Orientador : Renato Bonatelli Jr / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T01:43:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AlfredoLuisZangariniGriside_M.pdf: 3719749 bytes, checksum: 83f61b49b92afe17bd176b46d67d08b7 (MD5) Previous issue date: 1991 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Programas de melhoramento genético de maracujá (Passiflora edulis var. flavicarpa Deg.) têm sido conduzidos no Brasil visando a seleção de variedades mais produtivas. Híbridos interespecíficos entre a espécie cultivada e espécies selvagens relacionadas têm sido obtidos, usando técnicas de hibridação sexual, na tentativa de transferir genes de resistência à doenças para o híbrido. Entretanto estes híbridos interespecíficos possuem problemas de fertilidade. Isto dificulta seu aproveitamento em programas de melhoramento e justifica o uso da técnica de hibridação somática. Esta dissertação descreve o desenvolvimento de protocolos para o isolamento e a cultura de protoplastos de espécies de Passiflora. O procedimento resulta na regeneração de plantas inteiras, bem como na obtenção de hídricos somáticos resultantes da fusão de protoplastos isolados da espécie comercial e de espécies selvagens de Passiflora. Protoplastos foram isolados de explantes foliares de P. alata Ait., P. amethystina Mikan, P. cincinnata,/i> Mast., P. coccínea Aubl., P. edulis var. flavicarpa Deg. E P. giberti N.E. Brown, mediante tratamento enzimático. Os protoplastos mostraram-se capazes de regenerar a parede celular, sofrer divisões e formar colônias. Em condições apropriadas, as colônias desenvolveram calos e regeneraram brotos. Plantas inteiras puderam ser obtidas de todas as espécies estudadas, com exceção de P. coccínea. Protoplastos isolados de tecido foliar de P. edulis var. flavicarpa e de suspensões celulares das espécies selvagens, foram fundidos com o uso de uma solução contendo 30% (p/v) de PEG. O cultivo dos produtos de fusão resultou em 3 a 5% de calos híbridos. Estes foram selecionados pelo padrão eletroforético de bandas de proteínas solúveis e de isoenzimas. Os híbridos somáticos de P. edulis var. flavicarpa (+) P. alata, P. edulis var. flavicarpa (+) P. amethystina, P. edulis var. flavicarpa (+) P. cincinnata e P. edulis var. flavicarpa (+) P. giberti, foram regenerados desenvolveram-se em plantas inteiras, que apresentaram 4n=36 cromossomos. / not available

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-10-09T14:46:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4569752 bytes, checksum: 7423d0749a49ab3a18033fe827e2181d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-09T14:46:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4569752 bytes, checksum: 7423d0749a49ab3a18033fe827e2181d (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em todas as aplicações, o teste de viabilidade e necessario para medir a taxa de protoplastos viáveis, possibiltando decidir os procedimentos de isolamento e purificação mais adequados e verificar se ha celulas suficientes para as etapas subsequentes. A microscopia de fluorescência geralmente é empregada para o teste de viabilidade. No entanto, alguns problemas têm sido apontados: longo tempo necessário para contar um número relativamente pequeno de protoplastos, aglomerados de células que impedem a observação dos protoplastos e percepção visual da fluorescência subjetiva ao observador. Este estudo teve como objetivo estabelecer procedimentos para teste de viabilidade adaptado para citometria de fluxo (FCM), MuseTM cell analyzer (Muse) e Ensaio cometa (CA). Para isso, Capsicum annuum foi escolhido devido a natureza morfogênica recalcitrante dos protoplastos. Após o isolamento e a purificação, as aplicações permitiram avaliar um grande número de protoplastos (FCM e MUSE) e núcleos dos protoplastos (CA) em um curto período de tempo. A partir das adaptações nos procedimentos, foram evidenciados diferentes tipos e níveis de danos citológicos (FCM e Muse) e genômicos (Muse e CA), possibilitando discriminar e mensurar os protoplastos viãveis. Considerando os resultados, este estudo introduz procedimentos quantitativos melhorados para o teste de viabilidade. Alem disso, visando a regeneração de plântulas, diferentes métodos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade de protoplastos, definindo os procedimentos de isolamento e purificação mais adequados. Corraborando para este propósito, foram mostrados guias para FCM, Muse e CA visando a padronizaçao dos testes de viabilidade em protoplastos de plantas. / Plant protoplasts are valuable in biotechnology, enabling the plantlet regeneration until the gene function determination. In all applications, viability test is required to measure the rate of viable