Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:30:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318950.pdf: 1737396 bytes, checksum: d20f804ff040d4d253209f0b0f23389a (MD5) Previous issue date: 2013 / No presente trabalho investigou-se a viabilidade da utilização do pool enzimático celulase (E.C. 3.2.1.4), pectinase (E.C. 4.2.2.2) e amilase (E.C. 3.2.1.1), na biopreparação de tecidos felpudos 100% algodão. Foram determinadas as atividades enzimáticas em diferentes condições de processo, variando-se os parâmetros pH, temperatura e tempo de reação, investigando-se ainda a melhor combinação entre as enzimas, com a finalidade de remover constituintes celulósicos e não celulósicos presentes nas fibras de algodão (pectinas e amido). Avaliou-se dois processos de biopreparação, primeiramente com a adição de agentes umectante e sequestrante no início do processo e outro após a reação enzimática. Foi avaliado também o desempenho de uma celulase neutra e dos corantes reativos amarelo 145, vermelho 194 e azul 221 na etapa de tingimento, verificando a eficácia do tingimento e biopolimento simultâneos, através das análises de cor no sistema CIELab e testes de pilling e formação de pó (pilosidade). Para fins comparativos, realizou-se uma preparação alcalina convencional com as condições normalmente utilizadas nas indústrias. A comparação das propriedades dos tecidos, tais como perda de massa, hidrofilidade, grau de alvura, percentual de pectina removida e percentual de residual de amido confirmou que a biopreparação pode ser tão eficaz quanto o processo alcalino convencional. Os resultados mostram que a presença do umectante não interfere na atividade enzimática e melhora a hidrofilidade do tecido. A presença do sequestrante diminui a atividade, promovendo uma redução de 9% na atividade da enzima amilase e 11% na atividade das enzimas pectinase e celulase. Os melhores resultados dos ensaios, em geral, ocorreram ao se utilizar o agente sequestrante após 30 minutos de reação enzimática, temperatura de 65ºC, pH 6,5 e combinação de 66% pectinase, 17% amilase e 17% celulase, resultando em uma diminuição de 81% de pectina no tecido, hidrofilidade instantânea, grau de alvura em torno de 21ºBerger e residual de amido entre 0,10 e 0,14%. Na avaliação da interferência de uma celulase neutra no rendimento dos corantes não foi verificado influência negativa da celulase sobre a montagem dos corantes na fibra celulósica e nem o processo de biopolimento foi afetado quando realizado na presença de corantes reativos. Através dos ensaios realizados em máquina piloto de produção, verificou-se que, utilizando o processo proposto, os resultados dos testes de solidez, pilling e pilosidade atenderam os padrões de qualidade exigidos pela indústria têxtil, e sua viabilidade econômica foi comprovada através de análises de custos <br> / Abstract: The potential for using an enzymatic pool consisting of cellulase (EC 3.2.1.4), pectinase (EC 4.2.2.2) and amylase (EC 3.2.1.1) for the biopreparation of 100% cotton plush fabrics was investigated. The enzymatic activity was determined under different process parameters (pH, temperature and reaction time). A good composition of the three enzymes was found for the best capability for removal non-cellulosic components from cotton fibers (pectins and starch). The influence of sequestering and wetting agents addition over the biopreparation process have been evaluated under two conditions: first by adding the agents early in the process and another after the enzymatic reaction. The performance in the dyeing step has been evaluated for the simultaneous application of a neutral cellulase and reactive dyes (yellow 145, yellow 194 and blue 221), verifying the effectiveness of dyeing through color analysis in the CIELab system, pilling and formation powder testing (hairiness). The results for cotton fabric submitted for biopreparation have been compared with a conventional alkaline process, under conditions normally used in the textile industry. A comparison of the fabrics properties, such as weight loss, hydrophilicity, degree of whiteness, percent pectin removed and residual percentage of starch has confirmed that the bio-preparation can be as effective as the conventional alkaline process. The results have shown that the presence of the wetting agents does not interfere in the enzymatic activity and also improves the hydrophilicity of the fabric. Sequestering agents has demonstrated a negative influence evidenced by a 9% of reduction in the activity for amylase enzyme and around a 11% in the activity for both cellulase and pectinase enzymes. The best results for the tests have been obtained for the