Orientador: Eleni Gomes / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Maria de Lourdes T. de M. Polizeli / Resumo: O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas, produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 5,5 e em 55oC. A poligalacturonase bruta apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas de 55 a 60oC. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também ocorreu em pH 5,5 e a 55oC. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5, com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60oC. A enzima purificada foi totalmente inibida por Ca2+, Cu2+, Hg2+ e 80% inibida por Fe2+ e Ag+. Mg2+ estimulou a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem endo/exo misto. O Km com pectina de citrus foi 10,78mg mL-1 e a Vmax foi 2379,04μmolmin-1mg-1. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou modificação de material vegetal, aditivo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase (18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72 hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55oC. Crude polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at pH 6.5, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60oC. This enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was 53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of 3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55oC. The purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to 100%, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60oC. The purified enzyme was totally inhibited by Ca2+, Cu2+, Hg2+ and 80% inhibited by Fe2+ and Ag+. Mg2+ increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%) was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage. The Km with citrus pectin was 10.78mg mL-1 and the Vmax was 2379.04μmolmin-1mg- 1. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents, textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material, animal feed additive and wine and juice processing. / Doutor

No presente trabalho, a produção de pectinases por Aspergillus niger LB-02-SF em estado sólido foi estudada em biorreator de tambor rotativo em escala de bancada. Adicionalmente, a extração e a concentração do extrato enzimático foram avaliadas. Com o extrato concentrado por ultrafiltração, formulações com KCl e glicerol foram testadas quanto à conservação da atividade enzimática e à eficiência no tratamento de sucos de frutas. Com respeito à produção das pectinases em biorreator, os parâmetros de operação avaliados foram: a agitação, a temperatura do cultivo, o volume de ocupação (30, 50 e 70%) e o fluxo específico de ar (0,18, 0,36, 0,54, 0,72 e 0,90 LkgM – litros de ar por kg de meio por minuto). Ensaios sem e com agitação do biorreator (frequência de 1 rpm por 5 minutos, a cada 120 minutos) indicaram que, para o volume de ocupação de 30%, a agitação leva ao aumento do crescimento fúngico e à redução da produção de enzimas, enquanto que com 50% de ocupação, comportamento oposto foi observado. Com 70% de ocupação, não foi observada diferença significativa entre as atividades pectinolíticas obtidas com e sem agitação, sendo que, em ambos os casos, a produção foi prejudicada pela insuficiente aeração do meio. O intervalo entre os eventos de agitação foram avaliados para o volume de ocupação em 70%, não sendo observada diferença significativa na produção de pectinases nos intervalos de 120 minutos (condição padrão) e 90 minutos. Para um intervalo de 60 minutos, a atividade reduziu-se em aproximadamente 58%. Os cultivos com controle de temperatura em 34oC e sem controle indicaram que a produção enzimática foi favorecida com a elevação natural da temperatura do cultivo, um aspecto que pode estar relacionado a uma condição de estresse que levaria à maior produção enzimática. Fluxos específicos de ar entre 0,18 e 0,90 LkgM foram testados em ensaios com 30 e 50% de volume de ocupação do biorreator. Maior crescimento fúngico foi atingido quando o biorreator foi carregado com menor volume de ocupação. Com o fluxo intermediário de 0,54 LkgM, as maiores atividades enzimáticas para ambos os volumes de ocupação foram atingidas; porém, a ocupação de 50% do volume resultou na maior atividade pectinolítica, 178,2 U/g, com uma atividade de 133,4 U/g sendo medida com 30% de ocupação. No estudo sobre a extração de pectinases do meio sólido, com água pH 4, sob agitação de 200 rpm, foi observado que tempos entre 15 e 120 minutos apresentaram resultados similares. Os resultados atingidos apontam que para maior produção enzimática o biorreator deve ser operado com 50% de ocupação, fluxo específico de ar de 0,54 LkgM e intervalos entre as agitações de 120 minutos. Temperaturas de extração de 20, 30 e 40oC não influenciaram na extração de proteínas, porém a atividade de pectinases foi reduzida em 40% a 40oC, possivelmente em razão da termoestabilidade da enzima. Entre as razões de extração sólido / líquido avaliadas, o valor de 1/10 foi a que resultou na maior atividade enzimática solubilizada, sendo recuperados 81% da atividade pectinolítica presente no meio. Nos ensaios de concentração, a ultrafiltração do extrato concentrado sem qualquer tratamento prévio resultou em recuperação de 59% das enzimas e em fluxo final de permeado da ordem de 11 L/m2/h. Por outro lado, o protocolo de operação que incluía o uso de carvão ativado e microfiltração, apresentou recuperação de enzimas de 74% e fluxo final de permeado de 24 L/m2/h, demonstrando a importância dos pré-tratamentos na ultrafiltração. Previamente à