Pela utilização de métodos bioquímicos, biofísicos, de tipagem sorológica e de visualização das proteínas totais bacterianas, isolados de surubim Pseudoplatystoma corruscans, tilápia Oreochromis niloticus e pacu Piaractus mesopotamicus, foram caracterizados, identificados e sua virulência determinada. Dentre as linhagens de referência, o isolado de surubim caracterizou-se como sendo Plesiomonas shiguelloides e os demais isolados de tilápia e pacu foram identificados como Aeromonas hydrophila, todos pertencentes à família Vibrionaceae. Os isolados de tilápia e pacu caracterizaram-se como linhagens virulentas, resistentes aos antibióticos ampicilina, amoxicilina, lincomicina, novobiocina, oxacilina, penicilina, rifampicina e trimetoprim+sulfametoxazol, em ensaios de antibiograma realizados em meio YEA que evidenciaram que as linhagens isoladas de peixes são resistentes a oito das dezessete substâncias antimicrobianas testadas pelo método de difusão em disco. Essas características são compatíveis com as apresentadas pelo espécime tipo de A. hydrophila. Ambas as linhagens quando cultivadas em meio YEA compartilharam a mesma banda de aproximadamente 33,61kDa com o espécime tipo para A. hydrophila. Em meio enriquecido com glucose, a banda compartilhada entre elas teve peso molecular aproximado de 144,28kDa. Os testes de aglutinação sorológica evidenciaram nestas duas linhagens a presença de antígenos estáveis ao calor do tipo O. A técnica de dupla imunodifusão de Ouchterlony demonstrou que o antígeno preparado a partir do isolado de tilápia é a linhagem de A. hydrophila mais indicada para ser utilizada em estudos visando o desenvolvimento de uma vacina polivalente. / Bacteria isolated from surubim Pseudoplatystoma corruscans, tilapia Oreochromis niloticus e pacu Piaractus mesopotamicus, were characterized and identified by biochemical, biophysical, serology, and SDS-PAGE, and their virulence observed. The strain isolated from surubim was characterized as Plesiomonas shigelloides. The other strains isolated from tilapia and pacu were Aeromonas hydrophila. The isolated A. hydrophila strains presented virulence and resistance against the follow antibacterial substances: ampicillin, amoxicillin, lincomicin, novobiocin, oxacillin, penicillin, rifampin and trimetoprim+sulfametoxazole. Both strains when cultivated in YEA medium shared with the A. hydrophila type strain a similar protein band of 33,61kDa. In a medium supplemented with glucose, only one protein exhibiting relative molecular mass of 144.28 kDa, was shared by the type strains isolated from fish and the type strain. The serology tests revealed that all isolated strains presented heat-stable O-antigens. The Ouchterlony double-immunodiffusion showed that the antigen prepared from the tilapia strain possessed surface antigens similar to A. hydrophila type strain and the strains isolated from pacu. This suggested the possibility of development and usage of a common or polyvalent vaccine for A. hydrophila among tilapia and pacu or other freshwater fish species.