conditions: using the sequestering agent after 30 minutes of the beginning of enzymatic reaction, 65°C, pH 6.5 and an enzymatic pool containing 66% of pectinase, 17% of amylase and 17% of cellulase enzymes, resulting in a decrease of 81% of pectin fabric contend, an instantaneous hydrophilicity, around of 21°Berger degree of whiteness, and a residual starch between 0.10 and 0.14%. The combined presence of neutral cellulase enzyme and reactive dyes have not been affected the adherence of dyes on the cellulosic fiber, neither biopolish process was affected when performed in the presence of reactive dyes. Through tests performed on a pilot production machine using the proposed biopreparation process, it has been verified that the test results for strength, hairiness and pilling met the quality standards demanded by the textile industry. The economic feasibility for the bio-preparation process has been also confirmed through a costs analysis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:04:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342011.pdf: 2342565 bytes, checksum: df6ecc2da3888450160540afa2a809c3 (MD5) Previous issue date: 2016 / As enzimas pectinases têm sido amplamente utilizadas em muitossegmentos industriais, como indústria de alimentos, têxtil, papel,antifúngicos, entre outros. Com intuito de aumentar a viabilidade técnicae econômica na utilização destas enzimas em diversos processos, tornasenecessário buscar alternativas para aumentar a estabilidade e aatividade enzimática. Neste contexto, no presente estudo investigou-se ainfluência de gás liquefeito de petróleo (GLP) pressurizado, ou seja, osefeitos das variáveis pressão (30?190 bar), tempo de reação (1?6 h) etaxa de despressurização (20?100 bar/min) sobre as atividadesenzimáticas de pectina liase (PMGL) e pectinametilesterase (PME) deduas pectinases comerciais (Pectinex® Ultra SP-L e Pectinex® Mash),imobilizadas em suporte de gelatina-alginato de sódio e poliuretano,mediante o emprego de metodologia de planejamento de experimentos.Avaliou-se também o rendimento de imobilização, os ciclos dereutilização, a estabilidade térmica em baixas (- 80ºC, -18 ºC e 4 ºC) eem altas temperaturas (25 ºC, 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC e 60 ºC), a aplicaçãona clarificação de suco de pêssego e os ciclos de reutilização noprocesso de clarificação. O complexo enzimático Pectinex® Ultra SP-Limobilizado em suporte de gelatina-alginato ao ser tratado com GLP,obteve aumento de 14 % da atividade de pectina liase (PMGL) e de 19% de pectinametilesterase (PME) quando comparada com a atividadeinicial da enzima, nas condições de 110 bar de pressão, tempo de reaçãode 3,5 h e despressurização de 60 bar/min. Da mesma forma, obteve-seum incremento na atividade residual de pectina liase (Pectinex® Mash)de 38 % quando submetida a uma pressão de 190 bar por 1 hora edespressurizada a uma taxa de 20 bar/min de 11 % sobre a atividade depectinametilesterase a 110 bar por 3,5 h e despressurizada a uma taxa de60 bar/min-1. O complexo enzimático Pectinex® Ultra SP-L imobilizadoem suporte de Poliuretano (PU) ao ser tratado com GLP obteveaumento de 56% de atividade de pectinametilesterase (PME) quandocomparada com a atividade incial da enzima, nas condições de de190 bar pressão, tempo de reação de 6 h e despressurização de20 bar/min O complexo enzimático Pectinex® Mash teve 3 % deaumento de atividade de pectinametilesterase (PME) quando comparadocom a atividade inicial da enzima, nas condições de 110 bar de pressãopor 3,5 h e despressurizada a uma taxa de 60 bar/min. Após o tratamentoem GLP o extrato enzimático Pectinex® Mash imobilizado em gelatinaalginatomanteve aproximadamente 60 % da atividade residual dePMGL até o 6º ciclo de reuso. No entanto, os imobilizados de PME(Pectinex® Mash) e PMGL (Pectinex® Ultra SP-L) mantiveram suasatividades de aproximadamente 40 % até o 5º e 3º ciclo,respectivamente. A PME do complexo Pectinex® Ultra SP-L apresentouaproximadamente 67 % de atividade residual no 2º ciclo. A estabilidadetérmica dos complexos enzimáticos estudados foram avaliados emdiferentes temperaturas, nas formas livre, imobilizada eimobilizada/tratada com gás GLP pressurizado. De modo geral, asenzimas do complexo Pectinex® Mash mostraram-se estáveis em todasas temperaturas estudadas, enquanto que as enzimas do complexoPectinex® Ultra SP-L não mostraram resposta em algumas temperaturasaltas. Este comportamento pode ser devido a rápida desnaturação daproteína que estrutura a enzima. Observou-se um aumento daestabilidade para as enzimas tratadas com fluido pressurizado (GLP),mostrando influencia do gás sobre a estabilidade e atividade enzimática.O gás GLP influenciou