Nouvelles voies de modulation des canaux calciques de type T.Grâce à leur rôle dans l'excitabilité cellulaire et l'homéostasie calcique, les canaux calciques de type T participent à différentes fonctions physiologiques telles que le sommeil ou le contrôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle. Ils sont également impliqués dans certaines pathologies comme la douleur ou l'épilepsie. La régulation de l'activité des canaux de type T est encore mal connue et c'est l'enjeu de cette thèse. Dans une première partie, nous avons caractérisé l'effet de certains lipides endogènes sur ces canaux, en particulier les métabolites de l'acide arachidonique, et identifié le 5,6-EET comme un nouveau bloqueur des canaux de type T. Nous avons ensuite évalué l'existence d'un site de liaison des lipoamino acides sur les canaux de type T à l'aide d' d'expériences de compétitions réalisées avec un inhibiteur spécifique de ces canaux, la molécule TTA-A1.Dans une deuxième partie, nous avons étudié la régulation par le calcium des canaux de type T. Nous avons montré que l'entrée de calcium par les canaux T eux-mêmes ou par activation des récepteurs P2X4 et NMDA induisait une inhibition du courant de type T. Le calcium activerait une phosphatase qui provoquerait un déplacement de la courbe d'inactivation à l'état stable vers les potentiels négatifs, réduisant ainsi la disponibilité des canaux. Ce phénomène d'inhibition du courant lié à l'entrée du calcium pourrait être un mécanisme de rétrocontrôle négatif limitant l'entrée de calcium dans la cellule afin d'éviter une toxicité provoquée par une concentration de calcium intracellulaire trop élevée. Suite à cette inhibition, lorsque l'entrée de calcium est arrêtée, le courant augmente. Cette augmentation semble être due à l'intervention de la protéine kinase Pak qui rendrait les canaux de type T disponibles.En conclusion, nous avons identifié et caractérisé deux nouveaux mécanismes endogènes de régulation des canaux de type T : une modulation par les lipides, et une modulation par les calcium et la protéine kinase Pak. / New pathways of regulation of T-type calcium channels.Thanks to their role in cellular excitability and calcium homeostasis, T-type calcium channels are involved in several physiological functions such as sleep or control of cardiac rythmicity and vascular tone. They are also involved in some diseases such as pain or epilepsy. The regulation of T-type calcium channels is still poorly understood and that is the challenge of this thesis.In a first part of the study, we caracterised the effect of some endogenous lipids on these channels, particularly the metabolites of arachidonic acid, and identified the 5,6-EET as a new blocker of T-type channels. We then evaluated the existence of a binding site of lipoamino acids on T-type channels using binding experiments made with a specific inhibitor of these channels, the TTA-A1 molecule.In a second part, we studied the regulation of T-type channels by calcium. We showed that a calcium entry through T-type channels or through P2X4 and NMDA receptors activation induced an inhibition of T-type current. Calcium would activate a phosphatase which would trigger a shift of the steady-state inactivation curve toward negative potentials, reducing the availability of channels. This phenomenon of current inhibition due to calcium entry may be a feedback mechanism limiting calcium entry in the cell to avoid toxicity due to a too high intracellular calcium concentration. After this inhibition, when calcium entry is stopped, the current increases. This increase seems to be due to the intervention of the Pak protein kinase which would make T-type channels available again.In conclusion, we studied and caracterised tow new mechanisms of T-type channels regulation: a modulation by lipids, and a modulation by calcium and the Pak protein kinase.