ABREU, Virgínia Kelly Gonçalves. Efeito da radiação gama sobre a redução de microrganismos patogênicos, a estabilidade dos lipídios e as características sensoriais em caudas de camarões congelados. 2006. 75 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-CE, 2006 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-30T14:52:55Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_vkgabreu.pdf: 431632 bytes, checksum: fb4a5fd03cc95a3e25fdd9154f2c1d2c (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-30T14:54:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_vkgabreu.pdf: 431632 bytes, checksum: fb4a5fd03cc95a3e25fdd9154f2c1d2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T14:54:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_vkgabreu.pdf: 431632 bytes, checksum: fb4a5fd03cc95a3e25fdd9154f2c1d2c (MD5) Previous issue date: 2006 / Irradiation represents an efficient technique to extend shelf life of several foods and the interest in using this technology has been growing in the last years because besides improving food safety it produces minimal alterations in the food constituents. Thus, this study investigated the effect of ionizing irradiation (60Co) of frozen and packaged shrimp on microorganisms as well as on some chemical and sensory characteristics of the product. Cultivated shrimp (Penaeus vannamei) from local farms processed into shrimp tails were packaged, frozen, irradiated and analyzed. The study was divided in two stages. The first stage was intended to verify the effect of the gamma radiation on the population of inoculated Vibrio cholerae O1 and Salmonella enteritidis bacteria. It used a complete randomized factorial (4 x 3) design with four irradiation doses (0, 2, 4 and 6kGy) and three inoculation modalities (one with V. cholerae O1, one with S. enteritidis and one without microorganisms). The second stage aiming to verify the effect of the gamma irradiation on the chemical stability of lipids, color and instrumental texture of shrimp followed a complete randomized factorial (4 x 5) design with four irradiation doses (0, 2, 4, and 6kGy) and five replicates. Sensorial analysis followed a complete randomized factorial of balanced complete blocks, where the panelist was considered as block. The experimental units (UE) from the first stage were analyzed for V. cholerae O1 and S. enteritidis survival after the irradiation procedure, while those from the second stage were analyzed for thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), instrumental color and texture and sensory evaluation of the meat. As irradiating dose increased a significant (p<0.05) reduction in V. cholerae O1 and S. enteritidis counts was observed. TBARS values decreased (p<0.05) in shrimp irradiated with 6kGy related to those in non irradiated shrimp. Also, color component L* increased (p<0.05) in shrimp irradiated with 6kGy dose as compared to that irradiated with the 2kGy dose. No effect of irradiation was found on color components a* and b* or on instrumental texture values. Sensory global acceptance presented a significant reduction (p <0.05) with the dose of 6kGy as related to the doses of 2kGy or 0kGy. However, color acceptance and texture and the intensity of the attributes aroma, flavor and juiciness were not affected (p>0.05). Therefore, irradiation treatment in doses up to 6kGy on frozen and packaged shrimp tails significantly reduces V. cholerae O1 and S. enteritidis counts with minor effects on sensory characteristics in cooked shrimp. / A irradiação representa uma técnica eficiente na conservação dos alimentos, e o interesse pela sua utilização tem crescido nos últimos anos, pois além de melhorar a qualidade microbiológica, produz mínimas alterações nos constituintes dos alimentos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito da radiação gama (60Co), aplicada ao camarão congelado e embalado, sobre a microbiota, a estabilidade química de alguns componentes, bem como sobre algumas propriedades sensoriais da carne. Foram avaliadas caudas de camarões da espécie Penaeus vannamei, provenientes da carcinicultura local. O estudo foi dividido em duas etapas, sendo a primeira destinada a verificar o efeito da radiação gama, aplicada nas doses de 0, 2, 4 e 6kGy, sobre a população de duas bactérias patogênicas inoculadas no camarão: Vibrio cholerae O1 e Salmonella enteritidis. Este estudo utilizou um delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 3, em que os fatores avaliados foram as quatro doses de irradiação e três modalidades de inoculação (com V. cholerae O1, com