Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

O sistema bombesina / peptídeo liberador de gastrina (gastrin-releasing peptide - GRP) está implicado na regulação de vários aspectos neurofisiológicos e comportamentais. Em ambos estudos aqui reportados utilizamos o antagonista dos receptores GRP, (D-Tpi6, Leu13 psi[CH2NH]-Leu14) bombesin (6-14), RC-3095, como ferramenta farmacológica para ampliar o conhecìmento sobre a ação do sistema bombesina / GRP na memória na amígdala basolateral (ABL) e hipocampo. No primeiro estudo demonstramos que os receptores GRP na ABL estão envolvidos na memória aversiva. Ratos Wistar machos adultos foram treinados em tarefa de esquiva inibitória de teste único e avaliados 24 horas após para a retenção da memória. No primeiro experimento, a administração sistêmica do RC-3095 após o treino causou redução da retenção da memória. No segundo experimento, a microinfusão póstreino bilateral de RC-3095 intra-amigdaliana reduziu de maneira dose-dependente a retenção da tarefa. Consistentemente, quando a ABL foi inativada funcionalmente com o agonista GABAérgico muscimol, no terceiro experimento, o efeito da admnistração sistêmica do RC-3095 foi bloqueado. Estes resultados sugerem que a ABL medeia o efeito de inibição da memória aversiva causado pelo bloqueio de receptores GRP. No segundo estudo avaliamos o papel dos receptores GRP no hipocampo dorsal de ratos no medo inato e na formação da memória aversiva. Os ratos receberam microinfusões bilaterais de salina ou RC-3095 no hipocampo dorsal cinco minutos antes do treino em tarefa de esquiva inibitória, sendo testados 24 horas após para a retenção. Foi utilizada esquiva inibitória de múltiplos testes, e o RC-3095 não afetou a aquisição da tarefa; a retenção foi prejudicada na dose de 0,4 μg. Entretanto, em avaliação no aparato do labirinto em cruz elevado, o RC-3095 não demonstrou ter afetado o medo inato ou ansiedade. Em resumo, nossos experimentos indicam que os receptores GRP na amígdala basolateral e hipocampo estão envolvidos na consolidação da memória aversiva em ratos, e que a ABL é uma região crucial na mediação dos efeitos inibidores de memória do antagonista GRP RC-3095. / The bombesin / gastrin-releasing peptide (GRP) receptor system has been implicated in regulating several neurophysiologic and behavioral aspects. In both studies here reported we used the GRP receptor antagonist D-Tpi6, Leu13 psi[CH2NH]-Leu14 bombesin (6-14), RC-3095, as a pharmacological tool in order to extend the knowledge about the actions of bombesin / GRP system in the basolateral amygdala (BLA) and hippocampus in memory. In the first paper we show that GRP receptors in the BLA are involved in the consolidation of aversively motivated memory. Adult Wistar male rats were trained in a single-trial step-down inhibitory avoidance task and tested for retention 24 hours later. In the first experiment, post-training systemic injection of RC-3095 impaired memory retention. In the second experiment, post-training bilateral microinfusion of RC-3095 into the BLA dose-dependently impaired retention. Consistently, when BLA was functionally inactivated by the GABAergic agonist muscimol, in the third experiment, the memoryimpairing effect of RC-3095 was blocked. These results suggest that BLA mediates the memory-impairing effect of GRP receptors. Next, reported in the second paper, we evaluated the role of GRP receptors in the rat dorsal