positivamente na clarificação de suco depêssego, pois na concentração de enzima de 0,00125 %, a enzima PMEclarificou 26 % a mais o suco em relação ao padrão (apenasimobilizada), e a enzima PMGL clarificou 52,6 % a mais. Desse modo,é possível inferir que a enzima PMGL do complexo comercialPectinex® Ultra SP-L mostrou melhores resultados. Resultadossemelhantes foram obtidos para o complexo Pectinex® Mash. Asenzimas (PME e PMGL) do complexo Pectinex® Mash imobilizadas etratadas com gás GLP apresentaram atividade relativa até o 7º ciclo deutilização tanto para clarificação quanto para redução de turbidez,quando a atividade relativa atingiu 40%. Estes resultados mostram opotencial de aplicação de enzimas imobilizadas e tratadas com gás GLP.<br> / Abstract : Pectinase enzymes have been widely used in many industries, such asthe food, textiles, paper and anti-fungal sectors, to name a few. In orderto increase these enzymes' technical and economical viability in variousprocesses, it is necessary to search for alternatives that will increaseboth the enzymatic activity and stability. In this context, this study hasinvestigated the influence of pressurized liquefied petroleum gas (LPG),or in other words, the effects of variables such as; pressure (30-190 bar),reaction time (1-6h) and depressurization (20-100 bar/min-1) on pectinlyase (PMGL) and pectin methylesterase (PME) enzymatic activitiesfrom two commercial pectinases (Pectinex Ultra SP-L and Pectinex Mash) immobilised in sodium alginate-gelatin and polyurethane carrier,employing the experiments planning methodology. There have beenevaluations of immobilization yield, reuse cycles, thermal stability inlow (-80oC, -18oC and 4oC) and high temperatures (25oC, 30oC, 40oC,50oC and 60oC), as well as clarification applied on peach juice and thereuse cycles on the clarification process. The enzymatic complexPectinex Ultra SP-L immobilized in an alginate-gelatin carrier andtreated with LPG had a 14% increase on pectin lyase (PMGL) activityand a 19% increase on pectin methylesterase (PME) activity whencompared to the enzyme's initial activity at 110bar pressure, 3h30mreaction time and 60bar/min-1 depressurization level. In the same way,there was a 38% increase on the pectin lyase (Pectinex Mash) residualactivity when submitted to 190bar pressure for 1 hour and depressurizedat a 20bar/min-1 rate and at 11% on the pectin methylesterase activity at110bar for 3h30m and depressurized at a 60bar/min-1 rate. Theenzymatic complex Pectinex Ultra SP-L immobilized withPolyurethane (PU) carrier, when treated with LPG, had a 56% increaseon pectin methylesterase (PME) activity when compared to the enzyme'sinitial activity with 190bar pressure, 6h reaction time and 20bar/min-1depressurization. The enzymatic complex Pectinex Mash had a 3%pectin methylesterase (PME) activity increase when compared to theenzyme's initial activity at 100bar pressure for 3h30min anddepressurized at a 60 bar/min-1 rate. After the LPG treatment, theenzymatic extract Pectinex Mash immobilized in alginate-gelatin keptapproximately 60% of PGML residual activity up until reuse cycle 6.However, the immobilized pectinases from PME (Pectinex Mash) andPMGL (Pectinex Ultra SP-L) maintained their activities atapproximately 40% up to cycles 5 and 3, respectively. The Pectinex Ultra SP-L complex's PME presented approximately 67% residualactivity on cycle 2. The enzymatic complex thermal stability wasassessed at different temperatures in free, immobilized andimmobilized/treated forms with pressurized LPG gas. On the whole, thePectinex Mash complex enzymes have presented stability for allstudied temperatures, whereas the Pectinex Ultra SP-L complexenzymes have not responded under some high temperatures. It has beennoticed a stability increase for the enzymes treated with pressurizedfluid (LPG), presenting a gas influence on both the enzymatic stabilityand activity. The LPG gas influenced the peach juice clarificationpositively, since the PME enzyme clarified 26% more juice in relationto the only-immobilized pattern and the PMGL enzyme clarified 52.6%more, both at a 0.00125% enzyme concentration level. Thus, it ispossible to deduce that the PMGL enzyme of the Pectinex Ultra SP-Lcommercial complex presented better results. Similar results have beenobtained for the Pectinex Mash complex. The (PME and PMGL)enzymes from the Pectinex Mash complex immobilized and treatedwith LPG gas presented relative activity up until usage cycle 7 for theclarification, as well as for the turbidity reduction when the relativeactivity reached 40%. Such results present a potential for theimplementation of enzymes immobilized and treated with LPG gas.