La phosphorylation de protéines correspond à l’addition covalente d’un groupement phosphate (PO4 3-) par une protéine kinase sur un substrat. Cette réaction est réversible : la déphosphorylation est catalysée par des protéines phosphatases. Chez S. aureus, la sérine/thréonine kinase Stk1 phosphoryle des acides aminés sérines et thréonines et a été montrée impliquée dans la régulation de la virulence du pathogène : nous avons approfondi les connaissances sur ce mécanisme en identifiant trois nouveaux substrats et en étudiant les effets de la phosphorylation sur leur activité : - l’enzyme LuxS, responsable de la synthèse de l’AI-2 impliqué dans la communication intra bactérienne, voit son activité enzymatique drastiquement diminuée en étant phosphorylée par Stk1 sur un site thréonine unique (T14) ; - le régulateur CcpA, dont la fixation sur l’ADN module l’expression de nombreux gènes de virulence, est phosphorylée par Stk1 sur deux sites (T18 et T33) et cette phosphorylation diminue l’affinité de la protéine régulatrice CcpA pour l’ADN de ses gènes cibles ; - l’élément réponse du système à deux composants SaeR est phosphorylé sur deux sites thréonines (T87 et T192) de la région impliquée dans l’affinité de SaeR pour l’ADN. Les rôles de la kinase Stk1 sont donc multiples et liés à la régulation de la virulence de S. aureus. Les autres voies mettant en jeu la phosphorylation de protéines bactériennes, comme les systèmes à deux composants ou le système CcpA/HPr, sont couplées à cette phosphorylation par la sérine/thréonine kinase : ces résultats soulignent à la fois la diversité et la complexité de la régulation des mécanismes responsables de la virulence de S. aureus / Protein phosphorylation consists in the catalyzed addition of a phosphate group on a substrate. This reversible reaction is ensured by both kinase and phosphatase proteins. S. aureus is a human prokaryote pathogen and a part of its virulence is known to be regulated by the serine/threonine kinase Stk1, which phosphorylates serine or threonine residues of its substrates. We investigated the mechanisms of this virulence regulation and newly identified three substrates of Stk1: the quorumsensing LuxS protein, the catabolite carbon protein CcpA and the two components system response element SaeR. LuxS is phosphorylated on a unique threonine residue in position 14 and phosphorylation dramatically influences its enzymatic activity on AI-2 production. CcpA phosphorylation on two threonine residues in the DNA-binding region of the protein (T18 and T33) decreases the affinity of the protein for its targeted DNA sequences. Besides, Stk1 also phosphorylates the response element SaeR on two threonine residues (T87 and T192) in the DNAbinding region. Therefore Stk1 kinase plays numerous roles in S. aureus virulence regulation and the complexity of this regulation pattern increases when considering that three of the phosphorylation pathways in prokaryotes are crossed over: the two components system phosphorylation, the HPr/HPrK system and the serine/threonine kinase proteins phosphorylation. These results highlight the need to focus on Stk1 as a key element in the complexity of virulence regulation in S. aureus

La perception et l’adaptation à l’environnement sont des processus indispensables pour la survie des organismes vivants. Le champignon phytopathogène Botrytis cinerea peut ainsi percevoir différents types de signaux qu’ils soient chimiques ou physiques. La voie de signalisation de la MAPK Sak1 est impliquée dans l’adaptation au stress osmotique, oxydatif et pariétal, mais aussi dans la sporulation et le pouvoir pathogène en régulant la pénétration de la plante et le développement des nécroses. Afin d’approfondir les connaissances existantes sur la voie de Sak1, nous avons réalisé des études globales basées sur des techniques de protéomique et phosphoprotéomique. L’analyse de protéomique comparative entre la souche sauvage et les mutants de signalisation ∆bos1 et ∆sak1 a notamment mis en évidence que la MAPK Sak1 régule l’abondance de protéines impliquées dans la voie des protéines G et la voie calcique. Cette connexion avec les protéines G a été confirmée par une baisse de la concentration en AMPc chez le mutant ∆sak1. L’utilisation du fludioxonil comme signal de l’activation de la MAPK Sak1 pour l’analyse par phosphoprotéomique a mis en évidence des modifications de l’état de phosphorylation de protéines. Parmi ces protéines différentiellement phosphorylées, la présence de PKAR (sous-unité régulatrice de la protéine kinase A) et du facteur de transcription CRZ1, indiquent respectivement une action sur la voie via protéines G et la voie calcique, validant les résultats obtenus par protéomique. Le phosphoprotéome a révélé une « phosducin-like protein », PhnA. Sa caractérisation fonctionnelle montre son rôle dans l’adaptation aux stress, la sporulation et la germination, ainsi que dans le pouvoir pathogène mettant ainsi en évidence un nouveau facteur de pathogénicité chez B. cinerea. Notre étude a permis de révéler des interactions entre Sak1 et d’autres voies de signalisation non suspectées, agissant aussi bien sur la production de certains composants (régulations transcriptionnelles et traductionnelles) que sur la phosphorylation (modifications post-traductionnelles). Nos résultats constitueront la base de nouvelles recherches pour compléter nos connaissances sur ces interactions impliquant l’adaptation au stress et la pathogénie de B. cinerea. / Perception and adaptation to the environment are essential processes for the survival of living organisms. The phytopathogenic fungus Botrytis cinerea can thus perceive different types of signals, whether they are chemical or physical. The signalling pathway of the Sak1 MAPK is involved in the adaptation to osmotic, oxidative and cell wall stress, but also in sporulation and pathogenicity by regulating plant penetration and necrosis development. In order to deepen existing knowledge of the Sak1 pathway, we have carried out global studies based on proteomics and phosphoproteomics techniques. A comparative proteomics analysis between the wild type and the signalling mutants ∆bos1 and ∆sak1 showed, among others, that Sak1 regulates the abundance of proteins involved in the G-protein pathway and calcium pathway. This connection with G-proteins was confirmed by a decrease in cAMP concentration in the ∆sak1 mutant. Using fludioxonil as signal for the activation of Sak1 for a phosphoproteomic analysis revealed changes in the state of protein phosphorylation. Among these differentially phosphorylated proteins, the presence of PKAR (regulatory subunit of protein kinase A) and the transcription factor CRZ1, indicates an action on the G-protein and calcium pathway respectively, validating the results obtained by proteomics. Phosphoproteomics revealed a phosducin-like protein, PhnA. Its functional characterization reveals its role in stress adaptation, sporulation and germination, as well as in pathogenicity, thus demonstrating a new pathogenicity factor in B. cinerea. Our study revealed interactions between Sak1 and other unsuspected signalling pathways, affecting both the production of certain components (transcriptional and translational regulations) and phosphorylation (post-translational modifications). Our results will create the basis for new research questions to complement our understanding of these interactions involving adaptation to stress and pathogenesis of B. cinerea.