hippocampus in formation of fear-motivated memory and innate fear. Adult male Wistar rats were given a bilateral microinfusion of saline or RC-3095 into the dorsal hippocampus 5 minutes before they were trained in a continuous multiple trial inhibitory avoidance task, and tested 24 hours later. RC-3095 did not affected acquisition, but at the dose of 0,4 μg impaired retention test performance. RC-3095 did not affect innate fear and anxiety assessed in an elevated plus maze. In summary, our experiments indicate that GRP receptors in BLA and hippocampus are involved in regulating aversive memory consolidation in rats, and that the BLA is a crucial area mediating the memory-impairing effects of the GRP antagonist RC-3095.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

A esclerose sistêmica (ES) é uma doença difusa do tecido conjuntivo caracterizada por fibrose e envolvimento vascular, com distúrbio generalizado da microcirculação, podendo resultar em hipertensão arterial pulmonar (HAP). Atualmente, com o avanço no tratamento das crises renais, a mortalidade desses pacientes está relacionada basicamente ao envolvimento pulmonar. A HAP grave é de difícil tratamento e de mal prognóstico. O gene do peptídeo natriurético tipo B (BNP) codifica um pró-hormônio que é clivado no cardiomiócito produzindo o hormônio ativo BNP e o fragmento N-terminal do proBNP (NT-proBNP), biologicamente inativo, mas secretado na circulação em quantidades equimolares ao BNP. O NT-proBNP, uma molécula maior contendo 76 aminoácidos, tem meia-vida plasmática mais longa do que a do BNP (120 minutos versus 20 minutos) e, conseqüentemente, níveis circulantes mais elevados, o que facilita sua dosagem do ponto de vista analítico. Os níveis de NT-proBNP estão aumentados não somente em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva e infarto agudo do miocárdio, mas também naqueles com hipertensão arterial pulmonar. Esta revisão aborda aspectos gerais do diagnóstico e manejo da esclerose sistêmica, com ênfase no envolvimento pulmonar; contempla também avaliação da estrutura e da importância dos peptídeos natriuréticos, com foco no NT-proBNP relacionado à hipertensão arterial pulmonar e esclerose sistêmica. / Systemic sclerosis (SSc) is a diffuse connective tissue disease, characterized by skin and visceral fibrosis and vascular dysfunction. It may lead to pulmonary arterial hypertension (PAH). Currently, with the advance in the treatment of renal problems, the mortality of these patients is related basically to pulmonary envolvement. Severe HAP is difficult to treat and has a poor prognosis. The B-type natriuretic peptide (BNP) gene encodes a pro-hormone, which is cleaved in the cardiomyocyte to produce the hormone, BNP, and the biologically inactive N-terminal proBNP (NT-proBNP) fragment. Both are secreted in equimolar quantities. NT-proBNP, composed of 76 amino acids, has a longer half-life than BNP (120 minutes versus 20 minutes), and thus higher circulating levels and better analytical performance. The NTproBNP levels are raised in patients with congestive heart failure, acute myocardial infarction and also in pulmonary arterial hypertension. This review highlights general aspects of diagnosis and management of systemic sclerosis, emphasizing pulmonary involvement. It also assesses the structure and importance of natriuretic peptides, focusing on the NT-proBNP related to pulmonary hypertension and systemic sclerosis.

