Les hélicases sont des protéines qui utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP ou du GTP pour catalyser la disjonction des doubles hélices d'ADN ou d'ARN. Cette activité de déroulement de double brin leur confère un rôle essentiel dans le métabolisme des acides nucléiques, le maintien de la stabilité du génome et les processus de signalisation cellulaire. En conséquence, ils sont impliqués dans des processus aussi divers que le vieillissement, l'apparition de cancers, l'immunité innée. Cette thèse est axée sur la compréhension de la fonction et des mécanismes moléculaires de deux hélicases différentes et le manuscrit est donc divisé en deux parties. Le premier est dédié à l'hélicase RIG-I, une hélicase à ARN, exprimée lorsque les cellules leucémiques cessent de proliférer et sont induites à se différencier en granulocytes, indispensables à la reconnaissance de l'ARN double brin des virus, initiant la protection des cellules contre la réplication des génomes viraux. Le mécanisme d'action de RIG-I est bien décrit dans le contexte d'une infection virale. Mais dans le cas de la différenciation des cellules myéloïdes, l'intervention de RIG-I et son rôle dans la balance la prolifération / différenciation restent incomplets. En effet, les interactions RIG-I en particulier avec les ligands cellulaires ne sont pas totalement comprises. La première partie de mon travail consistait à tenter d'isoler et de caractériser les partenaires de RIG-I lors de la différenciation des cellules leucémiques NB4. La seconde est consacrée à l'étude des mécanismes sous-jacents aux G-quadruplexes résolus par les hélicases. Plusieurs questions subsistent quant aux interactions entre la structure particulière des G-quadruplexes et ces enzymes. Une hélicase de Bacteroides sp 3_1_23, BsPif1, a été choisie pour comparer et caractériser l'interaction entre les G-quadruplexes et l'ADN canonique de Watson-Crick. Dans les deux parties du travail, les interactions ont été étudiées par des techniques biochimiques utilisant soit une lignée cellulaire ou une protéine purifiée et des acides nucléiques synthétiques. / Helicases are proteins that utilize the energy provided by the hydrolysis of ATP or GTP to catalyse the disjunction of double DNA or RNA helices. This double strand unwinding activity gives them an essential role in the metabolism of nucleic acids, the maintenance of the genome stability and cell signalling processes. As a result, they are involved in processes as diverse as aging, the appearance of cancers, innate immunity. This thesis is focused on the understanding of the function and the molecular mechanisms of two different helicases and the manuscript is therefore divided in two parts. The first one is dedicated to the RIG-I helicase, an RNA helicase, expressed when leukemic cells stop proliferate and are induced to differentiate in granulocytes, which are essential in the recognition of double-stranded RNA of viruses, initiating the protection of the cells against the replication of the viral genomes. The mechanism of action of RIG-I is well described in the context of viral infection. But in the case of the differentiation of myeloid cells, the intervention of RIG-I and its influence on the equilibrium proliferation / differentiation remains incomplete. Indeed, RIG-I interactions in particular with cellular ligands are not fully understood. The first part of my work consisted in an attempt to isolate and characterize RIG-I partners during differentiation of NB4 leukemic cells. The second one is devoted to the study of mechanisms underlying G-quadruplexes resolving by helicases. Several questions remain about the interactions between the particular structure of G-quadruplexes and these enzymes. A Bacteroides sp 3_1_23 helicase, BsPif1, was chosen to compare and characterize the interaction between G-quadruplexes and canonical Watson-Crick DNA. In the two parts of the work, the interactions were investigated by biochemical techniques using either a cell line or purified protein and synthetic nucleic acids.