As principais matérias-primas do chocolate, obtidas a partir das sementes secas do fruto do cacaueiro (Theobroma cacao), são a manteiga e o líquor de cacau. Para se obter matérias-primas de alta qualidade é necessário que o processo que antecede a industrialização, no caso a fermentação, seja padronizado para que sejam formados nas sementes os precursores de aroma, sabor e cor característica do chocolate. No interior do fruto do cacaueiro são encontradas as sementes envoltas por uma mucilagem composta por: água, pectina, sacarose, glicose, frutose, proteínas, ácidos e sais. O processo fermentativo do cacau ocorre sem qualquer tipo de inóculo ou padronização. Devido a este fato, os padrões de qualidade das sementes obtidas são as mais adversas e muitas vezes a presença de compostos interferentes e não desejáveis são formados ao longo desse caminho. Visando a otimização do processo fermentativo este trabalho teve por objetivo selecionar leveduras de ocorrência espontânea presentes na fermentação do cacau, reinoculá-las no processo natural in locu e comparar com o processo de ocorrência espontânea, avaliando assim o potencial do coquetel de leveduras a ser utilizado futuramente para padronizar o processo. Para tanto, foram isoladas 367 linhagens de leveduras de ocorrência espontânea em duas fazendas no sul da Bahia. As linhagens passaram por uma seleção onde foi implementado um programa de seleção composto por três ensaios: ensaio de crescimento em pectina; análise de Açúcar Redutor Total livre (ART); e avaliação de atividade enzimática. Foi possível selecionar três linhagens de leveduras promissoras com potencial pectinolítico as quais foram testadas in locu no município de Itabuna-BA. O processo de isolamento, seleção e reintrodução das linhagens selecionadas no processo fermentativo do cacau se mostrou uma prática altamente eficaz. Os resultados obtidos com a inoculação inicial de leveduras selecionadas, antecipou os eventos como produção de etanol, ácido acético, drenagem do mel e elevação da temperatura em 24 horas em relação ao controle. / The fundamental raw material to produce chocolate, obtained from dried seeds of cocoa fruit (Theobroma cacao), are butter and cocoa liquor. In order to obtain high quality of raw materials, it is necessary standardize the procedure before industrialization, known as fermentation, so that the aroma, taste and color precursors of chocolate must be formed in the seeds. Inside the fruits exists a white mucilaginous pulp, which covers the beans, it contains water, pectin, sucrose, glucose, fructose, proteins, acids and salts. The fermentation of cocoa seeds occurs in wooden boxes or piles on the ground without any control or standardization. Due to this fact, the quality of the seeds are the most adverse, the presence are often of interfering compounds and undesirable products could be formed along the way. To optimize the fermentation process this study aimed to select pectinolytic yeasts of spontaneous occurrence from cocoa fermentation, re-inoculate them in the natural process and compare with the spontaneously occurring process. Consequently evaluate the yeast cocktail potential as a standard inoculum. Therefore, we isolated 367 yeast strains from spontaneous cocoa fermentation in two different farms in southern Bahia - Brazil. The strains were analyze to a selection-screening program, which consists of three tests: ability to grow in pectin medium; Total free Reducing Sugar Analysis (ARTL); and evaluation of enzyme activity. It was possible to select three yeast strains with promising pectinolitic potential. Those strains were tested in locu in Itabuna-BA, Brazil. The results of that program, selection and re-introduction in the fermentation process proved to be a highly effective practice. The results obtained with the initial inoculation of selected yeasts, could anticipate the fermentation events in 24 hours, such as the production of ethanol, acetic acid, sweating drainage and temperature rise when compared with the control.