O peptídeo liberador da gastrina (GRP) está estabelecido como um fator de crescimento no câncer. Os fatores de crescimento desempenham um papel importante na proliferação das células neoplásicas e progressão do câncer, estando envolvidos na invasão local, angiogênese, metástases à distância e apoptose. A superexpressão de receptores para fatores de crescimento em células malignas é geralmente um marcador de agressividade e está associada a um prognóstico reservado. Na busca por novas estratégias no tratamento do câncer, muitos esforços têm sido feitos para se identificar quais são esses receptores e desenvolver terapias dirigidas contra eles, explorando a especificidade molecular. O GRPR já foi identificado em diversas neoplasias humanas, mas até o presente momento não havia nenhum dado na literatura quanto à sua expressão no câncer de colo de útero. Considerando que esta neoplasia é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, objetivamos avaliar neste estudo o perfil de expressão de GRPR em lesões pré-invasivas e invasivas de colo de útero. Através da técnica da imunoistoquímica, lesões cervicais e tecidos não neoplásicos circundantes de 88 mulheres foram selecionados do arquivo de patologia do HCPA e avaliados quanto à expressão de GRPR. O receptor foi detectado em 99% das amostras tumorais, na maioria das vezes exibindo padrão de coloração difuso; moderado ou forte. Os GRPRs foram menos intensamente expressos em ectocervices adjacentes às lesões e praticamente não foram detectados nas endocérvices. Não foram encontradas diferenças na expressão de GRPR entre as formas pré-invasivas e invasivas de neoplasias cervicais. Este estudo demonstrou pela primeira vez a expressão aberrante de GRPRs em neoplasias cervicais humanas. A presença de receptores nos tecidos não neoplásicos circundantes pode ser associada a um papel fisiológico do GRP na renovação epitelial ou representar um processo carcinogênico incipiente. / Gastrin-releasing peptide (GRP) is already established as a growth factor in cancer. Growth factors are involved in cell proliferation and cancer progression, enhancing local invasion, angiogenesis, distant metastasis and apoptosis. Furthermore, the overexpression of growth factor receptors on the cell surface of malignant cells might be associated with a more aggressive behavior and a poor prognosis. Searching for new strategies for cancer treatment, much effort has been done to identify these receptors and to develop targeted therapies exploring their molecular specificity. The GRPR has been identified in many human malignancies, but to date, no information regarding its expression in cervical cancer was found in the literature. Considering that cervical cancer is a very important cause of morbidity and mortality worldwide, we aimed to evaluate the GRPR expression profile in preinvasive and invasive cervical lesions. Cervical lesions and surrounding nonneoplastic tissues from 88 women were selected from the pathology archive of HCPA and evaluated through immunohistochemistry. GRPR was detected in 99% of the neoplastic lesions, mostly exhibiting a diffuse strong staining. The receptors were less intensely expressed in ectocervix surrounding the lesions and were seldom detected in the endocervix. No correlation between GRPR expression and preinvasive and invasive neoplasms was found. This study demonstrated for the first time the aberrant GRPR expression in human cervical cancer. The presence of receptors in nonneoplastic surrounding tissues can be either associated with a physiological role of GRP on epithelium renewal or be related to an incipient carcinogenic processes.

A identificação de epitopos e motivos virais para serem utilizados na imunização de humanos e animais é um objetivo importante e essencial em pesquisa imunológica. No momento, com novas ferramentas de bioinformática, diferentes abordagens são possíveis. A importância da bioinformática reside na possibilidade de trabalhar com grandes quantidades de dados de forma que, várias etapas experimentais do desenvolvimento de vacinas podem ser abreviadas. Quando buscamos por motivos virais (objetivando a vacinação) é necessário estar ciente de todos os passos envolvidos na seleção e apresentação de peptídeos ao sistema imune. Devemos considerar que muitos peptídeos podem ser gerados a partir de uma única proteína, mas apenas uma fração destes peptídeos é realmente apresentada ao sistema imune, pois os peptídeos devem ser capazes de atravessar diferentes “bottlenecks” e apenas aqueles apresentando características específicas serão capazes de estimular o sistema imune. As abordagens apresentadas nesta tese incluem o estabelecimento de um banco de dados de epitopos virais descritos na literatura e a comparação desses epitopos buscando