<p> The present investigation was concerned with mitochondrial energy transfer reactions and their relationship to mitochondrial structural integrity. Experiments with azide demonstrated a close relationship between oxidative phosphorylation and large amplitude mitochondrial volume changes. Azide inhibited energy transfer and energy-linked mitochondrial swelling by competing with adenine nucleotide for a site on the terminal phosphorylating enzyme. As a permeant anion azide exerted secondary effects on mitochondrial structure and function.</p> <p> Experiments with mitochondria treated with phlorizin and phloretin emphasized the importance of Mg++ as a controlling factor in maintaining the integrity of mitochondrial energy transfer processes. The results indicated that these compounds interfered directly with oxidative phosphorylation, and that mitochondrial swelling was either a consequence of impaired energy transfer, or a separate phenomenon.</p> / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

NOTICE EN COURS DE TRAITEMENT / Les microARN (miARN) sont des courts ARN non codants qui régulent l'expression des gènes, au niveau post-transcriptionnel. Ces molécules d'environ 22 nucléotides de long s'associent aux protéines Argonautes (AGO) pour former un complexe appelé microRNA induced silencing complex (miRISC). Ensuite, les miARN recrutent le miRISC à des séquences partiellement complémentaires, dans les régions 3' non traduites d'ARN messagers (ARNm). Le miRISC peut ainsi réprimer la traduction d'ARNm spécifiques et souvent induire leur dégradation. Ce mécanisme est notamment important pour le développement animal et des défauts dans cette voie moléculaire sont liés à diverses pathologies chez l'humain. Des évidences récentes montrent que les interacteurs du miRISC et son mode d'action sur les ARNm peuvent diverger à différents moments du développement du nématode Caenorhabditis elegans. Nous avons donc posé l'hypothèse que des modifications post-traductionnelles pourraient expliquer certaines de ces différences moléculaires et fonctionnelles. Les objectifs de ce projet de recherche étaient donc d'identifier les événements de phosphorylation sur la protéine Argonaute ALG-1 de C. elegans et de déterminer leur fonction biologique au cours du développement animal. À cette fin, nous avons purifié la protéine Argonaute ALG-1 chez C. elegans avec un anticorps spécifique, ainsi que ses orthologues humains AGO 1-4, à partir de cellules humaines en culture. Nous avons déterminé par spectrométrie de masse les modifications post-traductionnelles sur ces protéines. En utilisant des méthodes de mutagenèse par édition du génome chez C. elegans, nous avons criblé l'importance de nombreux sites de phosphorylation en s'attardant aux phénotypes associés à la perte de fonction des miARN. Ceci nous a permis de mettre en évidence l'importance d'une région phosphorylable conservée de cinq résidus sérines/thréonine sur le domaine PIWI des Argonautes. La perte de phosphorylation de ALG-1, lorsque ces acides aminés sont mutés en alanines, produit des phénotypes développementaux beaucoup plus sévères que chez des animaux déplétés du gène alg-1. Au niveau moléculaire, nous avons montré, à partir de cellules humaines en culture, que l'hyperphosphorylation de ces acides aminés réduit l'association aux ARNm. De plus, nous avons montré que des mutants AGO2 qui ne sont pas en mesure de lier les miARN, ne sont pas hyperphosphorylés sur ces résidus dans les cellules humaines en culture. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la voie de miARN, dans lequel l'hyperphosphorylation du domaine PIWI de l'Argonaute permet la dissociation du miRISC de sa cible. Nous proposons donc que la phosphorylation de cette région permettrait au miRISC d'être recyclé et de réprimer l'expression d'autres ARNm après sa déphosphorylation. En second lieu, notre crible a permis d'identifier une sérine phosphorylable sur le domaine MID de ALG-1 qui régule l'association de la protéine aux miARN, lors du développement du nématode. Nous avons montré que lorsque cette sérine est mutée en glutamate (phospho-mimétique) ALG-1 perd son association aux miARN. Par ailleurs, les animaux qui portent cette mutation présentent des niveaux de miARN moins élevés que chez les animaux sauvages, ainsi qu'une accumulation de brins passagers qui sont issus des duplex de miARN et normalement dissociés par AGO. Nous avons ensuite identifié l'enzyme qui produit la phosphorylation de cette sérine. Avec des