protoplasts, allowing to decide on the most adequate isolation and purification procedures and to verify whether there are sufficient cells for subsequent steps. Fluorescence microscopy is usually employed for viability test. However, some problems have been pointed out: long time required to count a relatively small number of protoplasts, cell clumps preventing their observation, and the subjective visual perception of the fluorescence by observer. This study aimed to establish procedures for viability test adapted for flow cytometry (FCM), MuseTM cell analyzer (Muse) and Comet Assay (CA). For this, Capsicum annuum was chosen due to recalcitrant morphogenic nature of its protoplasts. After isolation and purification, the applications allowed assessing large numbers of protoplasts (FCM and MUSE) and protoplasts nuclei (CA) in a short time period. From the adjusted procedures, different types and levels of cytological (FCM and Muse) and genomic damages (Muse and CA) were evidenced, allowing to discriminate and measure the viable protoplasts. Considering the results, this study introduces improved quantitative procedures for viability test. Besides of these and aiming the plantlet regeneration, different methods can be applied to assess the protoplast viability, defining the more adequate isolation and purification procedures. Contributing with this purpose, guides were showed for FCM, Muse and CA to standardization of viability tests in plant protoplasts

Programas de melhoramento genético de maracujá (Passiflora edulis var. flavicarpa Deg.) têm sido conduzidos no Brasil visando a seleção de variedades mais produtivas. Híbridos interespecíficos entre a espécie cultivada e espécies selvagens relacionadas têm sido obtidos, usando técnicas de hibridação sexual, na tentativa de transferir genes de resistência à doenças para o híbrido. Entretanto estes híbridos interespecíficos possuem problemas de fertilidade. Isto dificulta seu aproveitamento em programas de melhoramento e justifica o uso da técnica de hibridação somática. Esta dissertação descreve o desenvolvimento de protocolos para o isolamento e a cultura de protoplastos de espécies de Passiflora. O procedimento resulta na regeneração de plantas inteiras, bem como na obtenção de hídricos somáticos resultantes da fusão de protoplastos isolados da espécie comercial e de espécies selvagens de Passiflora. Protoplastos foram isolados de explantes foliares de P. alata Ait., P. amethystina Mikan, P. cincinnata,/i> Mast., P. coccínea Aubl., P. edulis var. flavicarpa Deg. E P. giberti N.E. Brown, mediante tratamento enzimático. Os protoplastos mostraram-se capazes de regenerar a parede celular, sofrer divisões e formar colônias. Em condições apropriadas, as colônias desenvolveram calos e regeneraram brotos. Plantas inteiras puderam ser obtidas de todas as espécies estudadas, com exceção de P. coccínea. Protoplastos isolados de tecido foliar de P. edulis var. flavicarpa e de suspensões celulares das espécies selvagens, foram fundidos com o uso de uma solução contendo 30% (p/v) de PEG. O cultivo dos produtos de fusão resultou em 3 a 5% de calos híbridos. Estes foram selecionados pelo padrão eletroforético de bandas de proteínas solúveis e de isoenzimas. Os híbridos somáticos de P. edulis var. flavicarpa (+) P. alata, P. edulis var. flavicarpa (+) P. amethystina, P. edulis var. flavicarpa (+) P. cincinnata e P. edulis var. flavicarpa (+) P. giberti, foram regenerados desenvolveram-se em plantas inteiras, que apresentaram 4n=36 cromossomos. / not available

Orientadores: Renato Bonatelli Junior, Maristela O. Azevedo, Maria Sueli S. Felipe / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T12:10:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_MariaInes_M.pdf: 3158563 bytes, checksum: 95181fed446ecc980e54a78f146a546a (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: Foram estabelecidas neste trabalho, duas metodolo-gias para linhagens de Aspergillus niger com o interesse voltado para sua utilização na Tecnologia do DNA Recombi- nante (TDR). A primeira delas teve por objetivo o melhoramento da técnica de produção de protoplastos para esta linhagem, assim como a definição de melhores condições de regenera-ção. As melhores preparações de protoplastos provieram do micélio desenvolvido _na presença de Tween 80. Durante a produção foi possível obter até 2,1 x 108 protoplastos/ml quando o sulfato de magnésio 0,5M foi utilizado como estabilizador nesta etapa. A associação do sorbitol ao MgSO4, em baixa concentração (50 mM) possibilitou um aumento signifi-cativo da taxa de regeneração (de até, aproximadamente 20%) quando o sorbitol foi mantido como único estabilizador. Os clorotoplastos obtidos pelo método de GAMBINO e