Les tests moléculaires sont fréquemment demandés pour le diagnostic et le suivi des maladies infectieuses dans les pays développés. Cependant, sa disponibilité reste limitée dans les pays à ressources limitées dû à des contraintes de coûts, des technologies et des ressources humaines. Dans les régions éloignées, un accès limité aux installations de laboratoire constitue également un problème majeur. Le développement de méthodes de PCR sur plateformes ouvertes dans des laboratoires de référence tels que le Centre MURAZ au Burkina-Faso et l'utilisation d’échantillons de sang total capillaires sur DBS peuvent faciliter l'accès aux tests moléculaires.Selon la directive de l'OMS, la quantification de l'ARN du VIH à l'aide de DBS peut être une alternative dans les contextes d’accès difficile au laboratoire. Une préoccupation majeure est la spécificité sous-optimale de l’utilisation des DBS en raison de l'interférence de l'ADN du VIH archivé dans des cellules infectées sur la charge virale ARN du VIH. Dans une première étude, nous avons déterminé le niveau d'ADN du VIH-1 qui entravait la fiabilité de la quantification de l'ARN du VIH-1 sur des DBS. Une détection d'ARN du VIH-1 faussement positif (22/62, 35%) a été associée à des niveaux élevés d'ADN de VIH-1. Nos résultats indiquent que la spécificité des tests d'ARN du VIH-1 sur les DBS devrait être évaluée suivant les protocoles du fabricant sur les échantillons avec des niveaux d'ADN de VIH-1 de ≥1 000 copies / 106 cellules mononuclées du sang périphérique.Outre les infections fréquemment diagnostiquées, il est urgent d'intensifier la recherche d’infections négligées comme la leptospirose. Dans une seconde étude, nous avons exploré la leptospirose par des tests sérologiques et moléculaires comme cause négligée de maladie chez les patients atteints d’ictère fébrile au Burkina Faso. Les résultats ont montré pour la première fois que la leptospirose est une cause insoupçonnée de maladie fébrile aiguë dans ce pays semi-aride.Dans la dernière partie du doctorat, nous avons développé un test de PCR multiplex pour le diagnostic de la méningite à herpès simplex virus (HSV) et à Mycobacterium tuberculosis (MTB) chez des patients suspects de méningite aseptique. Cette qPCR qui a permis de tester dans un seul essai HSV 1/2 et MTB était très spécifique, sensible et reproductible. La concentration d'ADN la plus faible donnant 100% de signal de détection a été estimée à 2,12 copies / μl pour HSV1, 1,76 pour HSV2 et 2,15 copies / μl pour MTB. Parmi les 202 échantillons de LCR inclus dans cette étude, 5 (2,46%) étaient positifs: 2 (0,99%) pour HSV et 3 (1,47%) pour MTB. Ce test peut être particulièrement utile dans les cas de méningite / encéphalite avec un faible nombre de globules blancs dans le CSF.Notre projet a montré l'importance de la mise en œuvre de nouvelles méthodes moléculaires pour fournir des données préliminaires sur le fardeau des maladies infectieuses, y compris la leptospirose, la tuberculose et la méningite à HSV au Burkina Faso. Le DBS est un spécimen alternatif qui facilite l'accès aux tests moléculaires mais nécessite des études de validation. Les approches syndromiques doivent être testées et mises en œuvre dans les pays à ressources limitées en se basant sur l'expertise locale et la mise en œuvre de méthodes moléculaires dans les laboratoires de référence. / Molecular assays are frequently requested for the diagnosis and monitoring of infectious diseases. While nucleic acid testing is the standard of care in developed countries, its availability remains limited and constrained by cost, technologies, and human resources in many settings, including West Africa. In remote areas, limited access to laboratory facilities is also a main issue. The development of PCR methods on open polyvalent platform in reference laboratories such as the Centre Muraz in Burkina-Faso and the use of capillary whole blood collected on DBS specimens can facilitate access to nucleic acid testing.According to WHO guideline HIV-RNA quantification using DBS can be considered in settings where there is a lack of access to sites or nearby laboratory facilities for nucleic acid test. A major concern is the suboptimal lower specificity of DBS due to the interference of HIV-DNA copies archived in infected cells with HIV-RNA copies. In the first study we determined the HIV-1 DNA level that interfered with the reliability of HIV-1 RNA quantification on DBS specimens used for therapeutic monitoring (1). False-positive HIV RNA detection (22/62, 35%) was associated with high HIV-1 DNA levels. Our results indicate that the specificity of HIV-1 RNA assays on DBS should be evaluated following manufacturer protocols on samples with HIV-1 DNA levels of ≥1,000 copies/106 peripheral blood mononuclear cells.Beside infections