preparação das formulações enzimáticas, um volume de 30 L de extrato bruto foi concentrado 103 vezes por ultrafiltração, com recuperação enzimática de 69%, e um extrato com 663 U/mL foi obtido. Este extrato concentrado foi formulado com 20, 30, 40 e 50% (m/m) de glicerol e 2% (m/m) de KCl e avaliado, por 59 semanas, quanto à conservação da atividade a 5°C. Ao final do período de teste, a amostra controle (sem aditivos) teve queda de 25% da atividade além de apresentar contaminação microbiana, enquanto as formulações mantiveram a atividade em torno de 100% durante todo o experimento. A formulação com 50% de glicerol foi utilizada na maceração de uva bordô e na despectinização de sucos de maçã, uva rosada e amora, demonstrando comportamento similar aos encontrados com as preparações comerciais Novozym 33095 e Pectinex Ultra SP-L utilizadas como referência. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. / In the present work, the production of pectinases by Aspergillus niger LB-02-SF in solid-state cultivation was studied using a rotating drum bench bioreactor. Furthermore, extraction and concentration of enzymes by ultrafiltration were evaluated. Formulations with the concentrated extract, KCl and glycerol were assayed with respect to the maintenance of activity level and the efficiency in the treatment of fruit juices. With respect to the production of enzymes in bioreactor, the operational parameters evaluated were agitation, cultivation temperature, occupation volume (30, 50 and 70%) and specific air flow (0.18, 0.36, 0.54, 0.72 e 0.90 LkgM – liter of air per kilogram of medium per minute). Tests without and with agitation of the bioreactor (1 rpm per 5 minutes each 120 minutes) indicated that, with occupation volume of 30%, agitation leads to increasing fungal growth and decreasing enzyme production, whereas with 50% of occupation an opposite behavior was noticed. With 70% of occupation volume, no significant difference was observed among the pectinolytic activities achieved with and without agitation, the production being hindered in both cases by the insufficient aeration of medium. The interval between agitation events was evaluated for an occupation volume of 70% and no significant difference in enzyme production was observed for the intervals of 90 and 120 minutes (standard condition). For the interval of 60 minutes, the activity was reduced in approximately 58%. The cultivations with temperature control at 34oC and without control indicated that enzyme production was favored with the natural increase of medium temperature, an aspect that could be related to a stress condition that would lead to a higher enzyme production. Specific air flows between 0.18 and 0.90 LkgM were evaluated for 30 and 50% of bioreactor occupation volume. Larger fungal growth was observed when the bioreactor was loaded with the smallest occupation volume. With the intermediate flow of 0.54 LkgM, the highest enzyme activities were achieved for both occupation volumes; however, the occupation volume of 50% resulted the higher activity of 178.2 U/g, with an activity of 133.4 U/g being measured for 30% of occupation. The results achivied indicated that for a higher enzyme production, the bioreactor should be conducted with 50% of occupation volume, specific airflow of 0.54 LkgM and interval between the agitations of 120 minutes. In the study on the extraction of pectinases from the solid medium with water pH 4, under agitation, it was observed that extraction times from 15 to 120 minutes presented similar results. The extraction temperatures of 20, 30 and 40oC did not influence protein extraction, but pectinase activity was reduced in 40% at 40oC, possibly due to the low enzyme thermostability. Among the extraction ratios of solid/liquid assessed, the value 1/10 resulted in the highest enzyme activity solubilized, with recovery of 81% of the pectinolytic activity that was present in the medium. In the concentration tests, ultrafiltration of concentrated extract with no previous treatment resulted in 59% of enzyme activity recovery and in a final permeate flux of about 11 L/m²/h. On the other hand, the operation protocol that included the use of activated charcoal, microfiltration and ultrafiltration presented enzyme recovery of 74% and final permeate flux of 24 L/m2/h, results that demonstrate the importance of pre-treatments in this process. Previously to the preparation of enzyme formulations, a volume of 30 L of enzyme extract was 103-fold concentrated by ultrafiltration, with 69% of enzyme recovery, and a final 663-U/mL extract was obtained. This concentrated extract was formulated with 20, 30, 40 and 50% (w/w) of glycerol and 2% (w/w) of KCl and evaluated for 59 weeks with respect to the enzyme activity conservation at 5ºC. At the end of the test period, the blank sample (with no additives) presented an activity decrease of 25% and also microbial contamination, whereas the formulations preserved 100% of the initial activity along the experiment. The 50%-glycerol formulation was used for Bordô grape maceration and for depectinization of apple, Rosé grape and blackberry juices, showing statistically similar results to those obtained with the commercial preparations Novozym 33095 and Pectinex Ultra SP-L used as reference. The results attained in this work pointed out to the possibility of scaling-up this process, from the enzyme production in solid-state cultivation to the achievement of an enzyme formulation that has shown potential to be used in the industry of fruit juice.