col. (1984) por nós adaptado, apresentaram-se túrgidos e permitiram uma análise cito lógica com visualização de numerosos núcleos. A segunda metodologia objetivou a melhoria do pro-cedimento da extração de DNA deste fungo resultando em uma preparação rápida (3,5 horas de manipulação) em que o DNA apresentou as seguintes características: - peso molecular elevado ( 50Kb) quando comparado ao mar-cador fago ?. -alto grau de pureza (A260: A280= 1,8 - 2,0) . - susceptibilidade à ação de enzimas de restrição (Eco RI e Pst I) e de ligação (T4 DNA-ligase) A determinação da quantidade de DNA obtido após extra-ção, utilizando-se a metodologia desenvolvida durante o trabalho, foi feita por dosagem colorimétrica da difenila-mina (DF A). A recuperação do DNA extraído foi de 70% e sua alta reprodutibilidade permitiu inclusive, autilização desta metodologia para extração desta macromolécula de ou-tros fungos filamentosos / Abstract: This research was done aiming the improvement of two methods of great relevanceto the Recombinant DNA Tech-nology (RDT) in Aspergillus niger. Firstly, the method of production and regeneration of protoplasts was improved. The best protoplasts preparations (2. 1 x 108 protoplasts/ml) were obtained when the my-celium was grown in medium containing Tween 80 and magne-sium sulphate 0.5M, the latter used as an osmotic stabili-zer. However, regeneration could only be significantly im-proved when magnesium sulphate was used at a lower concen-tration (50 mM) associated with sorbitol (1.2 M) during the production of protoplasts. Cytological analysis with protoplasts isolated by using the method of GAMBINO et alii (1984)revealed that up to 32 nuclei can be counted per protoplast. The method for isolation of DNA from this species was also improved. The final procedure is rapid (3.5 hours of manipulation before cesium chloride ¿ ethidium bromide gradient) and DNA isolated has showed the following characteristics: - high molecular weight; approximately 50 Kb. ¿ low level of proteic contamination (A260: A280= 1,8 - 2,0).- susceptibility to restriction (Eco RI and Pst I) and ligation (T4 DNA - ligase) enzymes. The DFA method was -.applied to estimate the recovery of DNA by using this improved procedure. DNA yields as high as 70% (ratio between final and inicial DNA concentrations) were obtained. The improved procedure has also proved to be suita-ble for extraction of DNA from others species of filamen-tous fungi / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Ione Salgado Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_JoseFranciscode_M.pdf: 5635452 bytes, checksum: b9bb1fee866a1316197d55de23837520 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Protoplastos isolados a partir de cultura de células de Citrus sinensis em suspensão foram utilizados como modelo experimental para o estudo do transporte e da homeostase de em células vegetais. Fluxos de 'Ca POT. 2¿ Foram acompanhados por observação das alterações de 'Ca POT. 2¿ livre do meio, utilizando se o indicador de 'Ca POT. 2¿ arsenazo III que é sensível a baixas concentrações desse íon. Alterações na concentração de Ca2+citoss61ico foram acompanhadas por microscopia confocal de fluorescência, utilizando-se o indicador de 'Ca POT. 2¿ fluorescente, indo-1. Protoplastos incubados na presença de 20 'mu¿M de 'Ca POT. 2¿ livre apresentaram-se praticamente inativos para a captação do íon, uma vez que a baixa concentração externa de 'Ca POT. 2¿ não foi suficiente para gerar um gradiente capaz de impulsionar a entrada do íon na celula. Entretanto, quando o 'Ca POT. 2¿ foi removido do meio por adição de EGTA , o efluxo de 'Ca POT. 2¿ foi estimulado por antagonistas de calmodulina como trifluoperazina (TFP), clorpromazina (CP) e calmidazolium, de uma maneira dose-dependente. A eficiência com que os diferentes antagonistas de calmodulina induziram o efluxo de Ca2+ em protoplastos de C. sinensis indicaram que este processo foi resultante de um efeito inespecífico na membrana dos protoplastos e não devido a uma ação anticalmodulina ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Isolated protoplasts from suspension-cultured Citrus sinensis cells were used as an experimental model for the study of the 'Ca POT. 2¿ transport and homeostasis in plant cells. 'Ca POT. 2¿ fluxes were accompanied through the medium free 'Ca POT. 2¿ alterations using the 'Ca POT. 2¿ indicator arsenazo III that is sensitive to low concentrations of that ion. Citosolic free 'Ca POT. 2¿ concentration changes were accompanied through fluorescence confocal microscopy, using the fluorescent 'Ca POT. 2¿ indicator, indo-1. In the presence of 20¿mu¿M free 'Ca POT. 2¿ protoplasts were practically inactive for the uptake of that ion, since the low external 'Ca POT. 2¿ concentration did not generate a enough gradient able to impel the entrance of the ion inside of the cell. However, when 'Ca POT. 2¿ was removed from the medium through the EGTA addition, the 'Ca POT. 2¿ efflux was stimulated by calmodulin antagonists such as trifluoperazin (TFP), chlorpromazin (CP) and calmidazolium, in a dose-dependent manner. The efficiency in which the different calmodulin antagonists induced the 'Ca POT. 2¿ efflux from the C. sinensis protoplasts indicated that this process resulted from an unspecific effect in the protoplast membrane and not due to an anti-calmodulin action ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Ciências Biológicas