S. enteritidis e sem inoculação de microrganismos). Já na segunda etapa foi usado um delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 5, sendo quatro doses (0, 2, 4 e 6kGy) de irradiação e cinco repetições, para as análises de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), cor e textura instrumental. Para a análise sensorial foi utilizado um delineamento de blocos completos balanceados, onde o provador foi considerado como bloco. Houve uma redução significativa (p<0,05) do número de V. cholerae O1 e de S. enteritidis de acordo com o aumento da dose de irradiação. Em relação aos valores de TBARS, houve um decréscimo (p<0,05) das amostras irradiadas com 6kGy em relação as não irradiadas. Quanto ao valor do componente de cor L* houve uma elevação significativa (p<0,05) com a dose de 6kGy em relação à dose de 2kGy. Os componentes de cor a* e b* e a textura instrumental não variaram (p>0,05) com as doses de irradiação estudadas. Com relação as características sensoriais, a aceitação global apresentou uma redução significativa (p<0,05) com a dose 6kGy quando comparada com as doses 0 e 2kGy. No entanto, os atributos de aceitação de cor e textura e a intensidade dos atributos aroma, sabor característico e suculência não foram afetados (p>0,05). Desta forma, o tratamento de irradiação com até 6kGy mostra-se efetivo na redução de microrganismos patogênicos, com leves efeitos sobre as características sensoriais da carne, quando aplicado sobre o camarão congelado e embalado.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-15T11:47:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese.nelson certa.pdf: 11814547 bytes, checksum: 2cbb2aad17bbcac9f45275deb527071a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T11:47:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese.nelson certa.pdf: 11814547 bytes, checksum: 2cbb2aad17bbcac9f45275deb527071a (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / A ocorrência de tolerância por parte dos micro-organismos contaminantes de alimentos a agentes e/ou tratamentos antimicrobianos clássicos, impõe a busca de tecnologias alternativas para emprego na conservação de alimentos, a exemplo dos óleos essenciais, em especial aqueles obtidos da espécie Rosmarinum officinalis L. (OERO). A ação antimicrobiana do OERO tem sido atribuída ao 1,8-cineol (CIN) frequentemente citado como seu constituinte majoritário. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da exposição a concentrações subinibitórias do OERO e CIN na modificação da tolerância direta e cruzada de algumas bactérias contaminantes de alimentos (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella Typhimurium). Ainda, foi avaliada a influência dos fatores sigma alternativos σS e σB na tolerância de E. coli MG1655 e L. monocytogenes EGDe, e seus mutantes isogênicos E. coli MG1655 ΔrpoS e L. monocytogenes EGD-e ΔsigB, frente ao OERO e ao óleo essencial de Origanum vulgare L. (OEOV) bem como na modificação da tolerância bacteriana direta e cruzada ao campo elétrico pulsado (CEP). Para isso, foram realizados ensaios de determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e de modificação da tolerância direta e cruzada após exposição das cepas às concentrações subinibitórias (sub-CIMs) (1/2 CIM e 1/4 CIM) do OERO ou do CIN em caldo base carne (18 h) e em modelo base carne (72 h). Para os ensaios de verificação de injúria subletal e interferência dos fatores sigma na tolerância bacteriana, células de E. coli MG1655 e L. monocytogenes EGD-e foram expostas a concentrações inibitórias do OERO ou OEOV para, em seguida, serem cultivadas em meios adicionados de agentes seletivos (NaCl ou sais de bile). Os valores de CIM variaram entre 20 e 40 μL/mL e 40 e 80 μL/mL para o OERO e CIN, respectivamente. Os ensaios de modificação de tolerância não revelaram aumento de tolerância direta e cruzada nas cepas bacterianas testadas. A CIM do OERO e OEOV frente às células mutantes foi menor daquele encontrado frente às células parentais. As células mutantes também apresentaram maior diminuição da sua viabilidade quando tratadas com os óleos essenciais (OES) em relação às células parentais, bem como maior proporção de células apresentando lesão subletal. Ainda, as células mutantes mostraram maior sensibilidade ao CEP quando comparadas as parentais. A ausência dos fatores sigma diminuiu a tolerância direta e ao CEP nas células pré-expostas ao OES em sub-CIMs. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que: i) a exposição das cepas bacterianas a sub-CIMs do OERO ou CIN não aumentou a tolerância direta e cruzada; ii) os fatores sigma σS e σB influenciaram a sensibilidade das cepas de E. coli MG1655 e L. monocytogenes EGD-e, respectivamente, frente ao OERO e OEOV ao CEP; e iii) os fatores sigma não influenciaram no aumento da tolerância bacteriaia direta e cruzada ao CEP. Estes resultados demonstram o potencial do OERO e do CIN para uso como antimicrobiano na conservação de alimentos, quando considerado o seu efeito inibitório sobre bactérias contaminantes de alimentos e a ausência de indução de aumento na tolerância bacteriana direta e cruzada. / The occurence of tolerance in food contaminant microorganisms to agents and/or classic antimicrobial treatments has required the search of alternative technologies for use in food preservation, such as essential oils, especially those obtained from the specie Rosmarinum officinalis L. (ROEO). The antimicrobial action of ROEO has been attributed to 1.8-cineol (CIN), frequently cited as its main constituent. The aim of this study was to investigate the effect of exposure to subinhibitory concentrations of ROEO and CIN on the modification of direct tolerance and cross-tolerance of some food-contaminant bacteria (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella Typhimurium). Still, the influence of alternative sigma factors σS and σB on tolerance of E. coli MG1655 and L. monocytogenes EGD-e, and its isogenic mutant E. coli MG1655 and L. monocytogenes EGD ΔrpoS and ΔsigB to the ROEO and the essential oil of Origanum vulgare L. (OVEO), as well as direct on the modification of the bacterial direct tolerance and cross tolerance the pulsed electric field (PEF) were investigated. For this, assays to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the modification of the direct tolerance and the cross-tolerance after exposure of the strains to subinibitory concentrations (sub-MICs) (1/2 MIC and 1/4 MIC) of ROEO or CIN in meat broth (18 h) and model based meat (72 h) were performed. For verification of sublethal injury and interference of sigma factors on bacterial tolerance, E. coli MG1655 cells and L. monocytogenes EGD-e were exposed to inhibitory concentrations of ROEO or OVEO and further cultivated in media added selective agents (NaCl or bile salts). The MIC values ranged between 20 and 40 μL/mL and 40 to 80 μL/mL for ROEO and CIN, respectively. The tolerance modified assays revealed no increase in either the direct tolerance or the cross-tolerance in the tested bacterial strains. The MIC of ROEO and OVEO against the mutant cells was lower than that found against the parental cells. Mutant cells showed also a greater decrease in viability when treated with essential oils (EOS) compared to the parental cells, as well as a higher proportion of cells with sublethal injury. Still, the mutant cells showed higher sensitivity to PEF when compared to parental cells. The absence of sigma factors decreased the direct tolerance and tolerance to the PEF in cells pre-EOS exposed to sub-MIC. The results of this study show that: i) exposure of the bacterial strains to sub-MICs of ROEO or CIN did not increase the direct or the crosstolerance; ii) the sigma σS and σB factors influenced the sensitivity of strains of E. coli MG1655 and L. monocytogenes EGD-e, respectively, to the OVEO and ROEO and PEF; and i) the sigma factors did not influence the increase in direct bacterial tolerance and cross tolerance to the PEF. These results demonstrate the potential of ROEO and CIN for use as antimicrobials in food preservation, when considering their inhibitory effect on bacterial foodcontaminants and the absence of induction to direct or cross bacterial tolerance.

Pela utilização de métodos bioquímicos, biofísicos, de tipagem sorológica e de visualização das proteínas totais bacterianas, isolados de surubim Pseudoplatystoma corruscans, tilápia Oreochromis niloticus e pacu Piaractus mesopotamicus, foram caracterizados, identificados e sua virulência determinada. Dentre as linhagens de referência, o isolado de surubim caracterizou-se como sendo Plesiomonas shiguelloides e os demais isolados de tilápia e pacu foram identificados como Aeromonas hydrophila, todos pertencentes à família Vibrionaceae. Os isolados de tilápia e pacu caracterizaram-se como linhagens virulentas, resistentes aos antibióticos ampicilina, amoxicilina, lincomicina, novobiocina, oxacilina, penicilina, rifampicina e trimetoprim+sulfametoxazol, em ensaios de antibiograma realizados em meio YEA que evidenciaram que as linhagens isoladas de peixes são resistentes a oito das dezessete substâncias antimicrobianas