Les bactéries ont besoin d’adapter leur cycle cellulaire et leur taux de croissance aux changements environnementaux et nutritionnels. L’initiation de la réplication est ainsi strictement coordonnée aux autres processus cellulaire afin de transmettre un chromosome conforme. Chez B. subtilis, bactérie modèle des Gram⁺, la protéine YabA joue un rôle majeur en réprimant l’initiation de la réplication, ceci en formant un complexe avec la protéine initiatrice DnaA et la clamp polymérase DnaN. YabA interagit en outre avec d’autres protéines partenaires et serait donc multifonctionnelle. Sa structure 3D révèle une architecture en deux domaines: Un domaine N-terminal adoptant un repliement de type superhélice et un domaine C-terminal globulaire structuré autour d’un atome de Zinc. In vivo, YabA est un tétramère par interaction entre les superhélices, connecté aux domaines C-terminaux monomériques par une séquence déstructurée hyper flexible. YabA serait un hub structural interagissant simultanément avec plusieurs protéines et constituerait une plate-forme d’intégration entre différents signaux intracellulaires et l’initiation de la réplication. La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité de nombreuses protéines en réponse à certains signaux cellulaires. Grâce à des expériences de phosphorylation in vitro et des analyses de spectrométrie de masse, nous avons montré que YabA est phosphorylée par la kinase de type Hanks YabT sur une thréonine, localisée dans la région flexible de liaison interdomaines. YabT est une kinase activée par l’ADN, exprimée en carence en glucose, en sporulation et en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants phosphomimétique de YabA (yabA-T71D) et non phosphorylable (yabA-T71A) pour i) confirmer le rôle de T71 dans la phosphorylation et ii) réaliser des études fonctionnelles.Nous avons montré in vivo que la phosphorylation de YabA n’est pas impliquée dans l’initiation de la réplication, mais module des programmes de différenciation. La phosphorylation de YabA module inversement la sporulation et la formation de biofilm, ce qui souligne sa multifonctionnalité et son implication dans la signalisation cellulaire connectant l’initiation de la réplication et la différenciation. Nos résultats suggèrent que la phosphorylation YabT-dépendante de YabA affecte la différenciation en modulant le taux intracellulaire de Spo0A-P. En effet, la phosphorylation de YabA est corrélée à un taux élevé de Spo0A-P, ce qui stimule la sporulation et inhibe la formation de biofilm. Par ailleurs, nos expériences de chromatographie sur couche fine (TLC) et de “In-Gel” suggèrent que YabA possède une activité “ATP/GTPasique” atypique modulée par la phosphorylation de YabA sur T71. Nos analyses fonctionnelles révèlent un rôle potentiel de YabA sur des voies de signalisation dépendant du c-di-GMP, qui contrôle la formation du biofilm chez de nombreuses bactéries. Ces résultats suggèrent que YabA joue un rôle complexe pendant la différenciation en intégrant différentes voies de signalisation. Enfin, des analyses de LC-MS montrent que lorsqu’elle est surexprimée chez Escherichia coli, YabA est phosphorylée sur la tyrosine 90, qui appartient au domaine d’interaction C-terminal. Une étude double-hybride chez la levure montre que la phosphorylation de Y90 module l’interaction de YabA avec ses partenaires DnaA et DnaN. In vivo, la phosphorylation de Y90 module l’initiation de la réplication. La kinase impliquée n’a pas encore été identifiée, mais ces résultats suggèrent l’existence d’un contrôle de l’initiation de la réplication lié à la phosphorylation de YabA chez B. subtilis. En conclusion, l’ensemble de nos études suggèrent l’existence de différents niveaux de régulation de l’activité de YabA par phosphorylation sur thréonine et tyrosine. YabA, outre son rôle dans l’initiation de la réplication, joue un rôle majeur dans la différenciation de B. subtilis. / Upon environmental or nutritional changes, bacteria must adjust their cell cycle with their growth rate. Most particularly, DNA replication initiation events must be controlled and coordinated with cell physiology to ensure faithful chromosome inheritance. In Bacillus subtilis, a model of Gram-positive bacteria, YabA plays a major role in down regulating initiation replication through interaction with the initiator protein DnaA and the clamp polymerase DnaN. However, YabA is a structural hub protein able to interact with other protein partners, indicating it might be multifunctional. Through its unique overall tri-dimentional