identificar características similares entre eles. Os epitopos selecionados foram classificados de acordo com suas propriedades físico-químicas (polaridade e carga dos grupos R de seus aminoácidos). Das 69 sequências de epitopos incluídas em nossa base de dados, 31 (44,93%) apresentaram, em sítios potenciais de ancoragem ao MHC, aminoácidos com resíduos não-polares. A partir desses resultados é possível inferir o seguinte motivo consenso: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM] para epitopos virais. As sequências virais foram então comparadas àquelas de outras proteínas buscando verificar se elas são exclusivamente representadas em vírus: 1) primeiro os epitopos foram comparados a todas as sequências depositadas no GenBank (independente da origem); 2) a seguir, as comparações foram direcionadas a sequências de origem humana. A segunda abordagem foi usada para verificar o potencial de indução de reações autoimunes. As sequências de saída foram classificadas de acordo com seu organismo de origem. Das 31 sequências alinhadas de acordo com a similaridade dos resíduos de ancoragem, 29 (93,54%) apresentaram similaridade significante (estabelecida como 80% ou mais) com outras sequências virais. Destas, 12 (38,71%) apresentavam similaridade apenas com outras sequências de origem viral, nove (29,03%) apresentavam similaridade com sequências de origem bacteriana e duas (6,45%) apresentavam similaridade com sequências humanas, sugerindo que a grande maioria dos epitopos virais pode ser utilizada no desenvolvimento de vacinas. A habilidade dos epitopos serem gerados pela via de processamento de antígenos foi também testada. Uma parte das proteínas citosólicas sofre o processo de ubiquitinação que as dirige para o complexo enzimático proteolítico, denominado proteossomo. Do total de epitopos, cinquenta (73,53%) apresentaram uma sequência que permitia um corte exato na extremidade carbóxi terminal. Este número alcançou 86,67% (26 epitopos), quando restringimos a análise aos epitopos apresentando os resíduos de ancoragem compartilhados, sugerindo que a maioria dos epitopos apresentava os requerimentos clássicos para o processamento antigênico. Das estruturas do Protein Data Bank e de dados de modelagem, foi possível observar que os sítios de clivagem preditos na região amino terminal dos epitopos eram estruturalmente relacionados a alças na estrutura da proteína original (66,7%). Estes dados sugerem que há uma clivagem preferencial em alças (χ2=6.09 p=0.047). O banco de dados de ligantes peptídicos do EpiJen foi utilizado para avaliar a capacidade dos epitopos em serem carreados pelo complexo da TAP. A partir dessa comparação observamos que o motivo predito estava mais representado do que todas outras possíveis sequências entre as saídas, sugerindo novamente que estas características são necessárias à seleção e apresentação de epitopos. Concluindo, sugerimos que é possível identificar padrões entre epitopos derivados de virus e que a predição de motivos virais conservados pode ser aplicada ao desenvolvimento de vacinas. Além disso, considerando a existência de reatividade cruzada, sugerimos que é possível imunizar contra uma quantidade consideravelmente grande de alvos virais utilizando um número de epitopos reduzido. Estudos sobre os aspectos e características dos epitopos virais são o primeiro passo rumo a uma nova geração de vacinas. / The identification of epitopes and viral motifs to be used in the immunization of both humans and other animals is an important and essential objective in immunology research. At present, with the new tools of the bioinformatics different approaches are possible. The importance of the bioinformatics is exemplified by its capacity to handle a large amount of data in order to bypass several methodological steps in vaccine development. When searching for conserved viral motifs it is necessary to be aware of all the steps involved in peptide selection and presentation. In this way, we should consider that many different peptides can be generated from a given protein, but only a fraction of these peptides will actually be presented to the immune system. The approaches presented in this thesis include the establishment of a viral epitope databank from sequences described in the literature and the comparison of these epitopes in order to identify similar features among then. The selected epitopes were classified according to their physicochemical properties (i.e. polarity and charge of their amino acid–R groups). From the 69 sequences of epitopes included in our database, 31 (44.93%) presented, in potential MHC anchor sites, amino acids whit non-polar residues. From this, it is possible to infer the following consensus motif: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM]. The