La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii est responsable de la pourriture molle de nombreux végétaux. Elle sécrète dans le milieu extérieur toute une batterie d’enzymes capables de dégrader les constituants des parois végétales. La première partie de mon travail concerne les féruloyl estérases FaeD et FaeT. Les féruloyl estérases sont responsables de l’hydrolyse de liaisons ester entre l’acide férulique et les chaînes de xylane ou de pectine. En clivant ces liaisons, elles favorisent une dégradation complète de la paroi végétale. L'importance de ces enzymes nous a conduit à rechercher si D. dadantii produit de telles estérases. Le criblage d’une banque de gènes par un test de détection de l’activité féruloyl estérase a permis d’identifier deux gènes qui ont été caractérisés. Alors que faeT est faiblement transcrit dans toutes les conditions, la transcription de faeD est fortement induite en présence d’acide férulique et contrôlée par le régulateur FaeR. Alors que FaeT est une protéine cytoplasmique, FaeD est sécrétée par le système Out qui permet la sécrétion de nombreuses pectinases. Les enzymes FaeD et FaeT ont été surproduites dans E. coli et leurs principales propriétés biochimiques ont été déterminées. La connaissance de la séquence complète du génome de D. dadantii permet d’aborder des études de génomique fonctionnelle. Cette séquence confirme la présence des gènes codant les pectinases déjà caractérisées et révèle que ce génome code de nouvelles pectinases potentielles. La deuxième partie de mon travail concerne le gène pelN identifié par analyse du génome. Les pectate lyases coupent les liaisons glycosidiques du polygalacturonate par une réaction de β-élimination, générant des produits insaturés. Leur mécanisme d’action nécessite des cations comme cofacteur, en général Ca2+. Après clonage du gène pelN, la protéine PelN a été surproduite dans E. coli. Son activité pectate lyase a été prouvée en montrant sa capacité à produire des dérivés insaturés à partir de polygalacturonate ou de pectines plus ou moins méthylées. Cette étude démontre que PelN est la première pectate lyase utilisant les ions Fe2+ comme cofacteur préférentiel. Chez D. dadantii, l’expression du gène pelN dépend de divers régulateurs affectant la synthèse des pectinases, comme PecS ou GacA. PelN est une protéine extracellulaire sécrétée par le système Out. Ces études contribuent à mieux comprendre le rôle respectif des différentes enzymes impliquées dans la dégradation de la paroi végétale et le fonctionnement coopératif de ce système pluri-enzymatique. / The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii is responsible for soft rot diseases of various plants. It secretes in the external medium a large array of enzymes which are able to degrade the constituents of the plant-cell wall. The first part of my work was related to the féruloyl esterases FaeD and FaeT. Feruloyl esterases are responsible for the hydrolysis of ester linkages between ferulic acid and the xylan or pectin chains. By cleaving these linkages, they improve the complete degradation of the plant-cell wall. The importance of these enzymes led us to search whether D. dadantii produces such esterases. A gene bank screening using a specific detection test for the feruloyl esterase activity allowed us to identify two genes which were characterized. While faeT is weakly transcribed in all the conditions, the faeD transcription is strongly induced in the presence of ferulic acid and it is controlled by the regulator FaeR. Whereas FaeT is a cytoplasmic protein, FaeD is secreted by the Out system responsible for the secretion of several pectinases. The enzymes FaeD and FaeT were overproduced in E. coli and their main biochemical properties were determined. The determination of the complete sequence of the D. dadantii genome makes it possible to develop functional genomic studies. This sequence confirms the presence of genes encoding the previously characterized pectinases and it reveals that this genome encodes new potential pectinases. The second part of my work was related to the gene pelN identified by genome analysis. Pectate lyases cleave the glycosidic bounds in the polygalacturonate chain by a β-elimination reaction, generating unsaturated products. This reaction mechanism requires cations as cofactor, generally Ca2+. After cloning of the gene pelN, the protein PelN was overproduced in E. coli. Its pectate lyase activity was demonstrated by its capacity to produce unsaturated derivatives from polygalacturonate or pectins. This study showed that PelN is the first pectate lyase that uses Fe2+ ions as the preferential cofactor. In D. dadantii, the pelN expression depends on various regulators controlling the pectinase synthesis, such as PecS or GacA. PelN is an extracellular protein secreted by the Out system. These studies contribute to increase the knowledge on the respective role of the different enzymes involved in the degradation of the plant-cell wall and the cooperative interactions in this pluri-enzymatic system.