testadas pelo método de difusão em disco. Essas características são compatíveis com as apresentadas pelo espécime tipo de A. hydrophila. Ambas as linhagens quando cultivadas em meio YEA compartilharam a mesma banda de aproximadamente 33,61kDa com o espécime tipo para A. hydrophila. Em meio enriquecido com glucose, a banda compartilhada entre elas teve peso molecular aproximado de 144,28kDa. Os testes de aglutinação sorológica evidenciaram nestas duas linhagens a presença de antígenos estáveis ao calor do tipo O. A técnica de dupla imunodifusão de Ouchterlony demonstrou que o antígeno preparado a partir do isolado de tilápia é a linhagem de A. hydrophila mais indicada para ser utilizada em estudos visando o desenvolvimento de uma vacina polivalente. / Bacteria isolated from surubim Pseudoplatystoma corruscans, tilapia Oreochromis niloticus e pacu Piaractus mesopotamicus, were characterized and identified by biochemical, biophysical, serology, and SDS-PAGE, and their virulence observed. The strain isolated from surubim was characterized as Plesiomonas shigelloides. The other strains isolated from tilapia and pacu were Aeromonas hydrophila. The isolated A. hydrophila strains presented virulence and resistance against the follow antibacterial substances: ampicillin, amoxicillin, lincomicin, novobiocin, oxacillin, penicillin, rifampin and trimetoprim+sulfametoxazole. Both strains when cultivated in YEA medium shared with the A. hydrophila type strain a similar protein band of 33,61kDa. In a medium supplemented with glucose, only one protein exhibiting relative molecular mass of 144.28 kDa, was shared by the type strains isolated from fish and the type strain. The serology tests revealed that all isolated strains presented heat-stable O-antigens. The Ouchterlony double-immunodiffusion showed that the antigen prepared from the tilapia strain possessed surface antigens similar to A. hydrophila type strain and the strains isolated from pacu. This suggested the possibility of development and usage of a common or polyvalent vaccine for A. hydrophila among tilapia and pacu or other freshwater fish species.

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf – 810, Xf – 818 e Xf – 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf – 810 e Xf – 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf – 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf – 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N–terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf – 810, Xf – 818 and Xf – 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf – 810 and Xf – 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf – 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf – 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf - 810, Xf - 818 e Xf - 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf - 810 e Xf - 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf - 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf - 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N-terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf - 810, Xf - 818 and Xf - 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf - 810 and Xf - 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf - 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf - 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica limitada ao xilema, que tem afetado um grande número de plantas no Brasil e no mundo. Muitos trabalhos já foram realizados sobre esta bactéria, mas pouco se conhece a respeito da adesão, colonização e expressão dos sintomas. Os objetivos deste trabalho foram: a) através do uso da microscopia eletrônica e de luz, determinar e relacionar o número de vasos colonizados de citros, cafeeiro e ameixeira com a sintomatologia em folhas; b) estudar a adesão, migração radial e colonização dos vasos do xilema do pecíolo de folhas de citros pela bactéria; c) estudar algumas variáveis experimentais que afetam a expressão dos sintomas em fumo; d) verificar os sítios de ligação da bactéria em cigarrinhas vetores; e) estudar a adesão e a formação do biofilme por X. fastidiosa em superfície de poliestireno, como uma nova metodologia. Os resultados mostraram em ameixeira e cafeeiro uma relação entre o número de vasos colonizados e a expressão de sintomas necróticos, relação esta que não pode ser observada para citros, o qual apresentava um número de vasos colonizados do pecíolo bem menor que o das outras duas espécies. No estudo da bactéria nos vaso do xilema de citros foi possível verificar as diversas fases do processo de colonização