structure composed of N-terminal four helix-bundle tetramer connected to four monomeric C-terminal domains by a highly flexible linker, YabA is capable to physically interact with more than one protein at a time, thus providing a suitable platform to integrate intracellular signals to replication initiation. Phosphorylation is the most prevalent post translational modification that modulates protein activities in response to cellular signals. Using in vitro phosphorylation and mass spectrometry we demonstrated that YabA is phosphorylated by the Hanks-type serine/threonine kinase YabT at a threonine residue localized within the flexible inter-domain region. YabT is a kinase activated by DNA and up-regulated during glucose starvation, sporulation and stationary phase. We constructed YabA phosphomimetic (yab-AT71D) and non-phosohorylatable (yabA-T71A) mutants to (i) confirm the requirement of T71 for YabT-mediated phosphorylation in vitro and (ii) perform in vivo and in vitro functional studies.We show in vivo that the phosphorylation of YabA is not involved in initiation control, but rather modulates bacillus developmental processes. We found that YabA phosphorylation inversely regulates sporulation and biofilm formation highlighting the multifunctional role of YabA as well as its role in integrating physiological signals to connect chromosomal replication initiation control with cell development. Our results support a role of YabT-mediated phosphorylation of YabA in Bacillus subtilis life-style decision making through the modulation of Spo0A-P intracellular levels. We established that YabA phosphorylation correlates with high cellular levels of Spo0A-P, leading to sporulation stimulation and preventing biofilm formation. Additionally, thin layer chromatography (TLC) analysis and In-Gel assays showed that YabA possess an atypical "ATP / GTPase" activity. This unusual activity seems to be modulated by phosphorylation of the YabA T71 residue. Our functional analysis pointed to a potential role of YabA in the c-di-GMP signaling transduction pathway, known to regulate biofilm formation in many bacteria. This suggesting a complex regulatory role of YabA during development, involving signaling crosstalk. LC-MS analyzes showed that when overexpressed in Escherichia coli, YabA is phosphorylated on the residue Y90 in a YabT independent manner. Y90 belongs to the interaction C-terminal domain, which contacts DnaA and DnaN. We found that Y90 was involved YabA-mediated replication initiation control. We provided evidence that phosphorylation state of YabA at Y90 can potentially modulates a protein-interaction switch with its protein partners DnaA and DnaN in a yeast-two-hybrid-based assay. Although we did not identified a kinase responsible for the phosphorylation of YabA at Y90 in B. subtilis, this finding hint at the possibility of a YabA-mediated control of initiation modulated by phosphorylation in this bacteria. Thus, all of these in vitro and in vivo observations suggest the existence of different modes of regulation of YabA activity by phosphorylation, involving threonine and tyrosine residues. This study established that YabA, apart from its role during replication initiation, plays a key regulatory role in B. subtilis development.

Alors que les étapes du cycle du virus de la rage sont plutôt bien décrites, les interactions du virus avec la machinerie cellulaire restent mal connues. Le but de ce projet de thèse a été d’identifier et caractériser les voies de signalisation cellulaires impliquées dans le déroulement du cycle viral. Les kinases cellulaires jouent un rôle majeur dans la régulation de ces voies et certaines protéines rabiques ont déjà été décrites comme cibles de ces enzymes. Afin d’identifier les kinases impliquées dans le déroulement du cycle viral, nous avons réalisé un criblage d’une banque d’inhibiteur de kinases. L’analyse a été effectuée par cytométrie en flux dans des cellules infectées avec un virus rabique recombinant exprimant la protéine fluorescente GFP. Nous avons ainsi pu isoler deux inhibiteurs de kinases bloquant l’infection : La Tyrphostin 9,un inhibiteur de l’autophosphorylation du récepteur au PDGF (platelet-derived growth factor) (PDGF.R), et la Rottlerin, un inhibiteur de la PKCδ et découplant mitochondrial. Nous avons confirmé leur activité anti-virale dans différents types cellulaires (fibroblaste, glioblastome,neuroblastome et neurones primaires) et sur deux souches rabiques (CVS et SAD-B19). Par diverses approches expérimentales, nous avons identifié l’étape du cycle