Nesse trabalho, isolados fúngicos obtidos de vegetais em decomposição foram testados quanto à sua capacidade de produzir pectinases aplicáveis ao tratamento enzimático de sucos de maçã e de mirtilo. Com base na secreção de endo-poligalacturonase (endo-PG), dois isolados identificados e denominados Aspergillus niger LB23 e Aspergillus fumigatus LB39J foram selecionados para uso em processos em estado sólido e submerso, respectivamente. Os extratos enzimáticos dessas linhagens não apresentam teores de aflatoxinas totais (B1, B2, G1, G2) até um limite de detecção de 2 μg/Kg. A preparação enzimática obtida em cultivo em estado sólido de A. niger LB23 apresentou maiores atividades de endo-PG e exo-poligalacturonase (exo-PG) em pH 4,0, enquanto a reação enzimática com os extratos enzimáticos obtidos em cultivos submersos de A. fumigatus LB39J foram favorecidos em pH entre 4,0 e 5,0, para endo-PG, e 5,0, para exo-PG. Com relação à temperatura de reação da preparação pectinolítica de A. niger LB23, endo e exo-PG mostraram melhores desempenhos nas faixas 40-50°C e 50-60°C, respectivamente. Para as poligalacturonases de A. fumigatus LB39J, definiu-se um intervalo entre 40 e 60°C, para endo-PG, e 60ºC, para exo-PG, como as melhores temperaturas. Quando a estabilidade térmica das poligalacturonases presentes em ambas as preparações foi avaliada, observou-se preservação de cerca de 70% das atividades após 150 minutos de exposição a temperaturas de até 40ºC. Foi avaliada a influência de diferentes concentrações de glicose e pectina sobre os resultados do processo em cultivos em estado sólido com A. niger LB23, sendo observado incremento das atividades de endo e exo-PG em meio com 6% (m/m) de pectina e isento de glicose, atingindo-se 65 unidades por grama de meio seco (U/g) e 198 U/g, respectivamente. Em cultivos submersos com A. fumigatus LB39J, maiores atividades foram obtidas em meio com 20 g/L de pectina e sem glicose: 42 U/mL de endo-PG e 32 U/mL de exo-PG. Nas condições definidas para o processo submerso, foram testados diferentes valores de pH inicial do meio. As máximas atividades foram observadas com pH inicial 3,0 para endo-PG (44 U/mL) e 4,0 para exo-PG (37 U/mL). Adicionalmente, em fermentador de bancada, constatou-se que um valor de pH inicial de 4,0, com o valor mínimo sem controle e, após, com o valor máximo controlado em 3,5, proporcionou as maiores atividades com 81 U/mL de endo-PG e 49 U/mL de exo-PG. Comparando-se os extratos enzimáticos produzidos pelas linhagens selecionadas, verificou-se que as pectinases produzidas por A. niger LB23 foram mais eficientes na hidrólise enzimática das substâncias pécticas presentes nos sucos de maçã e mirtilo, proporcionando, maior redução de turbidez (90 e 40%) e viscosidade (40 e 60%) e aumento na clarificação (90 e 55%). Esses resultados indicam o potencial das pectinases de A. niger LB23 para o tratamento enzimático de sucos de frutas, ressaltando-se que o teor de compostos fenólicos e a capacidade antioxidante dos sucos foram, em sua maior parte, preservados após o tratamento. / In this work, fungus samples isolated from decomposing vegetables were tested with respect to their capacity of producing pectinases to be applied to the enzymatic treatment of apple and bilberry juices. Taking in account the secretion of endo-polygalacturonase (endo-PG), two isolates which were identified and named Aspergillus niger LB23 e Aspergillus fumigatus LB39J were selected for solid-state and submerged cultivations, respectively. The enzymatic extracts from these strains did not present total aflatoxin (B1, B2, G1, G2) levels up to detection limit of 2 μg/Kg. The enzyme preparation obtained from solid-state cultivation of A. niger LB23 showed the largest activities of both endo-PG and exo-polygalacturonase (exo-PG) at pH 4.0, whereas the reaction with submerged A. fumigatus L39J enzymatic extracts was favoured at pH between 4.0 and 5.0 for endo-PG and 5.0 for exo-PG. With respect to the reaction temperature for A. niger LB23 pectinolytic preparation, endo and exo-PG showed the best performances at the ranges 40-50ºC and 50-60ºC, respectively. For A. fumigatus L39J polygalacturonases, a range from 40 to 60ºC, for endo-PG, and 60ºC, for exo-PG, were defined as the best temperatures. When the thermal stability of polygalacturonases present in both preparations was evaluated, preservation of about 70% of activities was observed after exposing the enzymes to temperatures up to 40ºC for 150 minutes. The influence of different glucose and pectin concentrations on the results of the solid-state process with A. niger LB23 was assessed and an increment in endo and exo-PG activities were observed in medium containing 6% (w/w) of pectin and absence of glucose, with activities of 65 units per gram of dry medium (U/gdm) and 198 U/gdm being achieved. In submerged cultivation of A. fumigatus LB39, highest enzyme activities were obtained in medium with 20 g/L of pectin and without glucose: 42 U/mL for endo-PG and 32 U/mL for exo-PG. In the conditions defined for the submerged process, different medium initial pH values were tested. Maximum activities were observed at initial pH of 3.0 for endo-PG (44 U/mL) and 4.0 for exo-PG (37 U/mL). Furthermore, in bench bioreactor, it was observed that an initial pH of 4.0, with uncontrolled minimum value and, afterwards, maximum value controlled at 3.5 led to the largest enzyme production with 81 U/mL of endo-PG and 49 U/mL of exo-PG. By comparing the enzymatic preparations produced by the selected strains, it was noticed that the pectinase produced by A. niger LB23 were more efficient for the hydrolysis of pectic substances present in both apple and bilberry juices, since it improved reduction of turbidity (90 and 40%) and viscosity (40 and 60%) and increasing clarification (90 and 55%), respectively. These results indicate the potential of A. niger LB23 pectinases for the enzymatic treatment of fruit juices, being remarkable that both the level of phenolic compounds and antioxidant capacity of juices were mostly preserved after treatment.

Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2018-10-19T17:25:58Z No. of bitstreams: 2 Juliana_Pagnonceli_2018.pdf: 1171494 bytes, checksum: 7cdad7d4daba3285af407e74a949221c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-19T17:25:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Juliana_Pagnonceli_2018.pdf: 1171494 bytes, checksum: 7cdad7d4daba3285af407e74a949221c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-08-28 / Pectinases are enzymes in increasing use in the industrial sector as in the juice, wine, food, paper and fabric industries. They can be produced by a variety of microorganisms, but the fungi have greater advantages because they adapt to the great variety of substrates, they have a fast growth and they present wide prevalence in the environment. Pectinases act on pectin, which is one of the major components of the cell wall of plants and is rich in galacturonic acid (GalA). Among pectinases, polygalacturonase (PG) degrades the pectin molecule by acting internally and randomly in the chain, releasing oligosaccharides (endo-PG), or by attacking the non-reducing end of the chain, releasing monosaccharides (exo-PG). In view of the above, the objective of this work was to investigate the production of a polygalacturonase from the fungus Penicillium janthinellum VI2R3M, which was isolated from the Atlantic Forest of the West of Paraná, and afterwards, to purify, characterize and test a possible applicability. The enzyme was produced by culturing in Khanna medium, then purified through chromatographic columns and its purity and molecular weight confirmed by electrophoresis under denaturing conditions (SDS-PAGE). Subsequently, the enzyme was biochemically characterized in terms of pH, temperature, influence of metal ions, substrate specificity, hydrolysis products, molecular weight, kinetic parameters (Km, Vmáx, Kcat) and application of juice clarification. A PG was purified after two chromatographic steps involving ion exchange columns (DEAE-Sephadex) and molecular filtration (Sephadex G100). The purity and molecular mass (102.0 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE. The enzyme showed maximum activity at pH 5.0 and temperature at 50 °C, remaining 100% stable at 50 °C for 30 minutes and 80% at pH 3.0 to 5.0 for 24 hours. The Mg2+ metal ion increased enzyme activity significantly. Kinetic parameters, that is, Km, Vmax e Kcat for pectin hydrolysis were 2.56 mg/mL, 163.1 U/mg and 277s-¹, respectively. PG is highly specific for the polygalacturonic acid substrate and generated mono-galacturonic acid, products characteristic of exo-PG action. The clarified juices of orange, apple and mango presented an increase in transmittance at 35, 45, 49%, respectively, with reduction of color in 22, 51, 55%, respectively. In this way, the exo-PG of P. janthinellum VI2R3M has interesting biochemical characteristics for application in juice industries. / Pectinases são enzimas em crescente uso no setor industrial como na indústria de sucos, vinhos, alimentos, papel e tecidos. Podem ser produzidas por uma variedade de microrganismos, mas os fungos apresentam maiores vantagens pois se adaptam a grande variedade de substratos, possuem um rápido crescimento e apresentam ampla prevalência no meio ambiente. As pectinases atuam sobre a pectina, que é um dos principais componentes da parede celular de plantas e é rica em ácido galacturônico (GalA). Entre as pectinases, a poligalacturonase (PG) degrada a molécula de pectina atuando internamente e ao acaso na cadeia, liberando oligossacarídeos (endo-PG), ou por ataque da extremidade não redutora da cadeia, liberando monossacarídeos (exo-PG). Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi investigar a produção de uma poligalacturonase a partir do fungo Penicillium janthinellum VI2R3M, que foi isolado da Mata Atlântica do Oeste do Paraná, e após, purificar, caracterizar e testar uma possível aplicabilidade. A enzima foi produzida através de cultivo em meio Khanna, em seguida foi purificada através de colunas cromatográficas e sua pureza e massa molecular confirmada por eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE). Posteriormente, a enzima foi caracterizada bioquimicamente quanto ao pH, temperatura, influência dos íons metálicos, especificidade ao substrato, produtos de hidrólise, peso molecular, parâmetros cinéticos (Km, Vmáx, Kcat) e verificada a aplicação na clarificação de sucos. Uma PG foi purificada após duas etapas cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica (DEAE-Sephadex) e filtração molecular (Sephadex G100). A pureza e massa molecular (102,0 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE. A enzima apresentou atividade máxima em pH 5,0 e na tempertatura de 50 °C, mantendo-se 100% estável a 50 °C por 30 minutos e 80% em pH 3,0 a 5,0 por 24 horas. O íon metálico Mg2+ aumentou a atividade da enzima significativamente. Parâmetros cinéticos, ou seja, o Km, Vmax e Kcat para hidrólise da pectina foram de 2,56 mg/mL, 163,1 U/mg e 277s-1 respectivamente. A PG é altamente específica para o substrato ácido poligalacturônico e gerou ácido mono-galacturônico, produtos característicos da ação de exo-PG. Os sucos clarificados de laranja, maçã e manga apresentaram aumento da transmitância em 35, 45, 49%, respectivamente, com redução da cor em 22, 51, 55%, respectivamente. Dessa forma, a exo-PG de P. janthinellum VI2R3M possui características bioquímicas interessantes para aplicação em indústrias de sucos.

M.Sc. / Plants have evolved a complex array of biochemical pathways that enable them to recognise and respond to signals from the environment. At present, little is known about the signal transduction pathways that are activated during a plant's response to attack by a pathogen, although this knowledge is central to our understanding of disease susceptibily and resistance. A common form of plant resistance is the restriction of pathogen proliferation to a small zone surrounding the site of infection. In many cases, this restriction is accompanied by localized death of host tissues, known as the hypersensitive response. In addition to local defense responses, many plants respond to infection by activating defenses in uninfected parts of the plant. As a result, the entire plant is more resistant to a secondary infection. This systemic acquired resistance can persist for several weeks or more and often confers crossresistance to unrelated pathogens. Fungal polygalacturonases (PGs) catalyze the fragmentation and the solubilisation of the homogalacturonan in the plant cell wall. These enzymes might have important functions during plant colonization by a fungus. PGs have also been shown to activate plant defense responses, likely because they generate oligogalacturonides with elicitor activity from the plant cell wall. A polygalacturonase inhibiting protein (PGIP), found in the plant cell wall of many plants, forms a specific complex with fungal PGs and favours the accumulation of elicitor-active oligogalacturonides in vitro. An agarose diffusion assay was used to screen the extracts from Verticillium dahliae for PG activity and ensuing inhibition by purified cotton PGIP. Quantitative determination of differences in polygalacturonase activity in the extracts were performed using a reducing sugar assay. There may be more than one isoform of PG present since the polygalacturonases produced by fungi are likely to be to a mixture of exo- and endo-PGs. Polygalacturonase was therefore isolated from 18-day-old culture filtrates of V. dahliae. The enzyme was partially purified by means of ammonium sulphate precipitation and gel chromatography. The band responsible for PG activity was identified and characterized, having a molecular weight of approximately 28-31 kDa, and a pl of 5.1 - 5.9. Kinetic studies indicate a Km of 0.33% and V,„,,of 0.85 pmoles reducing units / min. A commercial preparation of endo-PG from Aspergillus niger was used as a control. This endo-PG had a molecular weight of 68 kDa and a pl point of 3.6 and 5.1, suggesting there were at least two isoforms of endo-PG present. Kinetic studies indicate a K m of 0.33% and V,,„ of 1.07 gmoles reducing units / min.