do xilema, bem como a capacidade da bactéria em degradar a parede celular primária da pontuação e migrar para os vasos adjacentes. Neste estudo foi também possível verificar respostas da planta à bactérias caracterizadas pela produção de cristais no lúmen dos vasos do xilema e o acúmulo de goma e hiperplasia de células nas folhas. No estudo com variedades de fumo verificou-se que a cultivar Havana apresentou expressão de sintomas mais intensa que as variedades TNN e RP1 e que o aparecimento dos mesmos não foi influenciado pelo volume de inóculo e pelo local de inoculação, mas sim pela adubação com sulfato de amônio, a qual retardou o aparecimento dos sintomas e reverteu os sintomas inicias em folhas após a aplicação. Em cigarrinhas, células bacterianas com morfologia similar as de X. fastidiosa, foram visualizadas aderidas pela parte lateral na câmara do cibário (sulco longitudinal, parede lateral e membrana do diafragma) de Acrogonia citrina, e Oncometopia facialis, no canal do apodeme de Dilobopterus costalimai e pela parte polar no precibário de O. facialis. Finalmente, no estudo da adesão de X. fastidiosa a película de poliestireno, os resultados revelaram as várias fases da formação do biofilme, aspectos da sua arquitetura, e indicaram que a técnica é uma ferramenta adequada para o estudo da formação do biofilme e também da morfologia das bactérias. Os resultados são discutidos em termos de modelos de adesão e colonização, da bactéria e importância para o conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da bactéria em plantas e transmissão pelos vetores. / X. fastidiosa is a xylem-limited bacterium that has been affecting a high number of plants in Brazil and in the world. A lot of researches were already accomplished on this bacterium, but little is known regarding the adhesion, colonization and expression of the symptoms in plants. The objectives of this work were: a) through the use of electron microscopy and of light microscopy determine and to correlate the number of xylem colonized vessels of petiole of sweet orange, coffee and plum with chlorosis and leaf scorching in leaves; b) study the adhesion, radial migration and colonization of the vessels of the petiole xylem of sweet orange by the bacterium; c) study some experimental variables that affect the expression of symptoms in tobacco; d) verify the retention sites of the bacterium in sharpshooters; d) study the adhesion and biofilm formation by X. fastidiosa on polystyrene surface. The results showed a relationship between the number of colonized vessels in plum and coffee and the expression of necrotic symptoms. However, that relationship was not observed for sweet orange, which presented a number of colonized vessels smaller than the other two species. In the study of the bacterium in the xylem vessels of sweet orange it was possible to verify the several phases of the colonization process of the xylem as well as the ability of the bacterium to degrade the primary cell wall of the pit and migrate to adjacent vessels. It was also possible to verify responses of the plant to the bacterium characterized by the production of crystals in the lumen of the xylem vessels and gum accumulation and hyperplasia in the leaf cells. Regarding the tobacco varieties it was verified that the expression of symptoms is more intense in the cultivar Havana than in the cultivars TNN and RP1. It was also seen that symptoms expression was not influenced by the inoculum volume or the inoculation place, but it was altered by fertilization with ammonium sulfate, which delayed the beginning of the symptoms and reverted the symptoms in leaves after the application. In sharpshooters, bacterial cells exhibiting morphology similar to X. fastidiosa were visualized attached to the lateral side in the cibarium camera (longitudinal, lateral wall and membrane of the diaphragm) of Acrogonia citrina, and Oncometopia facialis, in the apodemal channel of Dilobopterus costalimai, and in the polar part in the pre-cibarium of O. facialis. Finally, in the study of the adhesion of X. fastidiosa on polystyrene surface, the results revealed the several phases of biofilm formation; aspects of its architecture, and it also indicated that the technique is an appropriate tool to study of the formation of biofilms and also of the bacterial morphology. The results are discussed regarding adhesion models, colonization, and distribution of the bacterium in the plant and the importance of knowing the pathogenicity mechanisms of X. fastidiosa and its transmission by the insect vectors.

