Desde a década de 90, uma nova família de moléculas de origem protéica e com características hormonais vem sendo estudada em plantas. Esse grupo de novas moléculas, coletivamente chamado de peptídeos hormonais, está envolvido com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento. RALF, que é um desses novos peptídeos, é ubíquo em plantas e está envolvido com desenvolvimento vegetal. Em Arabidopsis existem 34 genes semelhantes ao RALF (AtRALFs). Nosso grupo mostrou que AtRALF1 é processado de um precursor maior por uma subtilase. Arabidopsis possui 56 subtilases, o objetivo deste trabalho é identificar a subtilase responsável pelo processamento do AtRALF1. Predição da localização subcelular e análise da expressão in silico, ambas confirmadas por análise da expressão por RT-PCR e fusões proteicas com a proteína verde fluorescente, permitiram reduzir para sete o número de subtilases candidatas. Cruzamentos entre mutantes nocaute ou plantas de baixa expressão por RNAi dessas sete subtilases com plantas superexpressoras do AtRALF1 identificaram as subtilases AtSBT6.1 (At5g19660) e AtSBT5.3 (At2g04160) como prováveis envolvidas no processamento do prepropeptídeo AtRALF1. / Since the 90s, a new family of molecules of protein origin and with hormone characteristics has been studied in plants. This group of new molecules, collectively named peptide hormones, is involved in defense, reproduction, growth and development. RALF, one of these peptides, is ubiquitous in plants and is involved in plant development. In Arabidopsis there are 34 RALF-like genes (AtRALFs). Our group has shown that AtRALF1 is processed from a larger precursor by a subtilase. Arabidopsis has 56 subtilases, our goal is the identification of the specific subtilase that is responsible for the AtRALF1 processing. Prediction of subcelular localization and in silico gene expression analysis, both confirmed by RT-PCR expression analysis and chimeric proteins with green-fluorescent protein, allowed the reduction of the initial 56 candidates to only 7 subtilases. Crosses between knockout mutants or RNAi plants expressing low levels of subtilases with overexpressors of AtRALF1 identified the subtilases AtSBT6.1 (At5g19660) and AtSBT5.3 (At2g04160) as potentialy involved in the prepropeptide AtRALF1 processing.

Os metais pesados são elementos químicos com alta densidade (>5 g.cm-3), presentes naturalmente na crosta terrestre, e o aumento das atividades antropogênicas vêm acelerando a liberação destes elementos nos ecossistemas. Tais elementos podem ser extremamente tóxicos (ex. mercúrio, chumbo, cádmio) ou tóxicos quando em concentrações elevadas (zinco e cobre). A fitorremediação é uma técnica de descontaminação que utiliza as plantas para remover poluentes do ambiente ou transformá-los em formas menos perigosas para os seres vivos, sendo que o impacto ambiental e custos de implementação são muito inferiores àqueles alcançados pelos métodos físico-químicos. Uma cultura para ser utilizada com sucesso na recuperação de áreas contaminadas, deve ser eficiente na acumulação de metais, produzir grandes quantidades de biomassa e ser capaz de se adaptar as condições do ambiente contaminado. A cana-de-açúcar apresenta características fisiológicas, que a tornaram uma das culturas mais importantes e difundidas nas regiões tropicais, com alta produtividade de biomassa e rusticidade, possuidora de genes que codificam peptídeos quelantes de metais, já identificados no projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST). Neste trabalho foi estudada a expressão gênica de metalotioneínas em plântulas de canade- açúcar. As plântulas foram cultivadas em hidroponia contendo níveis elevados de Cu+2 (50, 100, 250 e 500 µM) e Cd+2 (100, 250 e 500µM). A concentração do metal foi determinada nos tecidos de raiz e partes aéreas de plantas coletadas após 11 e 33 dias de tratamento. As maiores doses de Cu (250 e 500 µM) foram letais para as plantas após 11 dias de cultivo, entretanto o efeito das menores dosagens no crescimento foi comparável ao controle aos 33 dias