As principais matérias-primas do chocolate, obtidas a partir das sementes secas do fruto do cacaueiro (Theobroma cacao), são a manteiga e o líquor de cacau. Para se obter matérias-primas de alta qualidade é necessário que o processo que antecede a industrialização, no caso a fermentação, seja padronizado para que sejam formados nas sementes os precursores de aroma, sabor e cor característica do chocolate. No interior do fruto do cacaueiro são encontradas as sementes envoltas por uma mucilagem composta por: água, pectina, sacarose, glicose, frutose, proteínas, ácidos e sais. O processo fermentativo do cacau ocorre sem qualquer tipo de inóculo ou padronização. Devido a este fato, os padrões de qualidade das sementes obtidas são as mais adversas e muitas vezes a presença de compostos interferentes e não desejáveis são formados ao longo desse caminho. Visando a otimização do processo fermentativo este trabalho teve por objetivo selecionar leveduras de ocorrência espontânea presentes na fermentação do cacau, reinoculá-las no processo natural in locu e comparar com o processo de ocorrência espontânea, avaliando assim o potencial do coquetel de leveduras a ser utilizado futuramente para padronizar o processo. Para tanto, foram isoladas 367 linhagens de leveduras de ocorrência espontânea em duas fazendas no sul da Bahia. As linhagens passaram por uma seleção onde foi implementado um programa de seleção composto por três ensaios: ensaio de crescimento em pectina; análise de Açúcar Redutor Total livre (ART); e avaliação de atividade enzimática. Foi possível selecionar três linhagens de leveduras promissoras com potencial pectinolítico as quais foram testadas in locu no município de Itabuna-BA. O processo de isolamento, seleção e reintrodução das linhagens selecionadas no processo fermentativo do cacau se mostrou uma prática altamente eficaz. Os resultados obtidos com a inoculação inicial de leveduras selecionadas, antecipou os eventos como produção de etanol, ácido acético, drenagem do mel e elevação da temperatura em 24 horas em relação ao controle. / The fundamental raw material to produce chocolate, obtained from dried seeds of cocoa fruit (Theobroma cacao), are butter and cocoa liquor. In order to obtain high quality of raw materials, it is necessary standardize the procedure before industrialization, known as fermentation, so that the aroma, taste and color precursors of chocolate must be formed in the seeds. Inside the fruits exists a white mucilaginous pulp, which covers the beans, it contains water, pectin, sucrose, glucose, fructose, proteins, acids and salts. The fermentation of cocoa seeds occurs in wooden boxes or piles on the ground without any control or standardization. Due to this fact, the quality of the seeds are the most adverse, the presence are often of interfering compounds and undesirable products could be formed along the way. To optimize the fermentation process this study aimed to select pectinolytic yeasts of spontaneous occurrence from cocoa fermentation, re-inoculate them in the natural process and compare with the spontaneously occurring process. Consequently evaluate the yeast cocktail potential as a standard inoculum. Therefore, we isolated 367 yeast strains from spontaneous cocoa fermentation in two different farms in southern Bahia - Brazil. The strains were analyze to a selection-screening program, which consists of three tests: ability to grow in pectin medium; Total free Reducing Sugar Analysis (ARTL); and evaluation of enzyme activity. It was possible to select three yeast strains with promising pectinolitic potential. Those strains were tested in locu in Itabuna-BA, Brazil. The results of that program, selection and re-introduction in the fermentation process proved to be a highly effective practice. The results obtained with the initial inoculation of selected yeasts, could anticipate the fermentation events in 24 hours, such as the production of ethanol, acetic acid, sweating drainage and temperature rise when compared with the control.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T14:33:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 282109.pdf: 1433998 bytes, checksum: a9d63e95c8c631a24b36de750b333a1c (MD5) / Neste trabalho uma pectinase alcalina comercial (E.C. 4.2.2.2) foi caracterizada quanto a sua atividade em diferentes tempos de incubação, e na presença de diferentes agentes químicos utilizados na etapa de purga do beneficiamento têxtil, com a finalidade de remover os constituintes não celulósicos presentes nas fibras de algodão, principalmente a pectina. Foram avaliados dois processos de biopurga: um com a adição dos agentes sequestrantes no início do processo e outro, adicionando-os após 30 minutos de tratamento enzimático. Para isso foram testados diferentes tipos de sequestrantes (Quimerol 535 e EDTA). Foi realizada também, para fins comparativos, uma purga convencional alcalina com as condições normalmente utilizadas nas indústrias. A comparação das propriedades dos tecidos, tais como hifrofilidade, brancura e percentual de pectina removida confirmou que a biopurga pode ser tão eficaz quanto o processo alcalino convencional. Os resultados mostram que a presença de EDTA diminui a atividade da pectinase em 85% e que a presença deste no início do processo acarreta em uma diminuição do teor de pectina removida, quando comparado aos outros processos. Os melhores resultados dos ensaios, em geral, ocorreram ao se utilizar o agente sequestrante Quimerol 535 no início do processo de biopurga, resultando em uma diminuição de 60% de pectina no tecido. Deste modo, ao se realizar este mesmo processo, nas mesmas condições, em aparelho de ultrasom, os resultados não apresentaram melhora significativa. / In the present work, a commercial alkaline pectinase (E.C. 4.2.2.2) was characterized by its activity at different incubation times, and having the presence of different chemical agents used in the step of scouring of textile processing, in order to remove non-cellulosic constituents