Orientador: Marcelo Cristianini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-27T06:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arasaki_LeticiaHarumi_M.pdf: 18571902 bytes, checksum: 189d2c3a59ee931f6a4e385373d18c97 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os resíduos da indústria pesqueira representam problemas ambientais e um desperdício significativo de um material com alto teor protéico. A carne escura de atum é descartada juntamente com outros tipos de resíduos, que incluem as vísceras, a cabeça, a cauda e os espinhos. A hidrólise enzimática de proteínas é uma alternativa para o reaproveitamento do resíduo e em alguns casos aumentar seu valor agregado, já que este processo pode melhorar algumas propriedades funcionais de proteínas. O objetivo deste trabalho foi utilizar a Metodologia de Superfície de Resposta para estudar os efeitos do pH, temperatura e relação enzimalsubstrato no grau de hidrólise de carne escura de atum, utilizando as enzimas proteolíticas comerciais Proteinase 1.5L (Prozyn) e Savinase@(Novo Nordisk). A carne escura de atum apresentou a seguinte composição centesimal: 64,63% de umidade, 26,88% de proteínas, 5,79% de lipídios e 1,85% de cinzas. Utilizando-se a enzima Proteinase 1.5L, foi realizado um planejamento experimental 23 para estudar os efeitos das variáveis independentes pH, temperatura e relação enzimalsubstrato. Os intervalos estudados foram: pH de 6,75 a 7,25, temperatura de 40 a 60°e e relação enzima substrato de 0,1 a 0,3 %. Dentro das faixas estudadas, a variável de maior efeito no processo foi o pH, seguido da relação enzimalsubstrato. Observou-se que a temperatura não influenciou o processo significativamente (p<0,05). Foi então realizado um segundo planejamento experimental completo 22 para estudar os efeitos do pH e relação enzimalsubstrato no grau de hidrólise. Os intervalos estudados foram: pH de 6,6 a 7,4 e relação enzima substrato de 0,06 a 0,34 %. A variável de maior efeito no processo foi o pH. O processo foi considerado como ótimo na região onde houve um maior grau de hidrólise, onde o pH variou de 6,6 a 6,7 e a relação enzimalsubstrato de 0,30 a 0,34%. Para o estudo da obtenção do hidrolisado protéico utilizando a enzima Savinase@ foi realizado um planejamento experimental completo 23 para avaliar os efeitos do pH, temperatura e relação enzimalsubstrato. Os intervalos estudados foram: pH de 8,5 a 9,5, temperatura de 36,6 a 53,4°C e relação enzima substrato de 0,03 a 0,37 %. Foi observado que as três variáveis dentro da faixa estudada influenciaram significativamente o processo. A variável de maior efeito no processo foi a relação enzima/substrato, seguida da temperatura e do pH. O processo foi considerado como ótimo na região onde houve um maior grau de hidrólise, onde o pH variou de 9,4 a 9,5, a temperatura de 52 a 53,4°C e a relação enzima/substrato de 0,28 a 0,37 %. Foi obtido um modelo matemático para cada enzima estudada para descrever o processo de hidrólise nas regiões estudadas. Tais modelos foram validados comparando-se dados experimentais com resultados esperados pelo modelo. Foram obtidas superfícies de resposta que descrevem o processo nas regiões estudadas. Dois métodos de secagem foram comparados para a obtenção do hidrolisado em pó: um utilizando um secador de jorro cônico e outro uma estufa com circulação forçada. Comparando-se os hidrolisados produzidos com a Proteinase 1.5L, o produto seco em estufa apresentou uma solubilidade maior do que o seco em secador de jorro cônico. Para os\ hidrolisados produzidoscom a Savinase@,o processo de secagem não influiu significativamente na solubilidade dos produtos. / Abstract: Fish processing wastes represent environmental problems and a meaningful waste of high protein material. Tuna dark meat is wasted as other kind of wastes, which include offal, head, tail and bones. Protein enzymatic hydrolysis is an alternative way to add value to by-products, as this process improves some of their functional properties. The objective of this work was to study the effects of pH, temperature and enzyme/substrate ratio using Response Surface Methodology on the degree of hydrolysis of tuna dark meat using the commercial enzymes Proteinase 1.5L and Savinase@. Tuna dark meat showed the following chemical composition: 64,63% moisture, 26,88% protein, 5,79% fat and 1,85% of ash. Using the enzyme Proteinase 1.5L, an experimental design 23 was used to evaluate the effects of the independent