de tratamento. As plantas foram capazes de acumular quantidades significativas de cobre e cádmio, principalmente nas raízes. Todas as dosagens de cádmio limitaram significativamente o crescimento, mas não o impediram. Extratos de RNA total foram analisados para a expressão dos genes de metalotioneína dos tipos I, II e III mediante Northern blot. Os resultados mostraram que houve expressão dos genes para metalotioneínas dos três tipos constitutivamente, sendo mais elevada para MT I e MT II, tanto em folhas como em raízes de cana de açúcar. A expressão de MT I foi maior nas raízes que nas folhas. Já os genes MT II e MT III foram mais expressos em folhas que em raízes. Os genes de metalotioneínas de cana-deaçúcar são pouco afetados ou não são modulados por Cobre. Em relação ao Cd, ocorre um acúmulo de transcritos de MT nas raízes aos 11 dias levemente proporcional à concentração do metal, (exceto para MT III) que é seguido de um decréscimo de transcritos, também paralelo aos teores de Cd na solução, aos 33 dias. Da mesma forma, existe uma indução de MT II e principalmente MT III na parte aérea, com o aumento da concentração de cádmio na solução, mais acentuada aos 11 dias. Estes resultados evidenciam a capacidade da cana-de-açúcar de tolerar e acumular Cu e Cd, sugerindo um potencial fitorremediador para recuperação de áreas contaminadas com esses metais. / Heavy metals are elements with high density (>5 g.cm-3), naturally occurring in soils, and with the increase of anthropogenic activities has accelerated the release of these elements in ecosystems. Heavy metals can be highly toxic (e.g. Mercury; Lead; Cadmium) or toxic at high concentration (Zinc and Copper). Phytoremediation is a clean up technology based on the use of plants to remove pollutants from the environment or to transform them in less toxic forms to living organisms, with less environmental impact at a lower cost than physic-chemical methods. A crop to be successfully used to recover contaminated areas must be efficient in metal accumulation, must yield large amounts of biomass and to be able to adapt to contaminated conditions. Sugarcane (Saccharum spp.) presents physiological characteristics that allowed this crop to become widely adopted in tropical, with high biomass production and with genes associated with chelating peptides already identified by the Sugarcane genome project (SUCEST). In this work, metallothionein gene expression was investigated in sugarcane plantlets. The young plants were growth in ¼ Hoagland solution containing elevated levels of Cu+2 (50, 100, 250 and 500 µM) or Cd+2 (100, 250 and 500µM). Metal concentration were determined in root and shoot tissues harvested at 11 and 33 days of treatment. The highest Cu doses (250 and 500 µM) killed the plants after 11 days of culture, however the effect of the lowest dosages were comparable to the control after 33 days of treatment. The plants were capable of accumulate large amount of Cu and Cd, mainly in roots. All Cd dosages significantly limited growth, but without stopping it. Total RNA was analyzed for metallothionein Type I, II and III gene expression by northern. Results indicated that expression of the three types of metallothionein genes was constitutive, with more expression of MT I and MT II, in leaves and roots. MT I expression was greater in roots than in shoots. But MT II and MT III genes were more expresses in shoots. Metallothionein gene expression was poorly affected or not at all by Cu. But for Cd, there was an accumulation of MT transcripts in roots at 11 days slightly proportional to Cd concentration, except for MT III, which was followed by a decrease in transcripts, also parallel to Cd levels in solution at 33 days. Similarly, there as an induction of MT II and mainly MT III in shots with the increase of Cd concentration in solution, more pronounced at 11 days of treatment. These results demonstrated the ability of sugarcane to tolerate and accumulate Cu and Cd, suggesting a potential application in phytoremediation of areas contaminated with heavy metals.