present in cotton fibers, especially pectin. Two bioscouring processes were evaluated: the sequestering agents were added at the beginning and after 30 minutes of the process. Two different types of sequestering agents were tested (Quimerol 535 and EDTA).It was also performed a scouring with conventional alkaline conditions, normally used in industries for comparison matter. Comparing the properties of the fabrics such as: wettability, whiteness and the percentage of pectin removed, confirmed that bioscouring can be as effective as the conventional alkaline process. The results show that the presence of EDTA decreases the pectinase by 85% and its presence at the beginning of the process influences a lower content of pectin removed when compared to other processes. The best results generally occurred when using the sequestering agent Quimerol 535 at the beginning of the bioscouring process, resulting in a decrease of 60% of pectin on the fabric. Thus, when the same process was carried out under the same conditions using an ultrasound equipment, the results showed no significant improvement.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:58:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 325596.pdf: 3398990 bytes, checksum: 333d0e853cd8e1b659b6cfccf1025e51 (MD5) Previous issue date: 2014 / A produção de suco de uva no Brasil tem aumentado a cada ano, pois apenas no Rio Grande do Sul, maior estado produtor de uvas e derivados, a produção de suco passou de 126,9 milhões de litros em 2008 para 220 milhões de litros em 2012.Esses números são bastante relevantes, pois a produção mundial de sucos de uva está estimada entre 11 e 12 milhões de hectolitros. Outras regiões brasileiras têm investido na elaboração de sucos de uvas, como a região do Vale Submédio São Francisco (VSF),localizada no Nordeste do Brasil,onde recentemente empresas têm investido na produção de sucos de uva em escala comercial. Este trabalho teve por objetivo caracterizar os sucos das novas variedades brasileiras de uvas plantadas no VSFe avaliar diferentes condições extração do suco no processo industrial utilizado por empresas desta região,em relação a parâmetros clássicos de qualidade, compostos fenólicos, ácidos orgânicos e atividade antioxidante.O processo de extração do suco a quente sem prensagem do bagaço apresentou um alto rendimento de suco sem a necessidade de prensagem da uva. Os tratamentos de maceração exerceram influenciaram significativamente nos parâmetros de processo como rendimento e limpidez do suco, onde a temperatura de 60°C com adição do preparado enzimático a base de pectinase resultaram num incremento de 6,0% no rendimento e na redução da turbidez. O uso do preparado enzimático diminuiu a concentração de catequina e aumentou adeprocianidinas B1 e B2 nos sucos. O aumento da temperatura de maceração de 50 para 60°C foi o fator que mais contribuiu para a maior extração de compostos fenólicos das películas das uvas, principalmente em relação as antocianinas. A combinação da temperatura de 60°C com o uso do preparado enzimáticona dose 3,0 mL 100 kg-1 de uva resultaram numa maior extração de praticamente todos os compostos fenólicos analisados, bem como no aumento da concentração dos ácidos málico e láctico, e diminuição da concentração do ácido acético dos sucos. Foi observada uma significativa concentração de compostos fenólicos associados à atividade antioxidante in vitro nos sucos das novas variedades brasileiras de uvas plantadas nesta região. O uso dos híbridos "BRSVioleta" e "BRS Cora", em mistura com a "Isabel Precoce", aumentaram significativamente a intensidade de cor, a concentração de fenólicos totais e antocianinas totais do suco formulado, principalmente, em relação a fenólicos como catequina e epicatequina galato, ácidos gálico, ácido caféico, rutina, delfinidina e cianidinas, compostos que foram associados à alta atividade antioxidante encontrada nos sucos. O que faz com queo uso destes "cortes" seja uma prática importante na obtenção de sucos com alta concentração de fenólicos associados a atividades biológicas benéficas à saúde dos consumidores.O híbrido "BRS Cora" além de contribuir com o aumento da cor e compostos fenólicos no suco formulado com "Isabel Precoce", também foi responsável pelo aumento da concentração de ácidos tartárico e málico.A cultivar "BRS Magna" apresentou um bom potencial para ser utilizada em formulações de sucos, uma vez que apresentou uma composição fenólica inferior apenas a "BRS Violeta", variedade com a maior quantidade de fenólicos. Os sucos elaborados apresentaram uma alta concentração de trans-resveratrol, com destaque para o suco da"BRS Violeta" com valores semelhantes a vinhos tintos. De maneira geral a atividade antioxidante dos sucos foi alta, e associada, principalmente, aos fenólicos: catequina, procianidinas B1 e B2, ácido caféico, delfinidina 3-glicosideo e cianidinas mono e diglicosídicas. Portanto se conclui que é possível elaborar sucos de uva com as novas cultivares brasileiras plantadas no Nordeste do Brasil,que apresentem boa concentração de compostos bioativos e características próprias originadas da viticultura tropical praticada no Vale do Submédio São Francisco, que se difere das demais regiões tradicionais do mundo.