frequently tested by nucleic acid tests there is an urgent need to scale up assay for neglected infection such leptospirosis. In the second study we explored leptospirosis by serological and molecular testing as a neglected cause of disease among patients with febrile icteric illness in Burkina Faso. The results showed for the first time that leptospirosis is an unsuspected cause of acute febrile illness in this semi-arid country.In the last part of the PhD, we developed a multiplex PCR assay for the diagnosis of tuberculosis and Herpes Simplex (HSV) meningitis among patients with suspected aseptic meningitis. This qPCR which allowed to test in a single run HSV 1/2 and M. tuberculosis was highly specific, sensitive and reproducible. The lowest DNA concentration giving 100% detection signal was estimated at 2.12 copies/µl for HSV1, 1.76 for HSV2 and 2.15 copies/µl for M. tuberculosis. Of the 202 CSF specimens included in this study, 5 (2.46%) were tested positive: 2 (0.99%) for HSV and 3 (1.47%) for M. tuberculosis. This assay may be especially useful in cases of meningitis/encephalitis with a low number of white blood cells count in the CSF.Our project stresses the importance of the implementation of news molecular methods to provide preliminary data about the burden of infectious diseases including leptospirosis, tuberculosis and HSV meningitis in Burkina Faso. DBS is an alternative specimen that facilitates access to nucleic acid tests but requires validation studies. Syndromic approach need to be tested and implemented in West Africa and should be based on local expertise and implementation of molecular methods in reference laboratories.

La tuberculose est une cause majeure de mortalité chez les enfants infectés par le VIH, représentant plus d'un tiers de la mortalité chez ceux-ci. Il n'existe actuellement pas d’estimation précise de la prévalence du VIH dans le million de cas de tuberculose pédiatrique annuel. Cependant, les décès liés au VIH pourraient représenter jusqu'à 1/5 de tous les décès dus à la tuberculose chez les enfants. Le diagnostic de la tuberculose est difficile chez les enfants du fait de sa nature paucibacillaire et des difficultés de recueil d’échantillons respiratoires. Il constitue un obstacle majeur à l'accès au traitement. Plus de 96% des décès pourraient survenir chez des enfants non traités. Les enfants infectés par le VIH présentent des difficultés diagnostiques accrues et une mortalité plus élevée. Notre objectif principal était de contribuer à l'amélioration du diagnostic de la tuberculose chez les enfants infectés par le VIH par le développement d'un algorithme diagnostic. Ce travail est basé sur l'étude ANRS 12229 PAANTHER 01 qui a recruté 438 enfants séropositifs âgés de 0 à 13 ans suspects de tuberculose dans 8 hôpitaux du Burkina Faso, du Cambodge, du Cameroun et du Vietnam d'avril 2011 à mai 2014. La mortalité était élevée (19,6%) chez les enfants naïfs de traitement antirétroviral (TARV), malgré l'accès au traitement. Elle était plus élevée les cas confirmés par l’Xpert MTB/RIF (Xpert) ou la bacilloscopie. Le traitement antituberculeux était associé à une diminution de la mortalité chez les tuberculoses confirmées et non confirmées et à un retard problématique au début du TARV, celui-ci étant associé à une réduction massive de la mortalité quand débuté durant le premier mois de suivi. L'évaluation de la performance diagnostique de l’Xpert sur des échantillons alternatifs, y compris des aspirations naso-pharyngées (ANP), des échantillons de selles et le string test a montré que la combinaison d’un ANP et d’un échantillon de selles avait une faisabilité (100%) et une sensibilité (75,9%) élevées par rapport aux méthodes standards (crachats ou aspirations gastriques). L’algorithme diagnostique a inclus 11 prédicteurs dont des symptômes et des signes, le contage, les résultats de radiographie pulmonaire (RP) et d'échographie abdominale, ainsi que les résultats du Quantiferon Gold In-Tube (QFT). L’aire sous la courbe de ROC était de 0,866 lorsque Xpert était inclus. Le score développé à partir du modèle avait une bonne performance diagnostique globale. L'interprétation de la RP avait un accord inter-relecteurs médiocre à passable pour la détection de lésions compatibles avec la tuberculose chez les 403 enfants avec toutes les revues disponibles, et une précision diagnostique limitée (sensibilité 71,4%, spécificité 50,0%) pour le diagnostic de la tuberculose chez 51 cas et 151 contrôles vivants sans traitement à 6 mois. Enfin, nous présentons des travaux sur l'utilisation chez les enfants infectés par le VIH du standard de référence recommandé pour les études diagnostiques sur la tuberculose, décrivant les changements dans la classification résultant d'une mise à jour récente et soulignant les limites de ces