A maioria das proteínas organelares são codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas especificamente ao seu destino final. O direcionamento aos diferentes subcompartimentos subcelulares é feito por uma complexa e ampla maquinaria que envolve sequências de direcionamento, proteínas citossólicas e receptores organelares específicos. Entretanto, relativamente pouco se conhece sobre o processo na qual uma proteína recém sintetizada é transportada ao seu destino final. Parte significativa das proteínas destinadas às organelas possui a informação necessária ao seu transporte localizada na extremidade N-terminal. Vários estudos têm buscado caracterizar as etapas que envolvem a localização de uma proteína, desde os estágios iniciais após a sua síntese até os fatores que regulam o seu correto endereçamento. Modificações pós-traducionais, regiões 5-UTR, região C-terminal, transporte por vias alternativas e interações proteína-proteína podem agir na localização subcelular de proteínas. O estudo de redes biomoleculares se tornou um dos focos de estudo da biologia de sistemas e demonstra um enorme potencial na descoberta de diversos processos biológicos, como as interações proteína-proteína. As proteínas que possuem duplo direcionamento (DD) em Arabidopsis thaliana foram analisadas em redes de interação proteína-proteína (PPI) e proteínas que interagem com proteínas de DD foram escolhidas quanto a função e localização para a verificação de um eventual papel dessas proteínas na localização subcelular de outras proteínas. Para tanto, foram realizadas varreduras em ensaios de duplo-híbrido em levedura para os genes de GRF9 (14-3-3) e ATH7 (tiorredoxina tipo h). Os resultados para GRF9 incluem as proteínas peroxidase PRXR1 e dihidrolipoamida acetiltransferase. Já os resultados para ATH7 mostram a interação com glutamina sintetase (AT5G35630.3). A combinação dos estudos in silico com a varredura via duplo-híbrido de levedura abrem novas perspectivas no entendimento do controle da localização subcelular de proteínas. / Most organellar proteins are nuclear encoded, synthesized in the cytosol and then targeted to their destination. Specific subcellular targeting is conducted by a complex machinery for the specific localization of the proteins, which includes targeting sequences, cytosolic proteins and specific organelar receptors. However, little is known about the process that happens from the synthesis of a protein and the transport to its final destination. Most organellar proteins contain the information for their localization in the N-terminal sequence. Many studies have searched to characterize the steps involved in protein targeting, from the early stages after its synthesis to the cytosolic factors regulating its correct localization. Post-translational modifications, 5-UTR regions, the C-terminal extension on the protein, alternative transport pathways and proteinprotein interactions may influence the subcellular location of some proteins. The use of biomolecular netwoks has become one of the main focus of systems biology studies and possess a major potential in the discovery of several biological processes, such as protein-protein interactions (PPI). Dual-targeted (DT) proteins in Arabidopsis thaliana were analyzed through a PPI network, and the proteins displaying interactions with DT proteins were selected by their funtion and location. The selected proteins were analyzed for their eventual role in the subcellular targeting of other proteins. Screenings in yeast two-hibrid assays were performed for the genes GRF9 (14-3-3) and ATH7 (h-type thioredoxin). The results for GRF9 include a peroxidase (PRXR1) and dihydrolipamide acetyltransferase. The results for ATH7 include glutamine synthetase (AT5G35630.3). Combination of in silico analysis with yeast two-hibrid screenings provide new perspectives for understanding the control of subcellular localization.

O complexo FtsH em Arabidopsis, presente nos tilacóides, é formado pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Os tipos A e B apresentam grande identidade em seus domínios maduros, porém nenhuma similaridade é observada na região amino-terminal do peptídeo de trânsito. Em um experimento de importação em cloroplastos isolados, FtsH2 e FtsH5 foram importadas e subsequentemente integradas aos tilacóides através de um mecanismo de processamento em duas etapas que resultou em um domínio lumenal amino-proximal, uma única âncora transmembrânica e um domínio carboxi-proximal estromal. A integração da FtsH2 em tilacóides isolados foi totalmente dependente do gradiente de prótons, enquanto que a integração da FtsH5 foi dependente de NTPs, sugerindo que a inserção na membrana ocorre pelas vias TAT e Sec, respectivamente. Tal observação foi corroborada por experimentos de competição in-organello e inibição por anticorpos específicos. Os domínios amino-proximais até as âncoras transmembrânicas foram suficientes para a correta integração aos tilacóides. A região madura da FtsH2 apresentou incompatibilidade com a maquinaria Sec, como demonstrado pela troca de peptídeos de trânsito. A incompatibilidade não parece ser determinada por qualquer elemento específico da FtsH2, uma vez que nenhum domínio isolado apresentou incompatibilidade com a via Sec de transporte. Tal fato sugere uma incompatibilidade estrutural que requer a FtsH2 intacta. A descoberta que as subunidades FtsH do tipo A e