<br> / Abstract : The Brazilian production of grape juice have been incrasing every year, being Rio Grande do Sul the main state producer of grapes and derivations, the production passed through from 126,9 millions of liters in 2008 to 220 millions of liters in 2012.This number is relevant because the world production of grape juices is estimated around 11 and 12 millions of hectoliters. Other Brazilian regions have invested in the production of grape juice, like Sub-middle region of São Francisco?s Valley (SFV), located at the Norteast of Brazil.Recently, factories have invested in the production of grape juices in comercial large-scale at the region.In this context, this study aimed to characterize the juices of the new Brazilian grape varieties planted in SFV and evaluate different juice extraction conditions in the industrial process used by companies in this region, compared to classic quality parameters, phenolic compounds, organic acids and antioxidant activity. The process used by the companies presented a high juice without the need for pressing grapes. The maceration treatments have any significant influence on process parameters such as yield and clarity of juice where the temperature of 60°C with the addition of the enzyme preparation based pectinase resulted in a 6.0% increase in yield and reduction of turbidity. The use of the enzyme decreased amounts of catechins and increased procyanidins of B1 and B2. Increasing the temperature of maceration of 50 to 60°C was the main cause of the extraction of phenolic compounds from the skins of the grapes, especially the anthocyanins.The combination of 60° C with the use of the enzyme preparation in a dose of 3.0 mL per 100 kg of grapes resulted in better extraction of phenolic compounds evaluated, as well as increased the concentration of malic and lactic acids, and decreased the concentration of acetic acid in the juices.With a base on the results obtained could be observed significant concentration of phenolic compounds associated with the antioxidant activity in vitro on the studied juices. The use of blends between varieties "BRS Violeta" and "BRS Cora", with the variety "Isabel Precoce", increased significantly the intensity of color as well as the total phenolic concentration and total anthocyanins in the finished juice, especially in relation to phenolic catechin, epicatechin gallate, gallic acid, caffeic acid, rutin, delphinidin end cyanidins, compounds that were associated with high antioxidant activity found on juices. That makes of extreme importance the use of these blends in order to elaborate juices with great concentrations of phenolics associated to biological activities which are beneficial to consumers health. The variety "BRS Cora" not only contributed with the increase of color and phenolic compounds in juice "Isabel Precoce", but also was responsible for the increment in the concentration of organic acids as tartaric and malic. The variety "BRS Violeta" was responsible for the greatest increment of phenolics in the juice "Isabel Precoce", as well the variety "BRS Magna" showed a good potential to be used in commercial blends, since it presented a little less phenolic concentration compared to the juice "BRS Violeta".The juices elaborated showed a representative concentration of trans-resveratrol, remarking the juice "BRS Violeta" with values similar to red wines. In a general point of view, the antioxidant activity of juices were high, and were associated, essentially, to the phenolics: catechin, procyanidin B2, caffeic acid, delphinidin 3-glucoside and cyanidins mono and diglucoside. Due to this, it can be concluded that is possible to elaborate grape juices with new Brazilian varieties planted in the Northeast region of Brazil, which have good quantity of bioactive compounds and own original characteristics from the tropical viticulture practiced in the Sub-middle São Francisco's Valley, that differs with any other traditional regions of the world.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2016-01-15T14:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326518.pdf: 3128402 bytes, checksum: 2d904720c503bd76ec13c6f29097da18 (MD5) Previous issue date: 2013 / A presença de impurezas não celulósicas na fibra de algodão cru acarreta ao substrato têxtil dificuldade na absorção de água, o que ocasiona problemas de qualidade nos processos de acabamento, como o tingimento. A retirada destas impurezas é convencionalmente feita pela purga alcalina, utilizando o hidróxido de sódio a altas temperaturas. As condições severas do processo geram efluente com elevado pH e alto nível de DQO, além de ocasionar a degradação da celulose, resultando na diminuição da resistência das fibras. A biopurga enzimática, por sua vez, permite elevada especificidade na remoção das impurezas, não atacando a fibra celulósica e utilizando condições de processo menos severas de temperatura e pH. No presente trabalho foi investigada a utilização enzimas combinadas, celulase (E.C. 3.2.1.4), pectinase (E.C. 4.2.2.2) e lipase (E.C. 3.1.1.3) no processo de biopurga de malha 100% algodão. Para isto, as enzimas foram caracterizadas quanto às suas atividades nas condições ótimas e nas condições propostas para o processo de biopurga, e na presença de um agente quelante. A influência do agente sequestrante no tratamento enzimático também foi analisada ao se estudar dois procedimentos distintos  com a adição do agente químico no início do processo e com a adição deste somente após 30 min de reação enzimática. O efeito de cada enzima e suas interações foi avaliado com o auxílio de um planejamento experimental e a caracterização da malha tratada (perda de massa, grau de alvura, grau de remoção de pectina, resposta ao posterior tingimento e hidrofilidade). Para fins comparativos, realizou-se uma purga alcalina convencional. Os resultados mostram que o sequestrante não interferiu na atividade das enzimas. A biopurga com adição de sequestrante no início do processo e nas condições de pH 6,5 e temperatura 55 °C revelou que a combinação das três enzimas nos pontos máximos do planejamento experimental apresentou os melhores resultados  um grau de alvura de 24,99 Graus Berger, uma remoção de pectina de 87,47% e uma hidrofilidade de 14,67 s. A comparação do tratamento enzimático com a lavagem alcalina por meio da caracterização das malhas, confirmou que a biopurga pode ser tão eficaz quanto o processo convencional.