variables pH, temperature and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis of tuna dark meat. The parameters studied were pH from 6,75 to 7,25, temperature from 40 to 60°C and enzyme/substrate ratio from 0,1 to 0,3%. The factor of highest eftect on the reaction was the pH, followed by the enzyme/substrate ratio. It was observed that the temperature didn't influence the process significantly. Therefore, a second experimental design 22elaborated to study the effect of pH and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis. The parameters studied were pH 6,6 to 7,4 and enzyme/substrate ratio 0,06 to 0,34%. The factor of highest effect was the pH. The process was considered optimum in the region where there was a highest degree of hydrolysis, the pH varied from 6,6 to 6,7 and the enzyme/substrate ratio from 0,30 to 0,34%. An experimental design 23 was used to evaluate the effects of the independent variables pH, temperature and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis of tuna dark meat using the enzyme Savinase@,The intervals studied were: pH 8,5 to 9,5, temperature 36,6 to 53,4°C and enzyme/substrate ratio trom 0,03 to 0,37. It was observed that the three factors influenced the process significantly . The factor of highest effect on the reaction was the enzyme/substrate ratio. The process was considered optimum in the region where there was a highest degree of hydolysis, where the pH varied from 9,4 to 9,5, the temperature trom 52 to 53,4°C and enzyme/substrate ratio from 0,28 to 0,37%. A mathematical model was obtained for each enzyme to describe the hydrolysis reaction in the studied areas. Such models were considered predictive in the region studied. Two drying methods to obtain a dried product were compared: fIuidized bed and conventional oven. Comparing the protein hydrolysates produced with Proteinase 1.5L, the sample dried in the oven showed higher solubility than the one dried in the fIuidized bed. For the protein hydrolysate obtained with Savinase@,the drying method did not influence significantly the product solubility. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T08:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_MarcosGarcia_M.pdf: 1468128 bytes, checksum: 509b553e635606c76700ca3af2c9578d (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: A atividade proteinásica de uma fração solúvel, rotulada como FS, obtida a partir de lisados da forma epimastigota de T. cruzi foi investigada em diferentes pH, utilizando diferentes tampões e o método de Anson modificado. A atividade proteolítica em pH 7,0 foi particularmente investigada utilizando-se diferentes substratos protéicos. A caracterização da proteinase neutra foi tentada utilizando-se os métodos de detecção de atividade proteolítica em gel de agarose, após eletroforese, imunoeletroforese simples e imunoeletroforese cruzada. Os resultados obtidos mostram que: 1. A FS exibe atividade proteolítica em uma ampla faixa de pH (entre 1,0 e 9,0), ocorrendo picos de atividade na zona ácida (pH 2,6 a 3,6), na zona alcalina (pH 8,5) e a zona neutra. 2. A atividade proteinásica da zona neutra apresentou um ótimo de atividade em pH 7,0, quando se utilizou tampão fosfato e homoglobina bovina ou humana como substratos. Um mesmo Km foi encontrado para as duas hemoglobinas que quando testadas frente a diferentes concentrações de FS, obteve-se uma relação praticamente linear entre dose e efeito quando os valores de 'delta¿DO se situam entre 0 e 0,500. 3. A proteinase neutra é capaz de agir sobre SNC, SAB, SAH e GGH, não alterando contudo o motivo antigênico desses substratos... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-14T17:15:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Vanessa Pereira da Silva.pdf: 747912 bytes, checksum: d6cd4bafe4a97e4af064c701c490f583 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-14T17:15:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Vanessa Pereira da Silva.pdf: 747912 bytes, checksum: d6cd4bafe4a97e4af064c701c490f583 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / CAPES / Introdução: A carbamazepina é uma dos principais fármacos, utilizado no tratamento de epilepsia, transtorno bipolar e várias formas de neuropatias. Também atua como antidiurético interferindo na liberação do hormônio antidiurético. A vasopressina e a ocitocina são hormônios antidiuréticos sintetizados no hipotálamo e armazenados na neurohipófise. Esses hormônios são liberados em resposta à