standards. Ce travail souligne la nécessité d'un diagnostic rapide de la tuberculose chez les enfants infectés par le VIH afin de réduire la mortalité. Il propose d'améliorer le diagnostic par une approche alternative à la confirmation microbiologique et le développement d'un algorithme rapide de décision de traitement chez les enfants à haut risque de mortalité. Il met en évidence les défis pratiques et méthodologiques liés à l'utilisation de la RP et du standard de référence diagnostique dans cette population. Le projet TB Speed permettra la validation externe de l'algorithme chez les enfants infectés par le VIH et contribuera à l'amélioration du diagnostic de la tuberculose et à la réduction de la mortalité chez les enfants en décentralisant la confirmation microbiologique et le diagnostic dans des pays à faible revenu. / Tuberculosis remains a major cause of death in HIV-infected children, accounting for more than 1/3 of mortality in this group. There are currently no estimates of HIV prevalence in the one million childhood tuberculosis cases every year. However, it is estimated that HIV-related deaths account for up to 1/5 of all tuberculosis deaths in children. Due its paucibacillary nature and difficulties in collecting respiratory specimen, tuberculosis diagnostic is challenging in children and is a major barrier hampering access to treatment. It is estimated that more than 96% of tuberculosis death could occur in children not receiving treatment. HIV-infected children present greater diagnostic challenges in a context of higher mortality. The main objective of this thesis was to contribute to the improvement of tuberculosis diagnosis in HIV-infected children by the development of a diagnostic algorithm. This work is based on the ANRS 12229 PAANTHER 01 study which enrolled 438 HIV infected children aged 0 to 13 years presenting with a suspicion of tuberculosis in 8 hospitals from Burkina Faso, Cambodia, Cameroon, and Vietnam from April 2011 to Mai 2014. The mortality was high [50 deaths (19.6%)] in 266 art-naïve children from this study, despite access to antiretroviral and tuberculosis treatment. It was significantly higher in those with bacteriological confirmation by Xpert MTB/RIF (Xpert) or smear microscopy. Introduction of tuberculosis treatment led to decreased mortality in both confirmed and unconfirmed tuberculosis and to delayed ART introduction, which is a problem, as ART was associated with a more than 10-fold reduction in mortality when started during the first month of follow-up. The assessment of the diagnostic performance of Xpert on alternative specimens including nasopharyngeal aspirates (NPA), stool samples, and string tests showed that a combination of NPA and stool samples had high feasibility (100%) and sensitivity (75.9%) and a yield similar to standard specimen collection methods consisting in sputum samples or gastric aspirates. We developed a tuberculosis diagnostic algorithm for HIV-infected children. The model identified 11 predictors including some symptoms and signs, history of contact, chest radiograph (CXR) and abdominal ultrasonography findings, and Quantiferon TB Gold In-Tube (QFT) results. Its area under the receiver operating characteristic curves was 0.839, and 0.866 when Xpert was included. The score developed from the model had a good diagnostic performance overall. CXR interpretation showed poor to fair inter-reader agreement for the detection of lesions consistent with tuberculosis in 403 children with all reviews available, and limited diagnostic accuracy (sensitivity 71.4%; specificity 50.0%) for the diagnosis of tuberculosis in 51 culture confirmed cases and 151 controls alive without treatment at 6 months. At last, we present work on the use of the recommended tuberculosis reference standard for diagnostic studies in HIV-infected children, describing changes in classification occurring from a recent update and highlighting limitations of these reference standards. Overall, this work contributes to highlight the need for an accurate and timely tuberculosis diagnosis in HIV-infected children to reduce mortality. It proposes two major ways to improve diagnosis by an alternative approach to microbiological confirmation and the development of an algorithm for prompt treatment decision in children with a high risk of mortality. It also highlights practical and methodological challenges related to the use of CXR and diagnostic reference standards in this population. The newly funded TB Speed project will enable external validation of the algorithm in HIV-infected children. By decentralizing Xpert performed on NPA and stool in district health systems in low-income countries, it will further contribute to the overall goal of improving tuberculosis diagnosis and reducing mortality in children.