Plants modulate their growth and development according to the prevailing light conditions. To detect light signals plants have an array of photoreceptors including the phytochromes which monitor the red and far-red light regions of the light spectrum. Phytochromes regulate gene expression in response to light in part by physically interacting with nuclear-localized bHLH transcription factors called PHYTOCHROME INTERACTING FACTORS (PIFs). PIFs are known to function as negative regulators of photomorphogenesis. Here we show that PIF1, the PIF family member with the highest affinity for phys, is degraded after pulses or continuous red, far-red or blue light in a phytochrome dependent manner. In etiolated seedlings, phyA plays a dominant role in regulating the degradation of PIF1 after a pulse of red, far-red or blue light; while phyB, phyD and other phys also influence PIF1 degradation after prolonged illumination. PIF1 interacted with phyA and phyB in a blue light-dependent manner, and the interactions with phys are necessary for the light-induced degradation of PIF1. In response to red, far-red or blue light treatments PIF1 is rapidly phosphorylated, poly-ubiquitinated and degraded via the ubiquitin/26S proteasomal pathway. In addition, we show that PIF1 negatively regulates photomorphogenesis at the seedling stage. The overexpression of a light-stable truncated form of PIF1 causes constitutively photomorphogenic phenotypes in the dark. pif1 seedlings displayed more open cotyledons and slightly reduced hypocotyl length compared to wild type under diurnal (12h light/12h dark) blue light conditions. Double mutant analyses demonstrated that pif1phyA, pif1phyB, pif1cry1 and pif1cry2 have enhanced cotyledon opening compared to the single photoreceptor mutants under diurnal blue light conditions. Taken together, these data suggest that PIF1 functions as a negative regulator of photomorphogenesis and that light-activated phys induce the degradation of PIF1 through the ubi/26S proteasomal pathway to promote photomorphogenesis. / text

Différents rôles de l'hélicase Pif1 ont été décrit dont le plus documenté est de décrocher la télomérase des télomères en déroulant les hybrides ARN/ADN formés entre l'ARN de la télomérase et l'ADN télomérique. Plus récemment, une nouvelle voie de signalisation des dommages à l'ADN a été mise en évidence, qui inhibe l'action de la télomérase au niveau d'une cassure de l'ADN via la phosphorylation de l'hélicase Pif1. Cette phosphorylation, dépendante de la kinase ATR (Mec1), inhibe la réparation aberrante de la cassure d'ADN par la télomérase. Nous étudions au sein de l’équipe la protéine RPA (Replication Protein A), affine de l'ADN simple-brin, qui recrute à la fois la protéine de recombinaison homologue Rad52 et la protéine Mec1 impliquée dans la cascade de signalisation des dommages de l'ADN. Lors de l'étude de différentes fonctions de l'hélicase Pif1, j'ai mis en évidence une interaction robuste entre Pif1 et RPA. J'ai identifié un allèle de RFA1, rfa1-D228Y, affectant l'interaction Pif1/RPA et montré, grâce à cet allèle, que cette interaction est impliquée dans le recrutement de Pif1 au niveau d'une cassure double-brins (CDB) induite de l'ADN. Enfin, il a été récemment mis en évidence un nouveau rôle de Pif1 dans la stabilité des G-Quadruplexes durant la réplication du brin avancé. En effet, les cellules pif1 présentent un taux d'instabilité du minisatellite CEB1 inséré sur le brin avancé d'environ 56%, correspondant à des réarrangements de l'ADN de type contractions ou expansions. Lors de l'étude de l'interaction Pif1/RPA, j'ai montré que la mutation rfa1-D228Y entraîne une instabilité du minisatellite CEB1 présent sur le brin avancé, similaire à celle observée avec la délétion pif1∆. Nous suggérons un modèle selon lequel RPA recruterait Pif1 au cours de différents processus cellulaires tels que la réponse des dommages à l'ADN ou la réplication des structures particulières de l'ADN telles que les G-Quadruplexes.En parallèle de cette étude, j’ai étudié le rôle de l'histone méthyltransférase Set1 spécifique de la lysine 4 de l'histone H3 dans la régulation de la taille des télomères. J’ai mis en évidence que le raccourcissement des télomères observé dans un mutant set1 est lié à l'absence de di- et tri-méthylation de H3K4 alors que la perte de monométhylation n'a aucun effet. Cependant, le défaut de la taille des télomères dans les cellules set1∆ n'est pas uniquement lié au défaut de méthylation de H3K4 mais semble impliquer une autre activité de Set1 qu’il reste à déterminer. Etonnamment, nous avons observé que la délétion de SET1 aggrave le raccourcissement des télomères des mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation positive de la taille des télomères et inversement, aggrave le rallongement des télomères de mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation négative des télomères. Nous postulons que l’inactivation de Set1 pourrait à la fois inhiber l’activation précoce des origines de réplication des régions subtélomériques et conduire à un sur-raccourcissement de la taille des télomères, à la fois affecter la synthèse du brin complémentaire dans un contexte où celle-ci est affectée (mutant rif1) et conduire à un sur-allongement des télomères. Une seconde hypothèse propose que Set1 régulerait la transcription deTERRA dans des cellules ayant les télomères déprotégés (mutant rif) entraînant le sur-allongement des télomères. / Different roles of Pif1 helicase have been described, the best documented being to remove telomerase from telomeres by unwinding the RNA/DNA hybrid between telomerase RNA and telomeric DNA. Recently, it was shown that the DNA damage signaling down-regulates telomerase action at a DNA break via Pif1 phosphorylation. Pif1 phosphorylation is dependent of the checkpoint kinase ATR (Mec1) and prevents the aberrant healing of broken DNA ends by telomerase. In our laboratory, we study RPA (Replication Protein A), a single-strand DNA binding protein which recruits the proteins involved in the DNA damage response and checkpoint regulation, such as the homologous recombination protein Rad52 and Mec1 involved in the DNA damage response. I have identified an allele of RFA1, rfa1-D228Y, that affects the Pif1/RPA interaction and showed using this allele that this interaction is implicated in the Pif1 recruitment at an induced double-strand break. Recently, a new role of Pif1 in the stability of G-quadruplex DNA during the leading strand replication has been described. pif1 cells show an instability about 56% of the human minisatellite CEB1 inserted on the leading strand. During my study of the Pif1/RPA interaction, I showed that the rfa1-D228Y mutant induced a similar instability of CEB1 minisatellite on the leading strand. We suggested that RPA would recruit Pif1 for many cellular processes such as DNA damage response or replication of secondary DNA structures such as G-Quadruplexes.In parallel, I have studied the role of the Set1 Histone methyltransferase which catalyse the methylation of the lysine 4 of histone H3, in the regulation of telomere length. I showed that the telomere shortening observed in set1 mutant is due to the loss of di- and tri-methylation of H3K4 while the loss of monomethylation has no effect. However, the short telomeres in set1∆ cells is not only due to the methylation defect shedding light on a new Set1 activity that remains to be fully characterized.. The SET1 deletion aggravates the telomere shortening of mutants which genes are involved in positive regulation of telomere length and conversely, aggravates the lengthening of mutants which genes are involved in negative regulation of telomere length. We postulated that inactivation of Set1 could affect at once activation of early-replication origins and leads to a telomere shortening, and affect synthesis of complementary strand in a context where this one is affected (mutant rif1) and leads to a telomere lengthening. A second hypothesis propose that Set1 would regulate TERRA transcription in cells with deprotected-telomere (rif mutant) leading to the lengthening of telomeres.

Les G-quadruplexes sont des structures à quatre brins formées spontanément par certains acides nucléiques riches en guanines dans des conditions physiologiques in vitro et qui présentent une grande variété de conformations. Ma thèse a consisté à montrer qu'ils se formaient in vivo et à étudier les conséquences pathologiques de leur persistance. Le système expérimental utilisé au cours de ma thèse repose sur la mesure de la stabilité de séquences répétées en tandem humaines de type minisatellite chez S. cerevisiae en croissance mitotique. Le motif unitaire du minisatellite CEB1 forme un G-quadruplexe, efficacement déroulé par l'hélicase Pif1 in vitro. Dans un mutant déficient pour l'hélicase Pif1, CEB1 est fréquemment réarrangé (expansion ou contraction). J'ai dans un premier temps participé à montrer que cette instabilité de CEB1 dépendait de ses motifs G-quadruplexes, par mutagénèse dirigée. J'ai confirmé ce résultat par une seconde approche, en traitant des cellules sauvages avec un ligand spécifique des G-quadruplexes. Ce ligand induit spécifiquement l'instabilité du minisatellite CEB1, mais n'a pas d'effet sur le minisatellite CEB1 muté. Ces outils expérimentaux m'ont ensuite permis, en collaboration avec J. Lopes, de montrer que l'instabilité du minisatellite survient durant la réplication, lorsque les G-quadruplexes sont formés sur la matrice du brin à synthèse continue. Cette capacité à former des G-quadruplexes, entre autres propriétés des minisatellites riches en GC, induit la formation de grands réarrangements chromosomiques. Le dernier volet de ma thèse a consisté en l'étude de la relation structure-fonction des G-quadruplexes à l'instabilité génomique

