at one end to be transported. The structure of the enzyme AccF showed that again only the pyranose-2-phosphate group is recognized. From the structure and molecular modelling of the substrate in the active site, an original mechanism of the phosphodiester bond cleavage is proposed. Microcalorimetry affinity measures showed that only the arabinose-2-phosphate and glucose-2-phosphate are capable of interacting with AccR. In cellulo experiments confirm that both compounds regulate the expression of quorum sensing.My work sheds light on import and use of agrocinopine in A. tumefaciens. Recognition specificity of the PBP AccA for a part of the imported molecule is observed in other PBPs and opens new ways for rational design of antibiotic compounds that, similarly to agrocin 84, would use the “Trojan horse” strategy.

The periplasmic binding protein (PBP) superfamily is found throughout the genosphere of both prokaryotic and eukaryotic organisms. PBPs function as receptors in bacterial solute transport and chemotaxis systems; however the same fold is also used in transcriptional regulators, enzymes, and eukaryotic neurotransmitter receptors. This versatility has been exploited for structure-based computational protein design experiments where PBPs have been engineered to bind novel ligands and serve as biosensors for the detection of small-molecule ligands relevant to biomedical or defense-related interests. In order to further understand functional adaptation from a structural biology perspective, and to provide a set of robust starting points for engineering novel biosensors by structure-based design, I have characterized the ligand-binding properties and solved the structure of nine PBPs from various thermophilic bacteria. Analysis of these structures reveals a variety of mechanisms by which diverse function can be encoded in a common fold. It is observed that re-modeling of secondary structure elements (such as insertions, deletions, and loop movements), and re-decoration of amino acid side-chains are common diversification mechanisms in PBPs. Furthermore, the relationship between hinge-bending motion and ligand binding is critical to understanding the function of natural or engineered adaptations in PBPs. Three of these proteins were solved in both the presence and absence of ligand which allowed for the first time the observation and analysis of ligand-induced structural rearrangements in thermophilic PBPs. This work revealed that the magnitude and transduction of local and global ligand-induced motions are diverse throughout the PBP superfamily. Through the analysis of the open-to-closed transition, and the identification of natural structural adaptations in thermophilic members of the PBP superfamily, I reveal strategies which can be applied to computational protein design to significantly improve current strategies. / Dissertation

Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines.

Penicillin-binding proteins (PBPs) are required in the synthesis of the cell wall of bacteria. In Bacillus subtilis, PBPs play important roles in the life cycle, including both vegetative growth and sporulation, and contribute to the formation of the different structures of vegetative cell wall and spore cortex. The B. subtilis genome sequencing project revealed there were two uncharacterized genes, ykuA and yrrR, with extensive sequence similarity to class B PBPs. These two genes are renamed and referred to henceforth as pbpH and pbpI, respectively. A sequence alignment of the predicted product of pbpH against the microbial protein database demonstrated that the most similar protein in B. subtilis is PBP2A and in E. coli is PBP2. This suggested that PbpH belongs to a group of the genes required for maintaining the rod shape of the cell. Study of a pbpH-lacZ fusion showed that pbpH was expressed weakly during vegetative growth and the expression reached the highest level at the transition from exponential phase to stationary phase. The combination of a pbpA deletion and the pbpH deletion was lethal and double mutant strains lacking pbpH and pbpC or pbpI (also named yrrR) were viable. The viable mutants were indistinguishable from the wild-type except that the vegetative PG of the pbpC pbpH strain had a slightly slightly lower amount of disaccharide tetrapeptide with 1 amidation and higher amount of disaccharide tripeptide tetrapeptide with 2 amidations when compared to others strains. This suggests that PbpC (PBP3) is involved in vegetative PG synthesis but only affects the PG structure with a very low efficiency. A pbpA pbpH double mutant containing a xylose-regulated pbpH gene inserted into the chromosome at the amyE locus was constructed. Depletion of PbpH resulted in an arrest in cell growth and a dramatic morphological change in both vegetative cells and outgrowing spores. Vegetative cells lacking pbpA and pbpH expression swelled and cell elongation was arrested, leading to the formation of pleiomorphic spherical cells and eventual lysis. In these cells, cell septations were randomly localized, cell walls and septa were thicker than those seen in wild type cells, and the average cell width and volume were larger than those of cells expressing pbpA or pbpH. The vegetative PG had an increased abundance of one unidentified muropeptide. Spores produced by the pbpA pbpH double mutant were able to initiate germination but the transition of the oval-shaped spores to rod-shape cells was blocked. The outgrowing cells were spherical, gradually enlarged, and eventually lysed. Outgrowth of these spores in the presence of xylose led to the formation of helical cells. Thus, PbpH is apparently required for maintenance of cell shape, specifically for cell elongation. PbpH and PBP2a play a redundant role homologous to that of PBP2 in E. coli. A sequence alignment of the predicted product of pbpI against the microbial protein database demonstrated that the most similar protein in B. subtilis is SpoVD and in E. coli is PBP3. This suggested that PbpI belongs to the group of the genes required for synthesis of the spore or septum PG. PbpI was identified using radio-labeled penicillin and found to run underneath PBP4 on SDS-PAGE. PbpI is therefore renamed PBP4b. Study of a pbpI-lacZ fusion showed that pbpI was expressed predominantly during early sporulation. A putative sigma F recognition site is present in the region upstream of pbpI and studies using mutant strains lacking sporulation-specific sigma factors demonstrated that the expression of pbpI is mainly dependent on sigma factor F. A pbpI single mutant, a pbpI pbpG double mutant, and a pbpI pbpF double mutant were indistinguishable from the wild-type. The sporulation defect of a pbpI pbpF pbpG triple mutant was indistinguishable from that of a pbpF pbpG double mutant. Structure parameters of the forespore PG in a pbpI spoVD strain are similar to that of a spoVD strain. These results indicate that PBP4b plays a unknown redundant role. / Master of Science