hiperosmolaridade e à hipovolemia, atuam aumentando o volume sanguíneo e diminuindo a concentração do sódio extracelular. O peptídeo natiurético atrial é um hormônio antidiurético sintetizado no átrio direito e liberado em resposta a expansão do volume sanguíneo, possui efeito natriurético. A liberação desses hormônios pode causar um desequilíbrio na osmolalidade de fluidos corporais fundamentais para a sobrevivência, já que uma expansão do volume hídrico pode levar a crises epilépticas. O objetivo deste estudo foi investigar in vitro vasopressina, ocitocina e peptídeo natriurético atrial na presença da droga carbamazepina. Já que até o momento não existe estudos sobre a ação deste fármaco sobre o sistema neuroendócrino in vitro e estudos in vivo são controversos Método: No experimento foi empregado um total de 28 ratos, sacrificados por decapitação. Hipotálamo, neurohipófise e coração foram removidos cirurgicamente e incubados em Krebs contendo carbamazepina nas concentrações 10-4M, 10-6M e10-8M. O meio de incubação foi extraído para dosagem de vasopressina, ocitocina e peptídeo natriurético atrial, sendo utilizado radioimunoensaio. Resultado: No hipotálamo, os níveis de vasopressina, ocitocina e peptídeo natriurético atrial no meio de incubação contendo carbamazepina diminuíram significativamente (p<0,05); no coração, diminuiu significativamente (p<0,05) a liberação de peptídeo natriurético atrial; e na neurohipófise, os níveis de vasopressina e ocitocina não tiveram diferença significativa. Conclusão: A presença da carbamazepina diminuiu os níveis de hormônios liberados in vitro. / Introduction: Carbamazepine is one of the main drugs used to treat epilepsy, bipolar disorder and various forms of neuropathy. Also acts as antidiuretic interfering in the release of antidiuretic hormone. Vasopressin and oxytocin are antidiuretic hormone synthesized in the hypothalamus and stored in the neurohypophysis. These hormones are released by hyperosmolarity and hypovolemia response, work by increasing blood volume and decreasing the concentration of extracellular sodium. The atrial natiuretic peptide is a antidiuretic hormone synthesized in the right atrium and released in response to expansion of blood volume, has natriuretic effect . The release of these hormones can cause an imbalance in the body fluid osmolality fundamental to the survival, since a volume expansion of water may lead to seizures. The aim of this study was to investigate in vitro vasopressin, oxytocin and atrial natriuretic peptide in the presence of the drug carbamazepine . Since so far there are no studies on the action of this drug on the neuroendocrine system in vitro and in vivo studies are controversial. Methods: The experiment was employed a total of 28 mice were sacrificed by decapitation. Hypothalamus , neurohypophysis and heart were surgically removed and incubated in Krebs containing carbamazepine in concentrations of 10-4M , 10-6M and 10-8M . The incubation medium was extracted for determination of vasopressin, oxytocin and atrial natriuretic peptide, being used radioimmunoassay. Result: In the hypothalamus, the levels of vasopressin, oxytocin and atrial natriuretic peptide in the incubation medium containing carbamazepine decreased significantly (p <0,05); in the heart , decreased significantly (p < 0,05) release of atrial natriuretic peptide ; neurohypophysis and the levels of oxytocin and vasopressin had no significant difference. Conclusion: The presence of carbamazepine decreased levels of hormones released in vitro.

Orientador: Juan Alberto Coch Frugoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-15T08:46:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribas_IsabelMariadoAmaral_M.pdf: 2674577 bytes, checksum: 7f74ce897b742083f99274d66e0c265e (MD5) Previous issue date: 1978 / Resumo: Realizaram-se alguns estudos experimentais de atividade enzimática proteolítica do extra do aparelho digestivo da corvina (Micropogon furnieri), segundo o seguinte plano de trabalho: 1) provas da exietência de atividades enzimáticas proteolítica ; 2) Influência do pH a temperatura constante ; Influência da temperatura a pH constante. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Some experimental studies of the proteolitic enzimatic activity of extracts from the digestive system of the croaker (Micropogon furnieri) were made according to the follwing plan: 1) Evidence of the proteolitic enzymatic activity ; 2) Influence of pH at a constant temperature ; 3) Influence of temperature at a constant pH. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Diagnóstico precoce e tratamento de melanoma, um tumor cutâneo com o pior prognóstico, é extremamente importante para um resultado clínico favorável. A biblioteca de peptídeos phage display é um recurso útil de triagem para identificar peptídeos bioativos que interagem com alvos em cânceres. O objetivo desse estudo foi a avaliação de dois traçadores de tecnécio-99m com sequências peptídicas RGD e NGR, conjugados com o quelante bifuncional MAG3. Os conjugados peptídicos (10 &mu;L de uma solução &mu;g/&mu;L) foram marcados com tecnécio-99m usando tampão de tartarato de sódio. A avaliação radioquímica foi feita por ITLC e confirmada por CLAE. O coeficiente de partição foi determinado e ensaios de internalização foram realizados em duas linhagens celulares de melanoma (B16F10 e SKMEL28). A avaliação da biodistribuição dos traçadores foi realizada em animais sadios em diferentes tempos e também em camundongos portadores de células tumorais aos 120 min após a sua administração. Estudos de bloqueamento também foram conduzidos pela co-injeção de peptídeo frio. O desempenho dos conjugados peptídicos mostraram-se bastante parecidos em diversas avaliações. Eles foram radiomarcados com alta pureza radioquímica (>97%). Ambos são hidrofílicos, com excreção renal preferencial. A captação tumoral foi maior para células SKMEL28 do que para as células B16F10, especialmente para o 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7,85±2,34 %DI/g) aos 120 min pós-injeção. O desempenho do 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) foi superior que o do traçador com NGR, quanto à captação no melanoma humano podendo ser considerado como um promissor radiofármaco para diagnóstico de melanoma. / Early diagnosis and treatment of melanoma, a cutaneous tumor with a serious prognosis, is extremely important for optimal clinical outcome. Phage display peptide libraries are a useful screening resource for identifying bioactive peptides that interact with cancer targets. The aim of this study was the evaluation of two technetium-99m tracers for angiogenesis detection in melanoma model, using cyclic peguilated pentapeptide with RGD and NGR motifs conjugated with bifunctional chelator MAG3. The conjugated peptides (10 &mu;L of a &mu;g/&mu;L solution) were labeled with technetium-99m using a sodium tartrate buffer. Radiochemical evaluation was done by ITLC and confirmed by HPLC. Partition coefficient was determined and internalization assays were performed in two melanoma cells (B16F10 and SKMEL28). Biodistribution evaluation of the tracers was done in healthy animals at different times and also in mice bearing the tumor cells at 120 min post injection. Blocking studies were also conducted by co-injection of cold peptides. The conjugated showed the same profile in many evaluations. They were radiolabeled with high radiochemical purity (>97%). Both were hydrophilic, with preferential renal excretion. Tumor uptake was higher for human melanoma cells than for murinic melanoma cells, specially for 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7.85±2.34 %ID/g) at 120 min post injection. The performance of 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) was much better than NGR tracer concerning human melanoma uptake and might be considered in future investigations focusing radiotracers for melanoma diagnosis.

Diagnóstico precoce e tratamento de melanoma, um tumor cutâneo com o pior prognóstico, é extremamente importante para um resultado clínico favorável. A biblioteca de peptídeos phage display é um recurso útil de triagem para identificar peptídeos bioativos que interagem com alvos em cânceres. O objetivo desse estudo foi a avaliação de dois traçadores de tecnécio-99m com sequências peptídicas RGD e NGR, conjugados com o quelante bifuncional MAG3. Os conjugados peptídicos (10 &mu;L de uma solução &mu;g/&mu;L) foram marcados com tecnécio-99m usando tampão de tartarato de sódio. A avaliação radioquímica foi feita por ITLC e confirmada por CLAE. O coeficiente de partição foi determinado e ensaios de internalização foram realizados em duas linhagens celulares de melanoma (B16F10 e SKMEL28). A avaliação da biodistribuição dos traçadores foi realizada em animais sadios em diferentes tempos e também em camundongos portadores de células tumorais aos 120 min após a sua administração. Estudos de bloqueamento