X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica limitada ao xilema, que tem afetado um grande número de plantas no Brasil e no mundo. Muitos trabalhos já foram realizados sobre esta bactéria, mas pouco se conhece a respeito da adesão, colonização e expressão dos sintomas. Os objetivos deste trabalho foram: a) através do uso da microscopia eletrônica e de luz, determinar e relacionar o número de vasos colonizados de citros, cafeeiro e ameixeira com a sintomatologia em folhas; b) estudar a adesão, migração radial e colonização dos vasos do xilema do pecíolo de folhas de citros pela bactéria; c) estudar algumas variáveis experimentais que afetam a expressão dos sintomas em fumo; d) verificar os sítios de ligação da bactéria em cigarrinhas vetores; e) estudar a adesão e a formação do biofilme por X. fastidiosa em superfície de poliestireno, como uma nova metodologia. Os resultados mostraram em ameixeira e cafeeiro uma relação entre o número de vasos colonizados e a expressão de sintomas necróticos, relação esta que não pode ser observada para citros, o qual apresentava um número de vasos colonizados do pecíolo bem menor que o das outras duas espécies. No estudo da bactéria nos vaso do xilema de citros foi possível verificar as diversas fases do processo de colonização do xilema, bem como a capacidade da bactéria em degradar a parede celular primária da pontuação e migrar para os vasos adjacentes. Neste estudo foi também possível verificar respostas da planta à bactérias caracterizadas pela produção de cristais no lúmen dos vasos do xilema e o acúmulo de goma e hiperplasia de células nas folhas. No estudo com variedades de fumo verificou-se que a cultivar Havana apresentou expressão de sintomas mais intensa que as variedades TNN e RP1 e que o aparecimento dos mesmos não foi influenciado pelo volume de inóculo e pelo local de inoculação, mas sim pela adubação com sulfato de amônio, a qual retardou o aparecimento dos sintomas e reverteu os sintomas inicias em folhas após a aplicação. Em cigarrinhas, células bacterianas com morfologia similar as de X. fastidiosa, foram visualizadas aderidas pela parte lateral na câmara do cibário (sulco longitudinal, parede lateral e membrana do diafragma) de Acrogonia citrina, e Oncometopia facialis, no canal do apodeme de Dilobopterus costalimai e pela parte polar no precibário de O. facialis. Finalmente, no estudo da adesão de X. fastidiosa a película de poliestireno, os resultados revelaram as várias fases da formação do biofilme, aspectos da sua arquitetura, e indicaram que a técnica é uma ferramenta adequada para o estudo da formação do biofilme e também da morfologia das bactérias. Os resultados são discutidos em termos de modelos de adesão e colonização, da bactéria e importância para o conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da bactéria em plantas e transmissão pelos vetores. / X. fastidiosa is a xylem-limited bacterium that has been affecting a high number of plants in Brazil and in the world. A lot of researches were already accomplished on this bacterium, but little is known regarding the adhesion, colonization and expression of the symptoms in plants. The objectives of this work were: a) through the use of electron microscopy and of light microscopy determine and to correlate the number of xylem colonized vessels of petiole of sweet orange, coffee and plum with chlorosis and leaf scorching in leaves; b) study the adhesion, radial migration and colonization of the vessels of the petiole xylem of sweet orange by the bacterium; c) study some experimental variables that affect the expression of symptoms in tobacco; d) verify the retention sites of the bacterium in sharpshooters; d) study the adhesion and biofilm formation by X. fastidiosa on polystyrene surface. The results showed a relationship between the number of colonized vessels in plum and coffee and the expression of necrotic symptoms. However, that relationship was not observed for sweet orange, which presented a number of colonized vessels smaller than the other two species. In the study of the bacterium in the xylem vessels of sweet orange it was possible to verify the several phases of the colonization process of the xylem as well as the ability of the bacterium to degrade the primary cell wall of the pit and migrate to adjacent vessels. It was also possible to verify responses of the plant to the bacterium characterized by the production of crystals in the lumen of the xylem vessels and gum accumulation and hyperplasia in the leaf cells. Regarding the tobacco varieties it was verified that the expression of symptoms is more intense in the cultivar Havana than in the cultivars TNN and RP1. It was also seen that symptoms expression was not influenced by the inoculum volume or the inoculation place, but it was altered by fertilization with ammonium sulfate, which delayed the beginning of the symptoms and reverted the symptoms in leaves after the application. In sharpshooters, bacterial cells exhibiting morphology similar to X. fastidiosa were visualized attached to the lateral side in the cibarium camera (longitudinal, lateral wall and membrane of the diaphragm) of Acrogonia citrina, and Oncometopia facialis, in the apodemal channel of Dilobopterus costalimai, and in the polar part in the pre-cibarium of O. facialis. Finally, in the study of the adhesion of X. fastidiosa on polystyrene surface, the results revealed the several phases of biofilm formation; aspects of its architecture, and it also indicated that the technique is an appropriate tool to study of the formation of biofilms and also of the bacterial morphology. The results are discussed regarding adhesion models, colonization, and distribution of the bacterium in the plant and the importance of knowing the pathogenicity mechanisms of X. fastidiosa and its transmission by the insect vectors.