Com o objetivo de verificar o fenômeno da parameiose em Metarhizium anisopliae, mutantes das linhagens E6, E9 e RJ, com duas marcas auxotróficas e uma marca morfológica, foram utilizados para a realização de cruzamentos via fusão de protoplastos. Através da análise genética dos produtos de fusão detectou-se a ocorrência de recombinantes auxotróficos, com evidências de recombinação mitótica, não recuperando - se o diplóide. Este fato demonstra a alta instabilidade da fase diplóide e comprova a ocorrência de parameiose nesta espécie. Prováveis aneuplóides foram isolados, os que poderiam ter sido originados pelo desarranjo cromossômico dos diplóides em processo de haploidização. Por outro lado, descreveu-se o método de produção de protoplastos de conídios. A obtenção dos mesmos, abre a possibilidade de sua utilização em futuros estudos de transformação genética, uma vez que estes protoplastos são mais adequados para essa finalidade. / Aiming to study parameiosis in Metarhizium anisopriae, mutants of the strains E6 , E9 and RJ, with two auxotrophic marks and a morphological one, were crossed by protoplast fusion. Through the genetical analysis of the fusion products it was detected auxotrophic mutants, evidencing mitotic recombination and the diploid was not recovered. This fact shows the high instability of the diploid phase and confirms the occurrence of parameiosis in this species. Some supposed to be aneuploids were isolated ant it might, be possible they were originated by cromossomic disarrengements during haploidization. A protoplasting method from conidia was described as well. It might be used in future genetic transformation experiments since this kind of protoplasts suit better the process

Orientador: João Lucio de Azevedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T21:27:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calil_MariaRegina_D.pdf: 4512453 bytes, checksum: 4d831abd404568568404ac17a839e721 (MD5) Previous issue date: 1995 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Estabeleceu-se um sistema rápido para regeneração de plantas a partir de protoplastos derivados de calos primários de dois cultivares de arroz brasileiros, IAC-165 e IAC-201. Após uma série de experimentos em indução de calos, foi possível produzir uma quantidade suficiente de calos embriogênicos derivados de semente nos meios B5 (GAMBORG et al, 1968) e N6 (CHU, 1978) suplementados com 2 e 4 mg/l de 2,4-D, acrescidos de 576 e 288 mg/l de L-prolina para os cultivares IAC-165 e IAC-201, respectivamente. Os calos embriogênicos primários derivados de sementes foram utilizados para isolamento direto de protoplastos ou para o início de suspensões celulares. Linhagens de células em suspensão foram estabelecidas para ambos cultivares sendo capazes de produzir uma grande quantidade de protoplastos em 4 a 6 meses. Os protoplastos derivados de calos induzidos a partir de sementes foram plaqueados em blocos de agarose e formaram colônias embriogênicas, visíveis ao olho nu, em 15 a 16 dias após o plaqueamento. Este tipo de colônia formou pequenos calos que foram plaqueados em meio de regeneração. Mais de 100 plantas foram regeneradas, sendo 22,2%. O presente sistema possibilitará fazer-se transformação genética em não mais do que 120 dias. Isto torna o sistema mais rápido do que o sistema tradicional de obtenção de protoplastos derivados de suspensões celulares e, devido a isto, torna-o competitivo com a biolística. Existem somente dois trabalhos que relatam a regeneração de plantas a partir de protoplastos derivados de calos primários, ambos usaram calos embriogênicos induzidos a partir de embriões imaturos. O presente trabalho relata, pela primeira vez, a regeneração de plantas de cultivares de arroz brasileiros utilizando sementes para a indução de calos. / not available