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Marinonio Lopes Cornelio / Banca: Marcia Maria de Souza Moretti / Resumo: As pectinases são um grupo de enzimas capazes de degradar polissacarídeos pécticos (pectinas). Estas enzimas são utilizadas na indústria de produção de sucos de frutas, vinhos, têxtil, papel, chá, óleos e etc. O presente trabalho teve por objetivo produzir, purificar e caracterizar a pectinase exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) do fun-go termofílico Rhizomucor pusillus. A enzima foi produzida por cultivo submerso e puri-ficada por salting-out e cromatografia. Este método se revelou como o mais adequado empregando 95 % de sulfato de amônio, sendo que com esta técnica foi possível obter a enzima quase livre de contaminantes e com um rendimento de aproximadamente 74 %. Um passo subsequente de cromatografia de interação hidrofóbica é capaz de re-mover os contaminantes remanescentes. A enzima pura possui massa molecular ao redor de 43,5-47 kDa, pH ótimo de 4,0, temperatura ótima de 61 °C, é estável a uma faixa de pH que varia de 3,5 a 6,5, possui estabilidade térmica de 30 até 60 °C e é ati-vada na presença de Ca+2. O ponto isoelétrico da exo-PG é 6,2 e estudos termodinâ-micos mostraram se tratar de uma enzima termofílica, destacando seu tempo de meia-vida t1/2 de 2.310 min., a 50 °C. O perfil da hidrólise foi analisado por eletroforese capi-lar e os estudos indicam que a enzima em estudo apresenta um padrão de hidrólise sequencial (exo). A identificação dos aminoácidos por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e a comparação com bancos de dados revelou a maior identidade dos fragmentos sequenciados da exo-PG de R. pusillus com a enzima correspondente de Aspergillus fumigatus. Os testes de aplicação das enzimas do extrato bruto mostraram um aumento da extração de suco e um auxílio no processo de hidrólise, sendo que este não foi observado com a enzima pura / Abstract: Pectinases are a group of enzymes capable of degrading pectic polysaccharides (pec-tin). These enzymes are used in the industry for production of fruit juices, wines, tex-tiles, paper, tea, oils, etc. This study aimed to produce, purify and characterize an exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) from the thermophilic fungus Rhizomucor pu-sillus. The enzyme was produced by submerged cultivation and purified by chromatog-raphy and salting out. This has proved to be the most appropriate using 95 % ammoni-um sulfate, and with this technique it was possible to obtain the enzyme almost free of contaminants and with a yield of approximately 74 %. A subsequent step of hydropho-bic interaction chromatography is able to remove the remaining contaminants. The pure enzyme has molecular mass around 43.5-47 kDa, optimum pH of 4.0, optimum tem-perature of 61 °C, is stable at a pH range between 3.5 and 6.5, presents thermal stability from 30 to 60 °C and is activated in the presence Ca2+. The isoelectric point of the exo-PG is 6.2 and thermodynamic studies have shown that it is a thermophilic enzyme, highlighting its half-life t1/2 of 2,310 minutes at 50 °C. The profile of hydrolysis was ana-lyzed by capillary electrophoresis and studies indicate that the enzyme in this study has a pattern of sequential hydrolysis (exo). The identification of amino acids by mass spec-trometry MALDI-TOF and a comparison with data banks showed the highest identity of the sequenced fragments of exo-PG from R. pusillus with the corresponding enzyme from Aspergillus fumigatus. The application tests of the enzymes of the crude extract showed increased extra juice extraction and a higher yield in the hydrolysis process, but this was not observed with the pure enzyme / Mestre

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas. / Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.