Penicillin-binding proteins (PBP's) are membrane-associated enzymes involved in the polymerization of peptidoglycan. PBP's are divided into three classes based upon their molecular weights and functional domains. Gene expression is regulated in the two differentiated cells in Bacillus subtilis, the mother cell and the forespore, by coordinated expression of different sigma factors that recognize specific promoters in each compartment. The functional and compartmental specificity of individual penicillin-binding proteins from the different classes of PBP's were examined during sporulation in B. subtilis. Analyses of three class A high molecular weight PBP's indicated that pbpF and pbpG must be expressed in the forespore to carry out their specific role during spore peptidoglycan synthesis. Expressing pbpD in either the forespore or the mother cell could not complement for the loss of pbpF and pbpG, suggesting that there must be additional sequence information in PBP2c and PBP2d that allows them to carry out their specific role during germ cell wall synthesis. Analyses of a low molecular weight PBP, PBP5*, suggested that expressing dacB in either the mother cell or in the forespore could regulate the level of spore peptidoglycan cross-linking to what is typical of wild type spore peptidoglycan. / Master of Science

Les mécanismes d'adaptation d'Escherichia coli à une alternance quotidienne entre des conditions de croissance et de carence ont été étudiés grâce à une stratégie d'évolution expérimentale. Douze populations d'E. coli, dérivant d'un ancêtre commun, ont été propagées pendant plus de 40 000 générations par transferts journaliers dans un milieu minimum contenant une quantité limitante de glucose. L'évolution des 12 populations se caractérise par un degré important de parallélisme phénotypique (augmentation du fitness et du volume cellulaire, ...) et génétique, les mêmes gènes étant ciblés par la sélection naturelle dans la majorité des populations. Des mutations bénéfiques ciblant le gène spoT, acteur majeur de la réponse stringente permettant l'adaptation aux carences, avaient été identifiées dans 8 populations. Nous avons mis en évidence des mutations bénéfiques ciblant des gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi (pbpA-rodA) et la superhélicité de l'ADN (topA, fis). L'étude moléculaire de 2 mutations bénéfiques touchant l'opéron pbpA-rodA révèle qu'elles diminuent la quantité de protéine PBP2. L'analyse de 3 mutations ciblant le gène spoT montre qu'elles atténuent le contrôle stringent lors de l'entrée en phase stationnaire sans modifier les niveaux cellulaires de (p)ppGpp. Différentes mutations d'un même gène ayant les mêmes effets, l'évolution révèle un parallélisme moléculaire important. Près de la moitié des mutations bénéfiques affecte les réseaux de régulation globale de l'expression des gènes (spoT, fis, topA). La plasticité des réseaux de régulation globale joue donc un rôle primordial au cours de l'évolution et l'adaptation des bactéries.