viral sequences were then compared to those of other proteins in order to verify if they are exclusively represented in viruses: 1) first, the epitopes were compared to all sequences stored in GenBank (disregarding their origin); 2) then, the comparisons were directed to the sequences from human origin. The output sequences were classified according to the organism of origin. From the 31 sequences aligned according to their anchor residues, 29 (93.54%) presented significant similarity (established as 80% or above) with other viral sequences. From these, 12 (38.71%) presented similarity only with other sequences from viral origin, nine (29.03%) presented similarity with sequences from bacterial origin and two (6.45%) presented significant similarity to human sequences, suggesting that a great majority of these viral epitopes could be used in vaccine development. The hability of the epitopes to be generated by antigen processing pathway was also tested. A fraction of all cytosolic proteins suffers the ubiquitination process that directs them to the proteolytic enzymatic complex, called proteasome. From the whole databank, fifty epitopes (73.53%) presented a sequence that allowed a precise cut at the carboxy terminal region. This number reached 86.67% (26 epitopes) when we restricted this analysis to the epitopes presenting the shared anchor residues, suggesting that the majority of the epitopes presented the classical requirements to antigenic processing. From the Protein Data Bank structures and from the modelling data, we could observe that the predicted cleavage sites on the amino-terminal region of the epitopes were structurally related to loops on the structure of the original protein (66.7%), suggesting a preferential cleavage at loops (χ2=6.09 p=0.047). The TAP ligands peptide database of EpiJen was used in order to evaluate the epitopes capacity to be carried by the TAP complex. We were able to observe that our predicted motif was present more frequently than every other possible sequence among the outputs, again suggesting that this feature is necessary to epitope selection and presentation. In conclusion, we suggest that it is possible to identify patterns among virus-derived epitopes and that the prediction of viral conserved motifs would allow the development of vaccines. Also, considering the existence of cross reactivity, we suggest that it will be possible to cover a considerably large amount of targets using a limited number of viral peptides. Equally important is the immunogenicity of viral peptides, since only a fragment and not the whole viral particle will challenge the immune system, therefore reducing risks of undesired immune responses. Studies on viral epitopes features and characteristics are the first step towards a new generation of vaccines.

O peptídeo liberador da gastrina (gastrin-releasing peptide, GRP), pertencente à família dos peptídeos semelhantes à bombesina, e seus receptores estão presentes em todo o sistema nervoso central, em particular em áreas límbicas cerebrais como o hipocampo e a amídala, as quais estão envolvidas de forma importante na regulação emocional, na função cognitiva e em transtornos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos. Há estudos sugerindo que receptores GRP podem ter um papel na regulação da plasticidade sináptica, de respostas emocionais e da formação da memória. Apesar disso, esse sistema tem sido relativamente pouco estudado quanto a seu papel na função cerebral e não são conhecidos os mecanismos celulares envolvidos na transdução de sinal ativada por receptores GRP no sistema nervoso. Estudos em outros tipos de células sugerem que a ativação de receptores GRP pode levar a uma ativação das vias de transdução de sinal mediadas por proteína cinase C (protein kinase C, PKC) e pela proteína cinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase, MAPK). O envolvimento da via da adenilato ciclase/AMPc/proteína cinase A (protein kinase A, PKA) é controverso. Por outro lado, já está estabelecido que as vias de sinalização da PKC, MAPK e PKA estão envolvidas de forma crucial na formação da memória emocional na área CA1 do hipocampo dorsal. Assim, é possível que a ativação de receptores GRP module a memória através da ativação de uma ou mais dessas vias. No presente trabalho, propomos uma abordagem farmacológica de investigação, utilizamos para isso, um modelo bem estabelecido de memória emocional em roedores, para analisar as interações entre receptores GRP e os eventos biológicos que se seguem à ativação do receptor, ou seja, a ativação de cascatas de sinalização neuronal mediadas por proteínas cinases, na região CA1 do hipocampo dorsal. Ratos Wistar machos foram tratados com uma infusão bilateral de agonista do GRPR, bombesina, no