viral ciblée par chacun de ces inhibiteurs. Les résultats obtenus montrent que la Tyrphostin 9 perturbe une étape très précoce de l’infection : la fusion virale et plus particulièrement l’acidification endosomale. Nous avons observé que la Tyrphostin 9 provoquait également une désagrégation de l’appareil de Golgi. L’inhibition de l’acidification endosomale pourrait donc découler de cet effet. En présence de Rottlerin, le cycle viral est également inhibé au niveau d’une étape précoce : la réplication. A l’aide de siRNA, nous avons montré que cet effet de la Rottlerin est indépendant de la PKCδ. Les expériences réalisées avec un découplant mitochondrial bien caractérisé, le CCCP, tendent à montrer que l’effet de la Rottlerin est dû à sa fonction de découplant mitochondrial, qui induit une diminution du niveau d’ATP intracellulaire. Ce travail a permis d’identifier deux inhibiteurs de kinases inhibant des étapes précoces du cycle rabique. Les cibles cellulaires précisément impactées ainsi que l’effet sur le fonctionnement cellulaire lors de l’infection virale restent à déterminer. Des études in vivo pourraient valider leur utilisation en tant qu’agents antiviraux. / However the rabies viral cycle is fairly well described, the interactions with the cellular machinery are not. This thesis project aimed at identifying and characterizing the cellular signaling pathways involved in the establishment and progress of the viral cycle through the study of cellular kinases. Indeed, kinases are the main actors of these pathways and their effects on certain rabies proteins have already been reported. In order to identify kinases involved in the viral cycle, we screened a kinase inhibitor library for anti-viral activity using a recombinant rabies virus expressing the GFP fluorescent protein. This assay allowed us to isolate two kinase inhibitors that block rabies virus infection: Tyrphostin 9, an inhibitor of the receptor tyrosine kinase platelet-derived growth factor receptor (PDGF.R), and Rottlerin, a PKCδ inhibitor and mitochondrial uncoupler. We confirmed their anti-viral action in different cell types (fibroblast, glioblastoma, neuroblastoma, as well as primary neurons) and on different rabies strains (CVS and SAD-B19). Using various experimental approaches, we found that each inhibitor impairs an early stage of the viral cycle: the viral fusion and more specifically the endosomal acidification by Tyrphostin 9 and the viral replication step by Rottlerin. We observed that Tyrphostin 9 also caused disintegration of the Golgi apparatus. The inhibition of endosomal acidification could therefore result from this effect. Seeking for the mechanisms involved in Rottlerin’s effect, we evidenced that it is independent of PKCδ. Experiments with a well characterized mitochondrial uncoupler (CCCP), revealed that the Rottlerin anti-viral effect is rather due to its mitochondrial uncoupling function, which leads to a decrease of the cellular ATP level. This study allowed the identification of two kinase inhibitors with anti-viral effects acting on early stages of the rabies cycle. The cellular targets as well as the effect on the cellular functions during viral infection remain to be determined. In vivo studies could validate their use in therapeutics as anti-rabies agents.

La photorespiration est un processus essential chez tous les organismes photosynthétiques. Elle est déclenchée par l’activité oxygénase de la Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) menant à la production d’une molécule de 3-phosphoglycerate and une molécule de 2-phosphoglycolate (2PG). Le 2PG est toxique et sera recyclé par la photorespiration qui implique huit principales enzymes et prend place dans les chloroplastes, les peroxysomes, les mitochondries et le cytosol. Bien que la photorespiration aboutisse à une efficacité réduite de l’assimilation du CO₂ photosynthétique et soit considérée comme un processus inutile, le phénotype de croissance des mutants d’enzymes photorespiratoires (croissance réduite, chlorose) reflète l’importance de ce processus dans la croissance et le développement normal car il interagit avec plusieurs voies métaboliques primaires. Les données actuelles montrent que sept des huit principales enzymes photorespiratoires pourraient être phosphorylées et qu’ainsi la phosphorylation pourrait être un élément régulateur essentiel du cycle photorespiratoire. Afin de mieux comprendre la régulation du cycle photorespiratoire, nous avons étudié l’effet d’une phosphorylation/ absence de phosphorylation sur la sérine