expériences de phosphorylation in vitro, nous avons montré que cette phosphorylation pourrait être induite par la protéine kinase A (PKA). De surcroît, nos expériences soutiennent que alg-1 et PKA interagissent génétiquement. Précisément, le mutant non phosphorylable alg-1(S642A) supprime des phénotypes développementaux observés lors de la perte de fonction de la sous-unité régulatrice de PKA, kin-2. En somme, ce projet de recherche a permis de mettre en évidence un mécanisme conservé au cours de l'évolution qui régule l'association du miRISC aux ARNm par la phosphorylation des Argonautes, ainsi qu'un mécanisme qui régule l'association de ALG-1 aux miARN chez C. elegans. Notre étude indique d'ailleurs que le miRISC serait possiblement inhibé à des moments précis lors du développement animal, par exemple lors de la phosphorylation par PKA. Les études futures des voies signalétiques qui activent PKA chez le nématode nous permettra de mieux comprendre la fonction biologique et le contexte cellulaire qui requerrait l'inactivation du miRISC. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of short non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotes. These molecules are ~22 nucleotides in length and associate with Argonaute proteins (AGO) to guide them to mRNAs that contain sequences with partial complementarity, commonly found in the 3' untranslated region (UTR). The interaction between the miRISC (miRNA induced silencing complex) and the mRNA inhibits protein synthesis and often leads to degradation of the transcripts. While the function and importance of this gene regulation pathway has been studied in plant and animal models, mechanisms that modulate the miRISC gene silencing efficiency in different biological settings are still poorly understood. The hypothesis of my research project conveys the idea that post-translational modifications of Argonaute proteins modulate gene silencing during animal development. To test this hypothesis, we aimed to identify phosphorylation events on the Argonaute ALG-1 in the nematode C. elegans and uncover how these modifications affect its function during animal development. We purified ALG-1 protein from C. elegans extracts with a specific antibody and human Argonautes AGO1-4 from human cell cultures. We identified phosphorylated Argonaute peptides using mass spectrometry analysis and then we screened which modification affected ALG-1 function using gene editing. This led to the discovery of a highly conserved serine/threonine phosphorylation cluster on the PIWI domain of the Argonaute that when mutated into non-phosphorylatable amino-acids (alanine) caused phenotypes that were more severe than the loss of alg-1 in C. elegans. Molecular analysis of these phosphorylation sites showed that they modulate association to miRNA targets. Specifically, when using phospho-mimicking mutations on human AGO2, we showed that the hyperphosphorylation of this cluster causes the Argonaute to lose interaction with mRNAs. Furthermore, we showed that AGO mutants that are deficient for miRNA binding do not undergo hyperphosporylation. These results revealed a new mechanism that regulate miRNA-mediated gene silencing by which unphosphorylated AGO binds miRNA targets and following hyperphosporylation the miRISC is released from mRNAs. We proposed that this mechanism could be used by cells to recycle the complex and permit multiple rounds of silencing by the miRISC after dephosphorylation. Our forward genetic screen of ALG-1 phosphorylation sites identified a serine on the MID domain that modulates association to miRNAs. We showed that phospho-mimicking mutation of ALG-1 at this position impaired the ability of ALG-1 to bind most miRNAs. Furthermore, we found that this mutation led to accumulation of passenger strands miRNAs in the total RNA. Since the passenger strands are not bound by the phospho-mimicking mutant, we suggested that they accumulate as duplexes which would render them refractory to degradation by single stranded nucleases. Last we showed that the protein kinase A (PKA) phosphorylates this residue in vitro and interacts genetically with alg-1. Altogether, this research project uncovered new mechanisms that regulate the miRNA pathway through the phosphorylation of the Argonaute proteins. Our study also suggests that ALG-1 is inhibited at specific timing by PKA during C. elegans development, and further study of the biological settings that require this inactivation will be crucial to understand its function.