hipocampo dorsal imediatamente após o treino em esquiva inibitória. Doses intermediárias de bombesina induziram uma facilitação, enquanto doses mais altas prejudicaram a retenção da memória medida 24 horas após o treino. A facilitação da memória induzida pela bombesina foi prevenida por infusões pré-treino de um antagonista GRP ou de inibidores de PKC, MAPK ou PKA, mas não por um antagonista do receptor de neuromedina B (NMB). Os resultados indicam que a modulação da consolidação da memória por GRPRs hipocampais depende das vias da PKC, MAPK e PKA. / Gastrin-releasing peptide (GRP), a bombesin-like peptide, and their receptors are gifts in all the central nervous system, particular in cerebral limbic areas as hippocampus and amigdala, which are involved in an important way in the emotional regulation, cognitive function and neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. Studies suggest that GRPR can act in synaptic plasticity regulation, emotional answers and memory formation. Although this, this system has been relatively little studied how much its paper in the cerebral function and the involved cellular mechanisms in the transdução of signal are not known activated for receivers GRP in the nervous system. Studies in other cell types suggest that activation of GRPR can active signal transduction pathways mediated by protein cinase C (protein kinase C, PKC) and mitogen-activated protein kinase (MAPK). The envolvement of protein kinase A (PKA) pathways are controversial. Already it is established that PKC, MAPK and PKA signal pathways are involved of crucial form in emotional memory formation in CA1 area of dorsal hippocampus. Thus, it is possible that the activation of GRPR modulates the memory through the activation of one or more than these ways. In present study, we propose an pharmacological investigation, using an established emotional memory model in rodents, to analyze the interactions between GRPRs and the biological events following to the receptores activation in other words, the neuronal sign cascades activation mediated by proteins kinases, in CA1 hippocampus area. Male Wistar rats received bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin into the dorsal hippocampus immediately after inhibitory avoidance training. Intermediate doses of bombesin enhanced, whereas a higher doses impaired 24-h memory retention. The bombesin-induced memory enhancement was prefented by pretraining infusions of a GRPR antagonist or inhibitors of PKC, MAPK and PKA, but not a neuromedin B (NMB) antagonist. We conclude that memory modulation by hippocampal GRPRs is mediated by the PKC, MAPK and PKA pathways.

Resumo não disponível

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-08-22T13:09:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_DiogoCavalcanti_BC.pdf: 3366342 bytes, checksum: 1cb002141032824ff8d879898ca1256e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-22T13:09:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_DiogoCavalcanti_BC.pdf: 3366342 bytes, checksum: 1cb002141032824ff8d879898ca1256e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / FACEPE / O aumento da produtividade agrícola é impactado negativamente por estresses bióticos e abióticos, que são os principais responsáveis pela drástica redução da produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata). Para se defender dos estresses bióticos, os vegetais desenvolveram sofisticados mecanismos, incluindo o sistema de defesa pré-invasivo, localizado nas partes externas dos vegetais e impedindo a entrada do patógeno, e a imunidade inata, que reconhece estruturas fundamentais dos microorganismos e induz a produção de proteínas de combate aos patógenos. Dentre elas as defensinas, que inviabilizam o estabelecimento de agentes invasores. Por sua vez, o melão-de-são-caetano (Momordica charantia) dispõe de transcriptoma sequenciado e destaca-se pelo seu potencial antimicrobiano. A partir de análises in silico no transcriptoma dessa espécie foram selecionados cinco genes-candidatos da classe das defensinas. Destes, o gene McDef1 apresentou domínio conservado completo com predição de atividade antifúngica. A defensina McDef1 exibe regiões conservadas na maioria das defensinas de plantas incluindo oito cisteínas, uma serina na posição 8, um aminoácido aromático na posição 11 e resíduos de glicina nas posições 13 e 34. Após análise fenéticas a McDef1 foi agrupada com outras defensinas já descritas com atividades antifúngicas in vitro e/ou in vivo, o que reforça a predição revelada pelas análises in silico. Um vetor pAHASMCDEF1, portando o gene McDef1 e Atahas, que confere resistência ao herbicida Imazapyr, foi construído e utilizado para bombardear 880 embriões de feijão-caupi através da técnica de