hydroxyméthyltransférase 1 mitochondriale (SHMT1) et de l’hydroxypyruvate réductase peroxisomale en utilisant des versions de ces enzymes mimant une phosphorylation (sérine ou la thréonine mutée en acide aspartique) ou une absence de phosphoryaltion (sérine ou thréonine mutée en alanine).Deux sites sont phosphorylés chez HPR1: S229 et T335. La mutation de ces sites montre que seule la version mimant une phosphorylation sur le site T335 (HPR1 T335D) entraîne une activité réduite de la protéine recombinante HPR1. Ce résultat a été confirmé in vivo puisque le mutant Arabidopsis hpr1 exprimant HPR1 T33D était incapable de totalement complémenter le phénotype photorespiratoire du mutant hpr1.Par complémentation du mutant d’Arabidopsis shm1-1 par une forme sauvage de SHMT1, d’une version mimant (S31D) ou non (S31A) une phosphorylation, les résultats ont montré que toutes les formes de SHMT1 pouvaient presque totalement complémenter le phénotype de croissance de shm1-1. Cependant, chaque ligne transgénique n'avait que 50% de l'activité de SHMT normale. En réponse à un stress dû au sel ou à la sécheresse, les lignées Compl-S31D ont montré un déficit de croissance plus accentué que les autres lignées transgéniques. Cette sensibilité au sel semble refléter les quantités réduites de protéines SHMT1-S31D ainsi qu’une activité plus faible ayant un impact sur le métabolisme des feuilles, entraînant une sous-accumulation de proline et une suraccumulation de polyamines. La mutation S31D de la protéine SHMT1 a également entraîné une réduction de la fermeture stomatique induite par le sel et l'ABA. Ainsi, nos résultats soulignent l’importance du maintien de l’activité du SHMT1 photorespiratoire dans des conditions de stress dû au sel et à la sécheresse et indiquent que la phosphorylation de SHMT1 S31 pourrait être impliquée dans la modulation de la stabilité de la protéine SHMT1. / Photorespiration is an essential process in oxygenic photosynthetic organisms, and it is triggered by the oxygenase activity of Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) to produce one molecular 3-phosphoglycerate and one molecular 2-phosphoglycolate. The toxic 2-PG is recycled by the photorespiratory pathway which includes eight core enzymes and takes place in chloroplasts, peroxisomes and metochondria and cytosol. Although the photorespiration leads to a reduced efficiency of the photosynthetic CO₂ assimilation and thereby is considered as a wasteful process, the growth phenotype of the photorespiratory enzymes can reflect the importance of this process in normal growth and development of air-grown plants. Normally, for most photorespiratory enzyme mutants, they exhibit small, chlorotic plants sometimes non-viable in air which are not observed when the mutants are grown under high CO₂ condition that limit the photorespiration by reducing the RuBisCO oxygenase activity. Photorespiratory cycle interacts with several major primary metabolic pathways, thus is a highly regulated and extensive works. Current data show that seven of eight core photorespiratory enzymes could be phosphorylated and the protein phosphorylation seems to be a critical regulatory component of the photorespiratory cycle. In order to better understand the regulation of the photorespiratory cycle, we explored the effect of SHMT1 and HPR1 phosphorylation/non-phosphorylation events on plant physiology and metabolism by several methods: Site-directed mutagenesis assay, complementation assay, activity assay, stomatal aperture assays, plant salt/drought resistance assays, metabolites measurement, gas exchange measurement. The results show the phosphorylation mimicking version of HPR1 at T335 results to a less HPR1 activity and retarded growth at the ambient air condition. For the phosphorylation mimicking version of SHMT1 at S31 resulted in a less stability leading to a reduced resistance to drought and salt stress. The decline of resistance against abiotic stress was mainly due to impairment in the closure of stomata which were unable to respond properly to ABA probably because of a default in the PLC pathway. So there results indicate that the phosphorylation of SHTM1 leads to a negative effect for the plant growth especially under stress condition. Thus, we propose that the SHMT1 can be phosphorylated at a basic level under normal growth conditions, once the photorespiratory flux is increased such under salt stress condition, the SHMT1 should be dephosphorylated to stabilize SHMT1 and sustain a high photorespiration flux to cope with reduced CO₂ availability.