B, que apresentam grande identidade e usam diferentes vias de integração para formar o mesmo complexo multimérico é uma observação nova e interessante para o estudo da biogênese de proteínas de membranas. O mecanismo de regulação que governa a atividade do complexo FtsH em Arabidopsis é ainda desconhecido, entretanto é proposta a existência de fatores adicionais. Dessa forma, a proteína plastidial FtsH de Arabidopsis foi usada como isca em um rastreamento por duplohíbrido de levedura. O rastreamento resultou em 48 colônias que ativaram os genes repórteres histidina e adenina. Entre todos os cDNAs sequenciados, foi encontrado um candidato em potencial denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein). Experimentos GST Pull-Down também indicam uma interação entre FtsH5 e FIP. O precursor FIP radioativo foi incubado com cloroplastos de ervilha. Após a incubação, os cloroplastos foram lisados e separados em estroma e tilacóides. FIP permaneceu associada exclusivamente à fração membranosa dos tilacóides. A inserção na membrana foi verificada através da resistência ao tratamento com álcali e o tratamento dos tilacóides com protease resultou em um fragmento protegido, característico de proteínas inseridas na membrana. A construção FtsH5::GFP transformada em Nicotiana tabacum resultou no direcionamento do gene quimérico aos cloroplastos. Dessa forma, assim como FtsH5, FIP é uma proteína plastidial que está localizada na membrana dos tilacóides. Géis nativos utilizando FIP radioativa mostram que ela está associada a um complexo de aproximadamente 450 kDa, que é o tamanho esperado para o complexo tilacoidal FtsH em Arabidopsis. Como as proteínas FtsH apresentam tanto o domínio ATPase quanto protease, acreditamos que FIP pode de alguma forma modular a atividade do complexo FtsH nos tilacóides. / The Arabidopsis thylakoid FtsH protease complex is composed of FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. Type A and type B subunits display a high degree of sequence identity throughout their mature domains, but no similarity in their amino-terminal targeting peptide regions. In chloroplast import assays, FtsH2 and FtsH5 were imported and subsequently integrated into thylakoids by a two-step processing mechanism that resulted in an amino-proximal lumenal domain, a single transmembrane anchor, and a carboxyl proximal stromal domain. FtsH2 integration into washed thylakoids was entirely dependent on the proton gradient, whereas FtsH5 integration was dependent on NTPs, suggesting their integration by Tat and Sec pathways, respectively. This finding was corroborated by in organello competition and by antibody inhibition experiments. The amino proximal domains through the transmembrane anchors were sufficient for proper integration. The mature FtsH2 protein was found to be incompatible with the Sec machinery as determined with targeting peptide-swapping experiments. Incompatibility does not appear to be determined by any specific element in the FtsH2 domain as no single domain was incompatible with Sec transport. This suggests an incompatible structure that requires the intact FtsH2. That the highly homologous type A and type B subunits of the same multimeric complex use different integration pathways is a striking example of the notion that membrane insertion pathways have evolved to accommodate structural features of their respective substrates. The regulation mechanism which governs the Arabidopsis FtsH complexs activity is still unknown, but it is proposed the presence of additional factors. For this reason, the plastidial Arabidopsis FtsH5 was used as bait in a yeast two hybrid screening. The screening resulted in 48 colonies that activated the histidine and adenine reporter genes. Among all the sequenced cDNAs we have found a potential candidate named FIP (FtsH5 Interacting Protein). GST Pull-Down experiments also indicate an interaction between FtsH5 and FIP. Radiolabeled FIP was incubated with intact isolated chloroplasts. After incubation, intact chloroplasts were lysated and separated into stroma and thylakoids. FIP remained associated exclusively with the thylakoid membrane fraction. The insertion into membrane was verified throughout resistance to alkali treatment and the thylakoid protease treated fraction resulted in a protected fragment, characteristic of membrane-inserted proteins. Agroinfiltrated Nicotiana tabacum leaves with a FtsH5::GFP construct resulted that the chimeric gene was targeted to chloroplasts. Thus, as FtsH5, FIP is a plastidial protein which is located into thylakoid membrane. Blue native gels using radiolabeled FIP protein show that it runs associated with a complex around 450 kDa, which is the expected size for the Arabidopsis FtsH thylakoidal complex. As FtsH proteins present both ATPase and protease domains, we believe that FIP can somehow modulates the activity of the thylakoidal FtsH complex.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ e V. labrusca ‘Niagara Rosada’, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and V. labrusca ‘Niagara Rosada’, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