também foram conduzidos pela co-injeção de peptídeo frio. O desempenho dos conjugados peptídicos mostraram-se bastante parecidos em diversas avaliações. Eles foram radiomarcados com alta pureza radioquímica (>97%). Ambos são hidrofílicos, com excreção renal preferencial. A captação tumoral foi maior para células SKMEL28 do que para as células B16F10, especialmente para o 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7,85±2,34 %DI/g) aos 120 min pós-injeção. O desempenho do 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) foi superior que o do traçador com NGR, quanto à captação no melanoma humano podendo ser considerado como um promissor radiofármaco para diagnóstico de melanoma. / Early diagnosis and treatment of melanoma, a cutaneous tumor with a serious prognosis, is extremely important for optimal clinical outcome. Phage display peptide libraries are a useful screening resource for identifying bioactive peptides that interact with cancer targets. The aim of this study was the evaluation of two technetium-99m tracers for angiogenesis detection in melanoma model, using cyclic peguilated pentapeptide with RGD and NGR motifs conjugated with bifunctional chelator MAG3. The conjugated peptides (10 &mu;L of a &mu;g/&mu;L solution) were labeled with technetium-99m using a sodium tartrate buffer. Radiochemical evaluation was done by ITLC and confirmed by HPLC. Partition coefficient was determined and internalization assays were performed in two melanoma cells (B16F10 and SKMEL28). Biodistribution evaluation of the tracers was done in healthy animals at different times and also in mice bearing the tumor cells at 120 min post injection. Blocking studies were also conducted by co-injection of cold peptides. The conjugated showed the same profile in many evaluations. They were radiolabeled with high radiochemical purity (>97%). Both were hydrophilic, with preferential renal excretion. Tumor uptake was higher for human melanoma cells than for murinic melanoma cells, specially for 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7.85±2.34 %ID/g) at 120 min post injection. The performance of 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) was much better than NGR tracer concerning human melanoma uptake and might be considered in future investigations focusing radiotracers for melanoma diagnosis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2009-01-06T11:50:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-27T16:09:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-27T16:09:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5) / Os capítulos um e dois tratam da prospecção de peptídeos bioativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis. Mais especificamente, o primeiro aplica técnicas proteômicas, principalmente espectrometria de massa, para o estudo de peptídeos relacionados à bradicinina (BRPs). Estes estavam presentes tanto na secreção solúvel quanto em fragmentos dissecados de pele do anfíbio. Dezoito BRPs, assim como suas modificações pós-traducionais, foram caracterizados por seqüenciamento MS/MS denovo e experimentos de geração de imagens por MALDI em um fragmento de pele. Essas moléculas tiveram alta similaridade de seqüência com as cininas plasmáticas de alguns mamíferos e répteis. Tamanha diversidade de moléculas dentro da mesma família peptídica e pertencendo a mesma espécie pode estar relacionada à especializações funcionais desses peptídeos a uma variedade de receptores correspondentes em diferentes predadores. Também um novo análogo, [Val]1,[Thr]6-bradicinil-Gln,Ser teve sua atividade biológica detectada em culturas celulares expressando o receptor de bradicinina humana B2 e em preparações de íleo de porquinho-da-índia. O capítulo dois descreve a mesma aproximação metodológica para o estudo de peptídeos antimicrobianos da família das dermaseptinas. As estruturas primárias dessas moléculas, nomeadas de DShypo 01, 02, 03, 04, 06 e 07 foram obtidas por experimentos MS/MS de novo, degradação de Edman e seqüenciamento de cDNA. O quinto peptídeo foi o mesmo DS 01 de Phyllomedusa oreades, previamente descrito pelo nosso grupo. A maioria dos peptídeos purificados do extrato cutâneo total de P. hypochondrialis pôde ser diretamente localizada e mapeada em um fragmento de pele dorsal usando técnicas de obtenção de imagens por espectrometria de massa. Comparações foram feitas entre peptídeos e drogas comerciais com relação à suas atividades antimicrobianas e contra