<br> / Abstract : The presence of non-cellulosic impurities in the grey cotton fiber leads to textile substrate difficulty in absorption of water, which causes quality problems in the finishing process, such as dyeing. The removal of these impurities is conventionally done by scouring, using sodium hydroxide at high temperatures. The severe conditions of the process generate a effluent with high pH and high level of COD, beyond causing degradation of the cellulose, resulting in decreased of fiber strength. The enzymatic bioscouring in turn allows high specificity in the removal of impurities, not by attacking the cellulose fiber and using less severe process conditions of temperature and pH. In the present study was investigated the combined use of enzymes, cellulase (E.C. 3.2.1.4), pectinase (E.C. 4.2.2.2) and lipase (E.C. 3.1.1.3) in the bioscouring of 100% knitted cotton fabric. For this, the enzymes were characterized according to their activities in the optimal conditions and the proposed conditions for the bioscouring, and in the presence of a chelating agent. The influence of the chelating agent in the enzyme treatment was also analyzed by studying two different procedures  with the addition of the chemical agent in the begin of the process and with the addition of this only after 30 min of enzymatic reaction. The effect of each enzyme and their interactions was reported with the aid of an experimental design and characterization of treated fabric (weight loss, degree of whiteness, response to subsequent dyeing, degree of pectin removal, wettability). For comparative purposes was made a conventional scouring. The results show that the chelating agent did not affect the activities of the enzymes. The bioscouring with the addition of chelating agent in the begin of the process and conditions of pH 6,5 and temperature 55 °C showed that the combination of the three enzymes in the maximum points of the experimental design presented the best results  a degree whiteness of 24,99 Degrees Berger, a pectin removal of 87,47% and a wettability of 14,67 s. Comparison of enzymatic treatment with the alkaline wash through the knitted fabric characterization, confirmed that the bioscouring can be as effective as the conventional process.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2013-06-25T20:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 308826.pdf: 1082783 bytes, checksum: 3f0b6949d8001c2cd52dcc0666e99740 (MD5) / Nesse trabalho, dezenove leveduras do gênero Kluyveromyces foram testadas quanto à sua capacidade de produzir pectinases. Dentre as linhagens testadas sobressaíram a NRRL-Y-7571, NRRL-Y-6373 e 17D, com diâmetros de halos de 4,6, 4,4 e 4,1cm, respectivamente. As maiores atividades pectinolíticas foram detectadas nas linhagens NRRL-Y-7571(62,79 U.mL-1), seguida por NRRL-Y-6373 (30,88 U.mL-1). Com base na secreção de pectinases totais, a levedura K. marxianus NRRL-Y-7571 foi selecionada para o tratamento enzimático de suco de uva e vinho. A preparação enzimática apresentou maiores atividades pectinolíticas em pH 4,8. Com relação à temperatura de reação da preparação pectinolítica melhores desempenhos foram obtidos nas faixas de 30-40°C. Quanto à estabilidade térmica das pectinases observou-se preservação de cerca de 80% das atividades após 150 minutos de exposição a temperaturas de até 40ºC. Foi avaliada a influência de diferentes concentrações de glicose e pectina sobre a produção de pectinase. Os resultados mostraram que concentrações de pectina de 1 e 2% (m/m) favorecem a produção de PG. Observa-se que os valores obtidos para a atividade de poligalacturonase na presença de 2% (m/m) de pectina (114 U/mL) sofreram uma redução de aproximadamente 50% (60 U/mL) com 1% (m/m) de pectina no meio. Na extração e clarificação de suco de uva, os resultados indicam que o extrato pectinolítico obtido a partir de K. marxianus NRLL-Y-7571 é promissor, contribuindo para características sensorias (cor) e propriedades funcionais. Os resultados mostraram que a adição de enzima no vinho tinto acelerou a extração de compostos fenólicos e antocianinas, apresentando características cromáticas que podem ser consideradas melhores que as do vinho controle. Também, o vinho tratado com a enzima apresentou menor turbidez. Os resultados deste estudo demonstram os benefícios do uso do tratamento enzimático para obter suco de uva e vinho com enzimas pécticas produzidas por leveduras. / A total of ninetten Kluyveromyces strains were evaluated in this study to select highly pectinolytic strains. Among the strains tested highlights the NRRL-Y-7571, NRRL Y-6373, and 17D, with halos diameters of 4.6, 4.4 and 4.1 cm respectively. The highest activities were found in pectinolytic strains NRRL-Y-7571 (62.79 U.mL -1) followed by NRRL-Y-6373 (30.88 U.mL-1). Based on the secretion of total pectinases, yeast K. marxianus NRRL-Y-7571 was selected for the enzymatic treatment of grape juice and wine. The enzymatic preparation showed higher pectinolytic activity in pH 4.8. As to reaction temperature the preparation pectinolytic best performances were obtained in the range of 30-40°C. The thermal stability of preservation pectinases observed around 80% activity after 150 minutes of exposure to temperatures of 40°C. To evaluate the effect of pectin and glucose concentrations on the production of polygalacturonase by the selected strain The results show that pectin concentrations of 1 and 2% (w/w) favor the production of polygalacturonase. It is observed that the values obtained for the activity of polygalacturonase in the presence of 2% (w/w) pectin (114 U/mL) decreased by approximately 50% activity (60 U/ml) with 1% (w/w) pectin in the middle. Results indicate that the pectinolytic extract obtained from K. marxianus NRLL-Y-7571, is promising for grape juice processing, contributing to sensory (color) characteristics and functional properties. The results show that the addition of enzyme in red wines presented chromatic characteristics which can be considered better than those of the control wine, and accelerates the extraction of phenolic compounds and anthocyanins. Also, the wine treated with the enzyme had a lower turbidity. The results of this study demonstrate the benefits of using enzyme treatment to obtain grape juice and wine with pectic enzymes produced by yeast.