biobalística. Destes, sete plantas transformadas foram geradas, com eficiência de transformação semelhante àquela de trabalhos anteriores com feijão-caupi. As próximas etapas compreendem a multiplicação das plantas transformadas até a geração T3, após o que as mesmas serão inoculadas com fungos fitopatogênicos, os quais podem causar perdas de até 50% na produção em feijão-caupi. / Increased agricultural productivity is negatively impacted by biotic and abiotic stresses, that are responsibles for the drastic reduction in cowpea (Vigna unguiculata) production. To defend against biotic stresses, plants have developed sophisticated mechanisms including a pre-invasive defense system, located in the external parts of plants to prevent pathogenic entry, and the innate immunity, which recognizes fundamental structures of microorganisms and induces proteins production that avoid the pathogen establishment. Among them defensins, that prevent the establishment of invading agents. In turn, the bitter melon (Momordica charantia) disposes a sequenced transcriptome and stands out for its antimicrobial potential. After an in silico analysis of M. charantia transcriptome, five defensin gene candidates were selected. Of these, McDef1 gene exhibited a complete conserved domain with prediction of its antifungal activity. The McDef1 defensin displayed conserved regions similar to most plant defensins including eight cysteines, a serine at position 8, an aromatic amino acid at position 11 and glycine residues at positions 13 and 34. After phenetic analyzes, McDef1 was grouped with other defensins previously described with in vitro and/or in vivo antifungal activity, reinforcing the in silico prediction analysis. A pAHASMCDEF1 vector was constructed, bearing the McDef1 and Atahas gene, which confers resistance to the herbicide Imazapyr, being used for bombardment of 880 cowpea embryos by biolistic technique. Of these, seven transformed plants were generated, with transformation efficiency similar to previous reports for cowpea. The next steps include the multiplication of transformed plants up to the T3 generation, after which they will be inoculated with pathogenic fungi, which can cause losses of up to 50% in cowpea production.

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T03:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColetta_Ricardo_M.pdf: 1863333 bytes, checksum: 44c85001fc634c2cd4363b8f4868e6bc (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A participação das metaloproteinases durante o desenvolvimento dental ainda não está bem estabelecida. Neste trabalho foram realizados estudos no intuito de caracterizar e detenninar o sítio principal de atuação dos grupos de metaloproteinases associadas ao germe dental' do primeiro molar em desenvolvimento. Verificou-se a presença de enznnas gelatinolíticas e caseinolíticas com comportamento, quanto à ação de inibidores específicos, ação colagenolítica e peso molecular, semelhante ao das enzimas pertencentes. ao grupo das metaloproteinases. A análise nos diversos períodos do desenvolvimento do germe dental mostrou que a maturação dental é acompanhada por um aumento na secreção dessas proteinases. Quando analisado o sítio de atuação dessas metaloproteinases, observou-se maior ação gelatinolítica na. papila dental quando comparado com o órgão do esmalte. A ação caseinolítica foi maior no órgão do esmalte. Estes resultados indicam que enzimas pertencentes ao grupo das metaloproteinases estão associadas ao desenvolvimento e crescimento do órgão dental. A presença de caseínases, principalmente no órgão do esmalte, pode estar relacionada ao processo de mineralização dental / Abstract: The participation of metalloproteinases during the tooth development is not well established. This work was performed in order to determine and characterize the expression of metalloproteinases during the rat first molar development. Gelatinolytic and caseinolytic activities were analyzed by zymography on polyacrylamide gels containing one of the substracts. The maturation of the rat first molar was accompanied by changes in the expression of metalloproteinases. Gelatinolytic activity increased progressively from day O to 15, while caseinolytic activity increased rapidly from day 3 to 10, decreasing on day 15. Mechanical separation of compartments of tooth genn showed that caseinolytic activity was restricted, mainly in the enamel organ whi1e gelatinolytic activity was localized mainly in the papillae. All the enzymes detected were inhibited by 1,10phenanthroline, which is a specific inhibitor for metalloproteinases. These data suggest that matrix metalloproteinases pIay an important role in the developmtmt and maturation of tooth germ / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Ciências