Sur le plan mondial, le nombre de patients infectés par le VIH (PVVIH) sous traitement antirétroviral (TARV) est en constante augmentation. Les pays aux ressources limitées (PRL) sont les plus touchés par l’épidémie et de fortes inégalités existent ce malgré des objectifs ambitieux fixés par les Nations Unies en 2015 (90-90-90). Le suivi biologique nécessaire des patients sous TARV est connu et les avantages de la mesure de la charge virale (CV) sont bien établis en termes de détection précoce de l'échec thérapeutique, de détection de la non-observance au TARV et de prévention de l’accumulation de résistances. Cependant, dans les PRL et notamment en zone décentralisée, l’accès à la mesure de la CV reste très restreint. Les obstacles sont divers : difficulté d’accès pour les patients à un laboratoire en capacité d’effectuer cette mesure, manque en ressources humaines et matérielles. L’utilisation des Dried Blood Spot (DBS) comme support de prélèvement permet de surmonter ces barrières notamment du fait de sa simplicité, de l’absence de nécessité de chaine de froid et de l’utilisation des machines existantes.L’objectif de ce travail de thèse est de proposer et d’évaluer une stratégie afin d’améliorer le suivi virologique des PVVIH sous TARV issus de zones décentralisées de PRL en montrant la faisabilité et la validité d’un système de collecte de DBS afin de donner accès à la mesure de la CV aux patients suivis dans des centres non dotés des machines couteuses et de la logistique nécessaire à la réalisation de celle-ci. Une méta-analyse sur le contrôle virologique en Afrique Sub-saharienne a mis en évidence un taux de succès virologique en « intention de traiter » de 65.4% [61.8_69.1] et de 56.8% [51.3-62.4] à respectivement 12 et 24 mois de TARV ainsi qu’une proportion de succès significativement plus élevée rapportées dans les essais cliniques comparativement à ceux issus des cohortes. Ensuite, plusieurs projets ont été menés afin d’obtenir des résultats dans des conditions de vie réelle dans deux zones géographiques différentes: le Cameroun et le Vietnam. Au Cameroun, une étude menée dans 12 sites décentralisés a permis d’évaluer 2215 patients dont 937 ont été évalués virologiquement. Cette étude a montré un faible taux de rétention avec 63.3%, 53.5% et 39.9% à respectivement 12, 24 et 36 mois de l’initiation du TARV. Le taux de suppression virologique était très bas avec 66.6%, 62.7% et 59.8% à respectivement 12, 24 et 36 mois de TARV. Le profil des résistances virales analysé chez les patients ayant une CV>5000 cp/mL a montré une accumulation importante des résistances virales, s’aggravant au cours du temps et hypothéquant les options. Au Vietnam, deux études incluant 198 et 203 patients, ont été menées afin d’évaluer les performances de la mesure de la CV sur DBS comparativement au plasma. Trois techniques de mesure de la CV issues de deux industriels ont été évaluées. Une sensibilité de 93.3% [81.7–98.6], 90.1% [80.7-95.9] et 54.9% [40.3–68.9] a été trouvé avec respectivement l’ancien et le nouveau protocole fournis par Abbott et le nouveau protocole fourni par Roche (FVE). La spécificité retrouvé a été respectivement de 94.8% [90.0–97.7], 96.2% [91.4-98.8] et 100% [97.5–100]. Ainsi, à travers ces travaux nous avons montré que l’utilisation des DBS est faisable, immédiatement disponible et d’un niveau de performance acceptable. Elle permet d’apporter des données précieuses tant au niveau individuel, collectif que programmatique. L’utilisation des DBS devrait être intégrée à la stratégie d’expansion de l’accès à la CV. Le suivi virologique des patients est un enjeu de Santé Publique majeur dans un contexte