Leishmania amazonensis. Também foram executados estudos comparativos dos efeitos líticos em células do sangue de mamíferos e da interação com vesículas de DMPC por ressonância plasmônica de superfície. Os capítulos três e quatro tratam do estudo da interação de peptídeos membranoativos com membranas modelo, com ênfase em sua categorização em grupos e predição de atividade. Para tal, dezessete peptídeos membrano-ativos foram sintetizados e tiveram suas interações com vesículas unilamelares de DMPC e de DMPC/DMPG (2:1 mol/mol) estudadas por uma série de técnicas biofísicas. Estas técnicas permitiram a dissecção das interações entre peptídeos e membranas em termos de sua interação inicial, grau de inserção em membranas e indução de extravasamento de marcadores fluorescentes. Por esta aproximação, ficou clara a existência de no mínimo cinco sub-grupos funcionais de peptídeos membrano-ativos, sendo três desses grupos compostos por antimicrobianos, um de peptídeos penetradores de células e mais um de peptídeos membrano-ativos capazes unicamente de adsorção em membranas. Também as relações estrutura e função são revistas de acordo com esta nova perspectiva. O capítulo quatro descreve a determinação de parâmetros termodinâmicos para a adsorção do mesmo grupo de dezessete peptídeos em vesículas fosfolipídicas. Para tal, as isotermas de interação obtidas por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foram analisadas pelo método de partição em superfície. Esse método é capaz de extrair das isotermas uma constante de afinidade intrínsica ao peptídeo (Kp), a qual exclui efeitos eletrostáticos, além de uma constante de afinidade aparente (Kapp). Somente quatro dos dezessete peptídeos tiveram isotermas passíveis de ajuste com extração de parâmetros verossímeis. Esses peptídeos tiveram interação primariamente eletrostáticas com membranas, conforme classificado no capítulo três. As causas do não ajuste das isotermas de interação para alguns peptídeos foram discutidas em detalhe e relacionadas ao seu mecanismo de interação específico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chapters one and two deal with the isolation and identification of bioactive peptides from the skin secretion of Phyllomedusa hypochondrialis. The first chapter demonstrates the use of protemic techniques, mainly mass spectrometry, for the study of bradykinin related peptides (BRPs) present in the amphibian´s secretion and freshly dissected skin fragments. Eighteen BRPs, along with their post-translational modifications, were characterized in the secretion by de novo MS/MS sequencing and direct MALDI imaging experiments on the frog skin. These molecules revealed strong sequence similarities to the main plasma kinins of mammals and reptiles. Such a diversity of molecules, within the same peptide family, belonging to a single amphibian species may be related to functional specializations of these peptides and a variety of corresponding receptors that might be present in a number of different predators. Also, a novel analog, [Val]1,[Thr]6-bradykinyl-Gln,Ser had its biological activity positively detected in cell culture expressing the human bradykinin B2 receptor and in guinea pig ileum preparations. Chapter two describes the same methodological approach to the study of antimicrobial peptides from the dermaseptin family. The primary structures of these molecules, named DShypo 01, 02, 03, 04, 06, and 07, were determined by de novo MS/MS experiments, Edman degradation, and cDNA sequencing. The fifth peptide was found to be precisely the same DS 01 from Phyllomedusa oreades, previously described by our group. The majority of the peptides purified from the crude skin secretion could be directly localized and mapped onto a freshly dissected dorsal skin fragment using mass spectrometry-imaging techniques. Comparisons between peptides and commercial drugs on their antibacterial and anti-Leishmania amazonensis efficiencies, associated with peptide lytic effects on mammalian blood cells and surface plasmon resonance interaction studies on immobilized DMPC vesicles, were also performed. Chapters three and four describe the study of membrane-active peptides with model membranes, emphasizing their categorization and bioactivity prediction. Seventeen membrane-active peptides were synthesized and had their interaction with DMPC and DMPC/DMPG (2:1 mol/mol) large unilamelar vesicles studied by a series of biophysical techniques. These techniques allowed