Protein tyrosine kinase and phosphatase domains have binding specificities that depend on the amino acid sequence surrounding the target (phospho)tyrosine residue on their substrates. Although the preferred recognition motifs of many kinase and phosphatase domains have been characterized, we lack a quantitative description of sequence specificity that could guide predictions about signaling pathways or be used to design sequences for biomedical applications. Here, we present a platform that combines genetically-encoded peptide libraries and deep sequencing to profile sequence recognition by tyrosine kinases. We screened several tyrosine kinases against a million-peptide random library and used the resulting profiles to design high-activity sequences and predict phosphorylation efficiencies of substrates. We then screened several kinases against a library containing thousands of human proteome-derived peptides and their naturally-occurring variants. These screens recapitulated independently measured phosphorylation rates and revealed hundreds of phosphosite-proximal mutations that impact phosphosite recognition by tyrosine kinases. Finally, we have made progress towards extending this platform to the analysis of tyrosine phosphatase domains, by optimizing methods to produce tyrosine-phosphorylated bacterial display libraries and implementing methods to detect peptide dephosphorylation on the cell surface. Collectively, these experiments demonstrate the utility of our platform for rapid profiling of sequence specificity by tyrosine kinases and will shed new light on phosphotyrosine signaling.

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Thesis / Master of Science (MS)

Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017. / L’obésité et ses complications telles le diabète et la stéatose hépatique non alcoolique sont des enjeux de santé qui prennent de plus en plus d’ampleur partout sur la planète et la compréhension approfondie des mécanismes physiopathologiques impliqués est essentielle pour mieux contrer ces maladies. La protéine peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) est reconnue pour ses propriétés antiinflammatoires, insulino-sensibilisantes et pro-adipogéniques. Des résultats antérieurs ont démontré qu’en l’absence de la protéine tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase- 1 (Shp1), l’activité de PPARγ est augmentée. L’activation de PPARγ par ses agonistes, les thiazolidinediones (TZD), est favorable au contrôle du diabète, mais entraîne certains effets indésirables. Nos recherches ont porté sur l’investigation d’une nouvelle voie de régulation de PPARγ. Nous avons montré que Shp1 et PPARγ interagissent et que PPARγ est phosphorylé sur ses résidus tyrosine. Les résultats suggèrent que la déphosphorylation de PPARγ par Shp1 diminue son activité. Des analyses de modélisation moléculaire suggèrent que cette interaction entre Shp1 et PPARγ dépend de la présence de phosphorylation sur un acide aminé particulier, la tyrosine 355. Ce même résidu est aussi important dans la liaison avec la rosiglitazone, médicament de la classe des TZD. Des expériences de mutagénèse ont montré que l’absence de phosphorylation sur la tyrosine 355 diminue grandement l’activité de la protéine et, qu’à l’inverse, la présence de phosphorylation tend à augmenter son activité. Bien que plusieurs modifications post-traductionnelles aient été décrites dans la littérature, la phosphorylation sur tyrosine de PPARγ demeure très peu étudiée. Nos résultats suggèrent une nouvelle voie de régulation de PPARγ qui pourrait mener à l’élaboration de nouveaux ligands qui exploitent ce mécanisme afin de favoriser les propriétés bénéfiques de ce facteur transcriptionnel pour mieux traiter le diabète de type 2 et diminuer les risques d’effets secondaires. / Obesity and its complications such as type 2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease are becoming worldwide health concerns and more insights into the underlying physiopathological mechanisms are necessary to improve the treatment of these conditions. Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) protein is well known for its anti-inflammatory, insulin sensitizing and pro-adipogenic roles. Previous results showed that in absence of the protein tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Shp1), PPARγ activity is increased. PPARγ activation by thiazolidinediones (TZD) is used in the control of diabetes but is also linked to unwanted side effects. We investigated a new mechanism of regulation of PPARγ activity. We show that Shp1 and PPARγ interact and that PPARγ is tyrosine phosphorylated. Our results suggest that Shp1-mediated dephosphorylation of PPARγ reduces its activity. Molecular modeling analyses further suggest that the interaction between Shp1 and PPARγ depends upon the phosphorylation of one specific residue, tyrosine 355. This residue is also important for the binding with rosiglitazone, a member of the TZD drug class. Mutagenesis experiments showed that the absence of phosphorylation on tyrosine residue 355 decreases PPARγ activity, while its phosphorylation tends to increase it. Despite the fact that many post-translational modifications have been reported in the literature, tyrosine phosphorylation of PPARγ remains mostly unexplored. These results suggest a new PPARγ regulating mechanism that could be exploited to elaborate new PPARγ ligands to improve the treatment of type 2 diabetes and to limit side effects.

Living organisms rely on many different mechanisms to adapt to changes within their environment. Protein phosphorylation and dephosphorylation events are one such way cells can communicate to generate a response to environmental changes. In the Kennelly laboratory we hope to gain insight on phosphorylation events in the domain Archaea through the study of the acidothermophilic organism Sulfolobus solfataricus. Such findings may provide answers into evolutionary relationships and facilitate an understanding of phosphate transfer via proteins in more elaborate systems where pathway disturbances can lead to disease processes. A λ-phage expression library was generated from S. solfataricus genomic DNA. The immobilized expression products were probed with a purified protein kinase, SsoPK4, and radiolabeled ATP to identify potential native substrates. A protein fragment of the ORF sso0563, the catalytic A-type ATPase subunit A (AtpA), was phosphorylated by SsoPK4. Full length and truncated forms of AtpA were overexpressed in E. coli. Additional subunits of the ATPase were also overexpressed and ATPase activity reconstituted in vitro. Phosphoamino acid analysis and MS identified the phosphorylation sites on AtpA. Several variants of AtpA were derived via site-directed mutagenesis and assayed for ATPase activity. Chemical cross-linking was employed to determine possible ATPase subunit interactions; tryptic digests of AtpA and its mutant variants were performed to examine protein folding. The phosphorylated-mimic variant of AtpA, T98D, resulted in an inactive ATPase complex as determined by ATPase activity assays and native-PAGE indicating potential phosphoregulation by SsoPK4 on enzyme activity. Ultimately, any findings would need verification with in vivo studies. / Ph. D.