d’utilisation en 1ère ligne de TARV de molécules à barrière génétique faible à la résistance, d’augmentation des résistances transmises et acquises et d’un taux d’incidence encore élevé de l’infection. / Worldwide, the number of HIV-infected patients (PLWHA) on antiretroviral therapy (ART) is growing steadily. Low- and Middle-Incomes Countries (LMICs) are the most affected and strong inequalities still exist despite ambitious goals set by the United Nations in 2015 (90-90-90). The required biological monitoring of patients on ART is well known and the benefits of viral load (VL) measurement are well established, in terms of early detection of treatment failure, detection of non-adherence to ART and prevention of resistance accumulation. However, in LMICs and especially in decentralized areas, access to VL measurement remains scarce or unavailable. Barriers are various: difficulty for patients to reach a laboratory able to perform this measurement, lack of human and material resources. The use of Dried Blood Spot (DBS) as a sampling carrier allows to overcome these barriers, in particular because of its simplicity, the lack of the necessity of a cold chain and the use of existing machines. This PhD work aims at proposing and improving virological monitoring of PLWHA on ART living in decentralized areas of LMICs by demonstrating the feasibility and validity of a DBS collection system to provide access to VL measurement for patients followed in centres not equipped with costly machines and the logistics for its realization.A meta-analysis on virological success in Sub-Saharan Africa was conducted. This work showed a virological success rate in "intention to treat" analysis of 65.4%[61.8-69.1] and 56.8%[51.3-62.4] at 12 and 24 months of ART respectively, and a significantly higher proportion of success reported in clinical trials compared to cohorts. Then, several projects were conducted to obtain results in real life conditions in two different settings: Cameroon and Vietnam. In Cameroon, a study conducted in 12 decentralized sites evaluated 2215 PLWHA on ART, 937 of whom were virologically evaluated. This study showed a low retention rate with 63.3%, 53.5% and 39.9% at 12, 24 and 36 months after ART initiation, respectively. Virological suppression rate was also low with 66.6%, 62.7% and 59.8% at 12, 24 and 36 months of ART, respectively. Profiles of HIV Drug Resistance (HIVDR) in patients with VL>5000 cp/mL showed a significant accumulation of viral resistance, worsening over time and hypothecating therapeutic options. In Vietnam, two studies, involving 198 and 203 patients, were conducted to evaluate performance of VL measurement on DBS compared to plasma. Three VL techniques from two manufacturers were evaluated. Sensitivities of 93.3% [81.7-98.6], 90.1% [80.7-95.9] and 54.9% [40.3-68.9] were found with the old and optimized protocol provided by Abbott company and the new protocol provided by Roche company (FVE), respectively. Specificities were 94.8% [90.0-97.7], 96.2% [91.4-98.8] and 100% [97.5-100], respectively. Through this work, we showed that the use of DBS is feasible, immediately available and with an acceptable level of performance. It provides valuable data at the individual, collective and programmatic levels. The use of DBS should be integrated into the strategy of expanding access to VL. Virological monitoring of patients is a major public health challenge in a context of use in first line ART of molecules with a low genetic barrier to HIVDR, an increase of transmitted and acquired HIVDR and a persistently high incidence of infection.

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