Le médulloblastome est la plus fréquente des tumeurs pédiatriques malignes du cerveau et est divisé en quatre sous-groupes moléculaires. Le groupe Sonic Hedgehog (SHH), caractérisé par l’activation de la voie SHH, présente une surexpression du facteur de transcription basique hélice-boucle-hélice Atoh1. Atoh1 est essentiel pour le développement du cervelet et plus spécifiquement pour la formation des précurseurs des cellules granulaires, qui sont aussi la cellule d’origine du médulloblastome SHH. Dans le médulloblastome SHH, Atoh1 agit comme un facteur pro-tumoral en collaboration avec la voie SHH. De plus, l’inhibition des niveaux protéiques d’Atoh1 inhibe la prolifération tumorale in vitro et in vivo. Etant donnée l’importance de la protéine Atoh1 dans la formation du médulloblastome SHH, Atoh1 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour traiter le médulloblastome SHH. Cependant, les mécanismes de régulation d’Atoh1 sont encore mal connus.Les modifications post-traductionnelles sont connues pour réguler les niveaux protéiques dans les cellules. Plusieurs types de modifications régulent la dégradation protéique et elles incluent l’ubiquitination et la phosphorylation. Nous avons décidé de nous concentrer dans un premier temps sur le rôle potentiel de la phosphorylation d’Atoh1 sur sa fonction et régulation durant le développement du cervelet et la formation de médulloblastome.Par une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié douze sites de phosphorylation sur la protéine Atoh1. Parmi ces douze sites, seulement deux, la sérine 328 (S328) et la sérine 339 (S339), sont importantes pour la stabilité et la fonction de la protéine. En effet, les deux mutants de phosphorylation spécifiques de ces deux sites, Atoh1-S328A et Atoh1-S339A, ont une demi-vie plus longue ainsi qu’une activité transcriptionnelle augmentée dans les précurseurs des cellules granulaires par rapport à la forme sauvage d’Atoh1. Nous avons ensuite réalisé une purification d’affinité en tandem différentielle suivie par une analyse par la technologie d’identification protéique multidimensionnelle (MudPIT) pour définir les partenaires phospho-spécifiques d’Atoh1. Nous avons découvert que l’ubiquitine ligase E3 Huwe1 est responsable de la dégradation d’Atoh1 de manière phospho-dépendante dans les progéniteurs des cellules granulaires. Nous avons aussi montré que SHH protège Atoh1 de la dégradation médiée par Huwe1 par l’intermédiaire des phosphatases de la famille des PP2A. De manière importante, ce mécanisme de régulation d’Atoh1 est nécessaire au bon développement du cervelet. De plus, dans le contexte tumoral, un faible niveau d’ARNm d’HUWE1 est associé à une mauvaise survie chez les patients ayant un medulloblastome SHH.Au vu de ces résultats, nous souhaitons étudier plus en détail le rôle de la phosphorylation d’Atoh1 ainsi que la contribution de ce nouveau mécanisme dans le médulloblastome. Nous souhaiterions ainsi exploiter nos résultats pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le médulloblastome SHH. / Medulloblastoma (MB) is the most common pediatric malignant brain tumor and is divided in four subgroups by gene profiling. The well-known subgroup harboring an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway shows an upregulation of the proneural basic helix-loop-helix transcription factor Atoh1. Atoh1 is essential for cerebellum development and more specifically for the formation of the granule neuronal progenitors (GNPs), which are the cells of origin of SHH induced MB. In tumoral context, Atoh1 acts as a pro-tumor factor in cooperation with SHH pathway. In addition, the inhibition of Atoh1 protein level prevents MB proliferation in vitro and in vivo. Thus, given the strong implication of Atoh1 protein in MB formation, Atoh1 seems to be a potential therapeutic target to treat SHH MB. However, up to date, mechanisms underlying its regulation remain to be elucidated. Posttranslational modifications are known to regulate protein levels in cells. Several modifications regulate protein turnover including the two most prominent, ubiquitination and phosphorylation. We decided to focus primarily our study on a potential role of Atoh1’s phosphorylation on its function and regulation both during cerebellar development and MB genesis. Using mass spectrometry analysis, we identified twelve phosphorylation sites on Atoh1 protein. Among them, only two, the serine 328 (S328) and serine 339 (S339), were critical for Atoh1 stability and function. The two single phospho-deficient mutants, Atoh1-S328A and Atoh1-S339A, displayed a longer half-life and increased transcriptional activity in granule neuron progenitors when compared to the wild-type form of Atoh1. Next, we employed differential tandem affinity purification followed by Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) analysis to define Atoh1 phospho-specific partners. We uncovered that the E3 ubiquitin ligase Huwe1 is responsible for Atoh1 degradation in a phospho-dependent manner in granule neuron progenitors. We also discovered that SHH protects Atoh1 against its degradation mediated by Huwe1 through the phosphatases of PP2A family. Importantly, this machinery is required for proper cerebellar development and we highlighted that low levels of HUWE1 are associated with a poor prognosis in patient harboring a SHH medulloblastoma.Given this data, we wish to dissect the role of Atoh1 phosphorylation, and the contribution of this new pathway in MB. We anticipate exploiting our findings to develop new therapeutic strategies in SHH MB.