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Accurate DNA replication is vital for maintaining genomic stability. Consequently, the machinery required to drive this process is designed to ensure the meticulous maintenance of information. However, random misincorporation of errors reduce the fidelity of the DNA and lead to pre-mature aging and age-related disorders such as cancer and neurodegenerative diseases. Some of the incorporated errors are the result of the error prone DNA polymerase alpha (Pol α), which initiates synthesis on both the leading and lagging strand. Lagging strand synthesis acquires an increased number of polymerase α tracks because of the number of Okazaki fragments synthesized per round of the cell cycle (~50 million in mammalian cells). The accumulation of these errors invariably reduces the fidelity of the genome. Previous work has shown that these pol α tracks can be removed by two redundant pathways referred to as the short and long flap pathway. The long flap pathway utilizes a complex network of proteins to remove more of the misincorporated nucleotides than the short flap pathway which mediates the removal of shorter flaps. Lysine acetylation has been reported to modulate the function of the nucleases implicated in flap processing. The cleavage activity of the long flap pathway nuclease, Dna2, is stimulated by lysine acetylation while conversely lysine acetylation of the short flap pathway nuclease, FEN1, inhibits its activity. The major protein players implicated during Okazaki fragment processing (OFP) are known, however, the choice of the processing pathway and its regulation by lysine acetylation of its main players is yet unknown. This dissertation identifies three main findings: 1) Saccharomyces cerevisiae helicase, petite integration frequency (Pif1) is lysine acetylated by Esa1 and deacetylated by Rpd3 regulating its viability and biochemical properties including helicase, binding and ATPase activity ii) the single stranded DNA binding protein, human replication protein A (RPA) is modified by p300 and this modification stimulates its primary binding function and iii) lysine acetylated human RPA directs OFP towards the long flap pathway even for a subset of short flaps.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24511号 / 医博第4953号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 伊藤 貴浩, 教授 岩田 想, 教授 河本 宏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Accurate DNA replication is vital for maintaining genomic stability. Consequently, the machinery required to drive this process is designed to ensure the meticulous maintenance of information. However, random misincorporation of errors reduce the fidelity of the DNA and lead to pre-mature aging and age-related disorders such as cancer and neurodegenerative diseases. Some of the incorporated errors are the result of the error prone DNA polymerase alpha (Pol a), which initiates synthesis on both the leading and lagging strand. Lagging strand synthesis acquires an increased number of polymerase a tracks because of the number of Okazaki fragments synthesized per round of the cell cycle (~50 million in mammalian cells). The accumulation of these errors invariably reduces the fidelity of the genome. Previous work has shown that these pol a tracks can be removed by two redundant pathways referred to as the short and long flap pathway. The long flap pathway utilizes a complex network of proteins to remove more of the misincorporated nucleotides than the short flap pathway which mediates the removal of shorter flaps. Lysine acetylation has been reported to modulate the function of the nucleases implicated in flap processing. The cleavage activity of the long flap pathway nuclease, Dna2, is stimulated by lysine acetylation while conversely lysine acetylation of the short flap pathway nuclease, FEN1, inhibits its activity. The major protein players implicated during Okazaki fragment processing (OFP) are known, however, the choice of the processing pathway and its regulation by lysine acetylation of its main players is yet unknown. This dissertation identifies three main findings: 1) <i>Saccharomyces cerevisiae</i> helicase, petite integration frequency (Pif1) is lysine acetylated by Esa1 and deacetylated by Rpd3 regulating its viability and biochemical properties including helicase, binding and ATPase activity ii) the single stranded DNA binding protein, human replication protein A (RPA) is modified by p300 and this modification stimulates its primary binding function and iii) lysine acetylated human RPA directs OFP towards the long flap pathway even for a subset of short flaps.