Proteínas que se ligam a RNAs geralmente regulam estabilidade, localização e tradução de mensageiros por interação com seqüências específicas na região 3 não traduzida. A proteína PUMILIO foi descrita pela primeira vez em Drosophila, apresentando a função de controlar a tradução de mensageiros alvo durante o desenvolvimento. Homólogos podem ser encontrados em outras espécies filogeneticamente distantes com funções similares. O seqüenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana indicou a presença de quatro genes que codificam homólogos ao PUMILIO de Drosophila. Três deles estão no cromossomo II (APUM-1, 2 e 3), com alto grau de identidade e situados muito próximos uns dos outros. A terceira cópia está no cromossomo IV (APUM-4) e sua seqüência tem menor similaridade em relação aos três anteriores. Neste trabalho, foi clonado e caracterizado APUM-2. Ensaios de northern blot e RT-PCR indicaram que o mensageiro de Apum-2 pode ser encontrado em amostras de raiz, caule, folha, flores e frutos. Entretanto, sistemas repórteres, APUM-2::GUS e APUM-2::GFP, foram introduzidos no vegetal e a expressão foi observada nos ápices do caule e raízes, especificamente nas regiões meristemáticas. Também foram feitas construção para ensaios de genética reversa e as plantas contendo construções constitutivas (35S::APUM-2) se desenvolveram sem dominância apical e com grande quantidade de ramos, folhas e raízes secundárias, mostrando perturbações nos meristemas. Os resultados obtidos sugerem que APUM-2 possui papel relevante durante o desenvolvimento meristemático, possivelmente através de interações com mRNAs. / RNA-binding proteins often regulate the stability, localization, and translation of mRNAs by interaction with specific motifs in the 3-UTR. The PUMILIO protein from Drosophila was shown to control translation of specific mRNAs during development. PUMILIO homologs were found in several species and constitute the PUF family. The Arabidopsis thaliana sequencing project revealed four genes homolougs to PUMILIO. Three are situated in chromosome II (APUM-1, 2, and 3) that are nearly identical among themselves, and that contain a region that is 52% homologous to the PUMILIO. RNA-binding domain. The fourth is in chromosome IV (APUM-4), and shows low similarity to the other three. In this work, we characterized APUM-2 in further detail. Northern blots indicated that Apum-2 is expressed in shoot and root apices. Reporter transgenic plants were made that contained either APUM-2::GUS or Apum2::GFP constructs. Reporter gene expression confirmed that APUM-2 is active in shoot and root apices, specifically in the meristematic regions. Finally transgenic plants containing the 35S::APUM-2 construct were created. Constitutive APUM-2 expression resulted in plants with no apical dominance and a high number of leaves, stems and lateral roots. These results suggest that APUM-2 plays an important role during meristem development, possibly through a mRNA interaction.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ e V. labrusca ‘Niagara Rosada’, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and V. labrusca ‘Niagara Rosada’, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

Os isolados protéicos de soja são utilizados como ingredientes em diversos alimentos e sua utilização vêm aumentando juntamente com o aumento das pesquisas sobre os metabólitos secundários da soja, as isoflavonas. Alguns efeitos benéficos vem sendo associados às isoflavonas, entre estes a sua ação antioxidante, a redução ao risco de câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose. O objetivo deste estudo foi o de otimizar as condições de extração das isoflavonas e de suas formas conjugadas a partir da farinha desengordurada de soja, visando o preparo de isolado protéico de soja. Os resultados mostraram que a obtenção de isolados protéicos de soja com teor aumentado de isoflavonas depende da utilização de condições brandas de centrifugação para a separação do precipitado isoelétrico, assim como da utilização de água acidificada na sua lavagem. A presença de isoflavonas no isolado resulta de três fatores, o primeiro referindo-se à associação entre isoflavonas e proteínas através de interações hidrofóbicas, eletrostáticas, e pontes de hidrogênio; o segundo à menor solubilidade das isoflavonas presentes na farinha desengordurada de soja no pH isoelétrico; e o último ao processo de carreamento (físico) das isoflavonas pelas proteínas insolubilizadas. / Soy protein isolates are used as ingredients in several food products and their use is increasing together with the increase of the researches on the secondary metabolites of soy, the isoflavones. Some beneficial effects have been associated to the isoflavones, among these their antioxidant action, prevention of cancer, cardiovascular diseases and osteoporosis. The objective of this study was to optimize the extraction conditions of the isoflavones from the defatted soy flour, seeking the preparation of soy protein isolates. The results showed that the obtention of soy protein isolates with increased content of isoflavones depends on the use of mild conditions of centrifugation for the separation of the isoelectric precipitate, as well as on the use of water acidified in the washing step. The presence of isoflavones in the isolates resulted from three factors, the first refers to the association between isoflavones and proteins through hydrophobic; and electrostatic interactions, and hydrogen bonding; the second to the decreased solubility of the isoflavones extracted from the defatted soy flour in the isoelectric pH; and the last to the carrying process (physical) of isoflavones by the precipitating proteins.