A instabilidade genética observada no fungo filamentoso Aspergillus nidulans, é semelhante em muitos aspectos aos estudos em milho de McCLINTOCK (1951), com os elementos genéticos móveis. Muitos trabalhos vêm sendo realizados desde 1960 no sentido de caracterizar através da genética clássica, e mais recentemente com as técnicas modernas, o fenômeno de transposição. A instabilidade deste fungo é observada na forma de setores produzidos por uma linhagem que apresenta uma duplicação de um segmento do grupo de ligação I translocado para o grupo de ligação II. Tais setores originados por deleções, novas duplicações, outros rearranjos e por transposição podem ser classificados em melhorados, deteriorados e heterocarióticos. Este trabalho pretendeu ser mais uma contribuição aos estudos básicos dessa instabilidade. Inicialmente através do isolamento de setores deteriorados e sua análise genética via metodologia clássica, já que tais setores podem ser originados por transposição. Foram analisados 7 variantes deteriorados através do ciclo sexual e parassexual, sendo que os determinantes de deterioração foram localizados nos grupos de ligação III • IV. Utilizando-se de técnicas modernas através da obtenção, fusão e regeneração de protoplastos, a análise genética dos variantes foi feita em diplóides obtidos por fusão. Nenhuma alteração foi detectada quanto a loca1ização dos determinantes genéticos de deterioração na análise mitótica dos 7 variantes. E finalmente foi verificado se ocorre transposição pela fusão citoplasmática, através da fusão dos protoplastos. Foi encontrado 1 variante hap1óide com fenótipo deteriorado e marcadores genéticos da linhagem MSE, pela fusão de protoplastos desta linhagem com o variante V94, em menos que 600 colônias analisadas. Para se alcançar esses três objetivos, outros pequenos ensaios complementares foram feitos, como a segregação meiótica dos cruzamentos entre variantes deteriorados e a linhagem MSE, em meio com estabilizador osmótico, para diminuir a desvantagem seletiva dos deteriorados em relação as colônias normais; porcentagem de regeneração e fusão de protoplastos, um estudo comparativo das linhagens A, MSE e variantes deteriorados; verificação da toxicidade do PEG aos variantes deteriorados; efeito do fungicida banlate sobre a instabilidade dos diplóides obtidos pela metodologia clássica e fusão de protoplastos; e padrão eletroforético das enzimas do sistema esterase das linhagens A, MSE e variantes deteriorados. / The genetic instability found in the filamentous fungus Aspergillus nidulans is, in many aspects, similar to the studies of moving genetic elements in maize, done by McCLINTOCK (1951). Since 1960, many studies have been carried out with the aim of understanding the phenomena of transposition, initially by using classical genetic techniques and more recently by using modern techniques. The instabili1y of this fungus is observable by the production of sectors by strains which possess a duplicated segment of linkage group I translocated to linkage group II. Such sectors, originated either by deletions, new duplications, transposition or by other rearrangements, may be classified as improved, deteriorated or heterokaryotic. This work is a contribution to the basic studies of this instability, and is divided into three main parts. Initially, deteriorated sectors were isolated and genetica11y analyzed by classica1 methods, since such sectors may be originated by transposition. Seven deteriorated variants were analyzed by their sexual and parasexual cycles. The determinants of deterioration were found to be localized in linkage group III and IV. Modern techniques, namely the obtainment, fusion and regeneration of protoplasts, were used and genetical analysis of variants were carried out on diploides obtained by fusion. No alteration of the 1ocalization of the genetic determinants of deterioration was detected by mitotic analysis of the seven variants. Finally, protoplast fusion was used to verify if transposition occurs from citoplasmic fusion. A haploid variant, with a deteriorated phenotype and genetic markers of the MSE strain, was found from the protoplastic fusion of this strain with the variant V94, within less than 600 analyzed colonies. To achieve the above objectives, other small complementary assays were done, such as the meiotic segregation of the crosses between deteriorated variants and the MSE strain, in a medium containing osmotic stabilizer, with the aim of decreasing the selective desadvantage of the deteriorates; a comparative study of strains A and MSE and deteriorated variants as to percentage of regeneration and fusion of protoplasts; examination of PEG toxicity to deteriorated variants; effect of benlate fungicide upon the instability of the diploids obtained by classical methodology and by protoplast fusion; and the eletrophoretic pattern of the enzymes of the esterase system of strains A and MSE and deteriorated variants.