La photosynthèse oxygénique fournit l’énergie pour presque toutes les formes de vie sur Terre. Les premières étapes sont réalisées par quatre complexes membranaires. Deux sont des photosystèmes (PS) divisés en un core et une antenne qui, chez les plantes, est composée des protéines Lhca et Lhcb respectivement pour le PSI et le PSII. Les Lhcb les plus abondantes forment les hétérotrimères LHCII. Pour optimiser leur croissance, les organismes photosynthétiques doivent réguler précisément l’absorption de la lumière. Dans cette thèse, nous nous sommes focalisés sur un de ces mécanismes chez Arabidopsis thaliana : les transitions d’état. Cette régulation intervient en lumière faible ou fluctuante pour répondre à un déséquilibre d’excitation des photosystèmes. Elle implique la phosphorylation de Lhcb1 et Lhcb2, deux des isoformes composant le LHCII, et leur déplacement du PSII au core du PSI où elles agissent comme antenne. Récemment, l’attachement d’un LHCII additionnel à l’antenne du PSI a été rapporté, sans indice sur le rôle de la phosphorylation dans la liaison. Nous nous sommes attachés à quantifier la phosphorylation du LHCII dans les supercomplexes PSI et PSII et à déterminer les rôles respectifs de Lhcb1 et Lhcb2 dans les transitions d’état. Nous avons établi que la phosphorylation d’un seul Lhcb2 est suffisante pour l’attachement d’un LHCII au core du PSI. Nous avons ensuite isolé un complexe PSI-LHCII2 et déterminé que la liaison du second LHCII implique aussi la phosphorylation d’un seul Lhcb2. Ce travail apporte de nouvelles preuves des rôles divergents des isoformes Lhcb dans la régulation de la photosynthèse, qui sont discutées ici à la lumière de leur évolution. / Oxygenic photosynthesis directly or indirectly provides energy for almost all forms of life on earth. The first steps are performed by four membrane complexes. Two of them are photosystems (PS) organized in a core complex and an antenna system, which is composed in green organisms by Lhca and Lhcb proteins for PSI and PSII, respectively. The most abundant Lhcb proteins form the LHCII heterotrimers. To optimize growth, photosynthetic organisms have to precisely regulate their light harvesting. In this thesis, we focused on one of these mechanisms in Arabidopsis thaliana: state transitions. This regulation occurs in low or fluctuating light to answer for the imbalance of excitation between photosystems. It involves the phosphorylation of Lhcb1 and Lhcb2, two of the isoforms composing LHCII. The phosphorylated LHCII trimers detach from PSII and bind to PSI core and act as an antenna for it. Recently the attachment of additional LHCII trimers to PSI on its antenna side has been reported, with no clue of the role of phosphorylation in this binding. We set on quantifying the LHCII phosphorylation of purified PSI and PSII supercomplexes to determine the respective roles of the Lhcb1 and Lhcb2 isoforms in state transitions. We established that the phosphorylation of a single Lhcb2 protein is sufficient for the binding of PSI core. We then isolated a PSI-LHCII2 supercomplex, and determined that the binding of the additional trimer also involves the phosphorylation of a single Lhcb2 isoform per trimer. This work brings new evidences for the divergent roles of the Lhcb isoforms in light harvesting and its regulation, which are discussed here in the light of their evolution.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Excitotoxicity, a major hallmark of neurodegeneration associated with cerebral ischemia, is a result of accumulation of extracellular glutamate. This excess glutamate leads to hyperactivation of glutamate receptors such as the N-methyl-D-asparate (NMDA) receptors (NMDARs) following the activation of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor (AMPARs). Excessive activation of NMDARs causes an influx of calcium, which can eventually activate apoptotic pathways and lead to death of neurons. Regulation of NMDAR subunit composition, localization, surface expression, and activity can balance cell survival via activation of either pro-death or pro-survival pathways after a course of an ischemic insult. Specifically, phosphorylation of different NMDAR subunits defines their activity and downstream signaling pathways. NMDARs are phosphorylated by multiple kinases and dephosphorylated by different phosphatases. Besides phosphatases and kinases, per se, phosphorylation of synaptic proteins that regulate kinase or phosphatase targeting and activity also mediate NMDAR phosphorylation. Spinophilin, a major synaptic scaffolding and protein phosphatase 1 (PP1) targeting protein, mediates substrate phosphorylation via its ability to bind PP1. Our studies focus on delineating the role of spinophilin in the regulation of phosphorylation and function of the GluN2B subunit of the NMDA receptor as well as the role of spinophilin in modulating glutamate-induced neurotoxicity. Interestingly, our data demonstrate that spinophilin sequesters PP1 away from GluN2B thereby enhancing phosphorylation of GluN2B at Ser-1284. These changes impact GluN2B protein interactions, subcellular localization, and surface expression, leading to alterations in the amount of calcium entering the neuron via GluN2B-containing NMDARs. Our data show that spinophilin biphasically regulates GluN2B function. Specifically, Ser-1284 phosphorylation enhances calcium influx through GluN2B containing NMDA receptors, but spinophilin leads to dramatic decreases in the surface expression of the receptor independent of Ser-1284 phosphorylation. Moreover, in spinophilin knockout mice, we observe less PP1 binding to GluN2B and less phosphorylation of Ser-1284, but more surface expression of GluN2B and greater levels of caspase activity. Together, these observations suggest a potential neuroprotective role for spinophilin by decreasing GluN2B-containing NMDA receptor-dependent surface expression and thereby decreasing intracellular calcium and neuronal cell death.

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