O Eucalyptus é o gênero mais importante para a indústria brasileira de papel e celulose. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden e seus híbridos são preferencialmente usados pela indústria devido ao rápido crescimento e alta produtividade volumétrica. Embora possua características adequadas à utilização comercial, vários estresses abióticos e bióticos influenciam sua produção. O IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) destaca a Puccinia psidii como sendo a maior ameaça para a cultura nos tempos atuais. A doença não co-evoluiu com o hospedeiro e por essa razão, torna o patógeno um elemento potencial a vencer as barreiras impostas pelo hospedeiro. O fungo ataca plantas jovens, incluindo mudas em viveiros, plantas em jardins clonais e plantações comercias com até 2 anos de idade. Com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas e avaliar as mudanças ocorridas na composição química da parede celular das folhas, o presente trabalho analisou o impacto da presença do fungo sobre os clones comerciais, resistentes (7) e suscetíveis (24), de eucalipto. Os clones de E. grandis, 7 e 24, previamente inoculados com uredósporos de P. psidii, foram utilizados para extração de proteínas após 24 horas de interação com o fungo. As análises foram realizadas com auxílio de SDS-PAGE de primeira e segunda dimensão, em gradiente de pH na faixa de 4-7, utilizando-se 750 µg de proteínas. As imagens dos géis, em triplicata, analisadas pelo programa (Image Master Elite v. 3.01), possibilitaram a identificação de 466 spots. A comparação entre os perfis eletroforéticos dos clones que foram analisados e os controles não inoculados, mostrou que o processo de infecção do fungo nas plantas induziu o aparecimento de 72 spots exclusivos para o clone 7 além de alterações do volume de outros 115 spots. Já para o clone 24, a exposição ao fungo promoveu o aparecimento de 22 spots exclusivos e alterações de outros 98. Os perfis eletroforéticos dos clones controle, que não foram expostos ao fungo, mostraram diferenças genéticas entre os clones 7 e 24. O clone resistente, apresentou grande concentração de spots na região entre 14 a 45 kDa. Já para o clone suscetível, os spots se concentraram na região entre 25 a 97 kDa. A avaliação do conteúdo de carboidratos e ácidos urônicos da parede celular mostrou alterações no conteúdo dos açúcares no material inoculado com P. psidii, após 24 horas, 6 e 12 dias de inoculação. Os teores de glicose observados para os clones 7 e 24, já após 24 horas da inoculação, mostraram-se bastante alterados, indicando que esse açúcar possui papel chave no processo de formação da parede celular e conseqüentemente no mecanismo de defesa vegetal. / Eucalyptus is the most important genus for the Brazilian pulp and paper industry. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden and hybrids are preferentially used by the industry due to its rapid growth and high volumetric productivity. Although they possess characteristics adequate for commercial use, various biotic and abiotic stresses influence production. IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) highlight Puccinia psidii as the largest current threat to the culture. The disease did not co-evolve with the host and for this reason has become the pathogen with most potential to overcome the barriers imposed by the host. The fungus attacks young plants, including saplings in nursery, clonal gardens and commercial plants up to 2 years-old. With the objectives of identifying the proteins differentially expressed and evaluate the changes occurring in the chemical composition of the cell walls in the leaves, the present work analyzed the impact of the presence of the fungus on the commercial eucalyptus clones, resistant (7) and susceptible (24). The E. grandis clones (7 and 24) were inoculated with P. psidii urideospores and proteins extracted after 24 hours interaction with the fungus. The analyses were carried out using a pH gradient (4-7) in the first and SDS-PAGE in the second dimension, loading 750 µg onto the gel. The gel images, in triplicate, were analyzed using the software Image Master Elite v. 3.01, allowing the identification of 466 spots. The electrophoretic profiles for each clone were analyzed and compared to the uninoculated controls, showing that the fungal infection process induced the appearance of 72 exclusive spots in clone 7 and an alteration in the volume of another 115 spots. In clone 24, exposure to the fungus induced the appearance of 22 exclusive spots and altered another 98. The electrophoretic profiles of the control clone, not exposed to the fungus, demonstrated genetic differences between the 7 and 24. The resistant clone (7) presented a large concentration of spots around 14 to 45 kDa. In contrast, the susceptible clone (24) presented a concentration of spots around 25 to 97 kDa. Evaluation of the carbohydrate and uronic acid content of the cell wall showed an alteration in the sugar content in the material exposed to P. psidii after 24 hour, 6 and 12 days after inoculation. The glucose levels observed for clones 7 and 24 were considerable altered 24 hours after inoculation, indicating that this sugar has a key role in cell wall formation and consequently in the plant defense mechanism.

THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.