Le but de ce travail était d'identifier les fonctions régulées par quorum-sensing (QS) chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum. Les effets phytobénéfiques in vitro des souches B518 et TVV3 (isolées du riz) ne sont pas altérées par l'inactivation des molécules signal impliquées dans le QS. La combinaison d'une approche ciblée et d'une approche globale par protéomique montre que le QS régule des fonctions liées à l'adaptation à la plante, notamment à la colonisation racinaire chez B518. Chez TVV3, aucune fonction régulée par QS n'a pu être identifiée mais les gènes impliqués dans le QS sont localisés dans un environnement atypique, constitué de gènes prophagiques. La mise en évidence d'un prophage chez TVV3 a conduit à la caractérisation de phages tempérés chez dix autres souches et au séquençage du premier génome d'un bactériophage isolé d'Azospirillum. Ce travail montre que la régulation de type QS est souche spécifique et révèle la prévalence des phages chez Azospirillum.

<p>Pectinases are a group of enzymes produced by bacteria, fungi, higher plants and animals. Pectinases can modify and degrade pectins, a class of heterogeneous and multifunctional polysaccharides present in middle lamellae and primary cell walls of plants. Pectins have been showed to play diverse roles in cell physiology, growth, adhesion and separation. Pectinases are used technically in the processing of fiber production and fruit juice or wine making. We have studied the mechanisms and applications of pectinases, especially in retting, a microbiological process where bast fibers in flax and other bast fiber cultivars are released from each other and from the woody core.</p><p>A strong correlation was found between the ability to perform retting and the degradation of sparsely esterified pectin, a substrate of polygalacturonase. This led to the conclusion that polygalacturonase plays a key role in the enzymatic retting of flax. We purified and characterized an extracellular polygalacturonase produced by Rhizopus oryzae, a very potent retting organism. The purified enzyme which appeared to be the single active component in retting, has non-methylated polygalacturonan as its preferred substrate. Peptide sequences indicate that the enzyme, like another polygalacturonase (EC. 3.2.1.15), belongs to glycosyl hydrolase family 28. It contains, however, an N-terminal sequence absent from other fungal pectinases, but present in an enzyme from the phytopathogenic bacterium, Ralstonia solanacearum.</p><p>Our finding that removal of calcium ions from the plant material by pre-incubation in dilute acid in enzymatic retting could reduce enzyme consumption by several orders of magnitude, improves the economical feasibility of the enzymatic retting process. Comparisons with different acids showed that the action was mainly pH dependent.</p><p>Pectinases were employed as analytical tools in a study of stored wood discoloration and, together with cellulases, in a mechanical process for making pulp from flax and hemp in paper production. </p>

Pectinases are a group of enzymes produced by bacteria, fungi, higher plants and animals. Pectinases can modify and degrade pectins, a class of heterogeneous and multifunctional polysaccharides present in middle lamellae and primary cell walls of plants. Pectins have been showed to play diverse roles in cell physiology, growth, adhesion and separation. Pectinases are used technically in the processing of fiber production and fruit juice or wine making. We have studied the mechanisms and applications of pectinases, especially in retting, a microbiological process where bast fibers in flax and other bast fiber cultivars are released from each other and from the woody core. A strong correlation was found between the ability to perform retting and the degradation of sparsely esterified pectin, a substrate of polygalacturonase. This led to the conclusion that polygalacturonase plays a key role in the enzymatic retting of flax. We purified and characterized an extracellular polygalacturonase produced by Rhizopus oryzae, a very potent retting organism. The purified enzyme which appeared to be the single active component in retting, has non-methylated polygalacturonan as its preferred substrate. Peptide sequences indicate that the enzyme, like another polygalacturonase (EC. 3.2.1.15), belongs to glycosyl hydrolase family 28. It contains, however, an N-terminal sequence absent from other fungal pectinases, but present in an enzyme from the phytopathogenic bacterium, Ralstonia solanacearum. Our finding that removal of calcium ions from the plant material by pre-incubation in dilute acid in enzymatic retting could reduce enzyme consumption by several orders of magnitude, improves the economical feasibility of the enzymatic retting process. Comparisons with different acids showed that the action was mainly pH dependent. Pectinases were employed as analytical tools in a study of stored wood discoloration and, together with cellulases, in a mechanical process for making pulp from flax and hemp in paper production.

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas. / Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.