the dissection of the interaction of peptides with membranes in terms of their initial recognition, degree of insertion in the bilayer and induction of fluorescent dye leakage. This approach made clear the existence of at least five functional groups of membrane-active peptides, three of them composed of antimicrobial molecules, one of cell-penetrating peptides and one of peptides only capable of adsorption. Also, structural and functional relationships relevant to the interaction of peptides and membranes were re-evaluated according to this new perspective. Chapter four deals with the extraction of thermodynamical parameters from the adsorption of the same group of seventeen peptides into phospholipid vesicles. For such, interaction isotherms were obtained by isothermal titration calorimetry (ITC) and analyzed by the surface partition method. This method is capable of estimating an intrinsic affinity constant (Kp), that excludes electrostatic effects, as well as an apparent affinity constant (Kapp). Membrane adsorption of only four out of seventeen peptides resulted in isotherms capable of adjustment to the surface partition model. These peptides had interactions mainly driven by electrostatic effects, as categorized in chapter three. The reasons for the incapacity to fit the isotherms were discussed and related to specific peptide mechanisms.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-02-16T14:50:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Thesis_Gabriel_digital.final.pdf: 10412972 bytes, checksum: ec85b3671bb5bbcd735ea9e83436b08f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-16T14:50:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Thesis_Gabriel_digital.final.pdf: 10412972 bytes, checksum: ec85b3671bb5bbcd735ea9e83436b08f (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / CNPq / Peptídeos antimicrobianos são componentes importantes do sistema de defesa de diversos organismos contra possíveis invasores. Em geral, são pequenos (até 100 aminoácidos), catiônicos e anfipáticos. Eles têm despertado o interesse da comunidade científica por sua capacidade de atuação contra micróbios, que não conseguem desenvolver resistência a esses peptídeos. Ou seja, eles emergem como complemento e/ou alternativa ao uso dos antibióticos convencionais. Este trabalho desenvolveu um modelo computacional de um peptídeo híbrido de pediocina A (N-terminal) e plantaricina 149a (C-terminal), dois peptídeos bactericidas. Dados experimentais obtidos pelo grupo da prof. Dra. Rosângela Itri do IFUSP foram utilizados para modelagem e comparação dos resultados. Foram feitas simulações de MD do peptídeo interagindo com membranas puras e mistas de POPC e POPG utilizando os parâmetros do campo de força GROMOS 53A6 e 54A7. As simulações com uma unidade do peptídeo revelaram a atualização 54A7 era a mais adequado para modelagem desses sistemas. Os mapas de estrutura secundária mostraram que o peptídeo adquire configuração mais ordenada quando interage com membranas com maior quantidade de POPG em sua composição. As simulações com duas unidades do peptídeo sugeririam que o peptídeo interage e penetra na camada de POPG através da região Cterminal. Na simulação com membrana de POPC, nenhuma das porções terminais ficou estável no interior da membrana. O efeito do aumento da concentração de peptídeos foi examinado colocando cinco e dez unidades do peptídeo para interagir com as membranas. Na membrana de POPC, os peptídeos não formam um único aglomerado e causam pouca perturbação na bicamada. Já na membrana de POPG, o efeito da interação do aglomerado de peptídeos é acentuado, provocando grandes deformações na bicamada lipídica, praticamente a destruindo. Esse fenômeno sugere um possível mecanismo carpete para ação do peptídeo sobre a membrana fosfolipídica de bactérias. / Antimicrobial peptides are important components of defense system in various organizations against possible invaders. They are generally small (100 aminoacids), cationic and amphipathic. They have stimulated the interest of the scientific community for its ability to act against microbes that cannot develop resistance to these peptides. That is, they emerge as complement and/or alternative to the use of conventional antibiotics. This study developed a computational model of a hybrid peptide pediocin A (Nterminal) and plantaricin 149a (C-terminal), two bactericidal peptides. Experimental data obtained by the group of prof. Dr. Rosângela Itri (IFUSP) were used for modeling and compare the results. MD simulations were made of the peptide interacting with pure and mixed POPC and POPG membranes. These simulations were performed using the parameters of the force field GROMOS 53A6 and 54A7. Simulations with a single copy of the peptide revealed that the force field 54A7 was the most appropriate for modeling these systems. The secondary structure maps showed that the peptide acquires a more ordered configuration when interacting with membranes with higher amounts of POPG in its composition. The simulations with two copies of the peptide suggest that the peptide interacts and penetrates the POPG layer via the C-terminal part. In the simulation with POPC membrane, none of the end portions remained stable within the membrane. The effect of increasing the peptide concentration of was examined by placing five and ten copies of the peptide to interact with the membranes. In the POPC membrane, the peptides do not form a single cluster and they cause little disturbance in the bilayer. In the POPG membrane, the interaction of peptides cluster is enhanced, causing large deformation and practically destroying the lipid bilayer. This phenomenon suggests a possible carpet mechanism of action of the peptide on the phospholipid membrane of bacteria.

Labaditina é um decapeptídeo cíclico, hidrofóbico, extraído da Jatropha Multifida, uma planta da família Euphorbiaceae. É mais resistente à degradação proteolítica que seus respectivos isômeros lineares; e forma pontes de hidrogênio internamente, facilitando sua inserção em membrana biológica. Estudos tem mostrado que a restrição conformacional dos peptídeos cíclicos aumenta sua afinidade e especificidade à membrana. Devido à essas características físicas e às atividades biológicas apresentadas, tais como inibição da via clássica do sistema complemento humano in vitro e atividade antibacteriana para Streptococcus mutans, este peptídeo tem ganhado interesse biológico e farmacológico. Sobretudo, ainda não é conhecido seu mecanismo de ação. Devido à isso, os peptídeos Labaditina (Lo) e o análogo linear (L1), estruturalmente diferentes, foram estudados com o objetivo de obter informações quanto ao mecanismo de ação, interação e possíveis alterações estruturais frente a membranas biológicas. O comportamento do Lo e L1 foi avaliado na presença de diferentes composições de lipídios (DPPC, DPPC:Chol (9:1), DPPC:DPPS (8:2)) e de detergentes (SDS e LPC), utilizando sistemas miméticos de membrana: monocamada, micela e lipossomo. Em monocamada, sistema planar, foi observado um aumento da pressão superficial, provavelmente causado pela presença de peptídeo. Nos sistemas compostos por DPPC:Chol e DPPC:DPPS o efeito foi maior na presença do L1, sugerindo interação eletrostática entre o peptídeo e as monocamadas. Já o peptídeo Lo, por não possuir carga, apresentou maior interação com a monocamada de DPPC, por ser zwitteriônica. Resultados similares foram obtidos através do estudo com lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:Chol (9:1) e DPPC:DPPS (8:2). Em todos os meios, através da espectrofotometria de fluorescência, foi observado um blue-shift, ou seja, migração do triptofano para um ambiente mais apolar. Para o Lo, isso foi maior na presença de DPPC; para o L1, na presença de DPPC:Chol e DPPC:DPPS. Através do DSC foi observado um aumento da entalpia e diminuição da cooperatividade (t1/2), causado pela presença de peptídeo na bicamada. Em DPPC:Chol (9:1) e DPPC:DPPS esse efeito foi maior na presença do L1; e em DPPC, na presença do Lo, confirmando os resultados anteriores. Essas interações peptídeo-mimético de membrana foram acompanhadas por mudanças conformacionais, observadas através do CD. O peptídeo Lo, tanto em meio aquoso, quanto na presença dos diferentes lipossomos está não-ordenado, entretanto, possui diferenças conformacionais em cada meio. O peptídeo L1 em meio aquoso apresenta estrutura ao acaso com interação entre os triptofanos, porém em DPPC e em DPPC:Chol (9:1) sofre alteração conformacional, distanciando os triptofanos; em DPPC:DPPS (8:2) sofreu alteração para -folha. Isso demonstra que a composição lipídica induz diferentes conformações nos peptídeos e pode afetar seu mecanismo de ação. No estudo com micelas também foi observado interação de ambos os peptídeos com SDS, e também com LPC. Em SDS os estudos sugerem que o L1 está mais inserido no meio apolar que o Lo; já em LPC, o Lo. Esses peptídeos também apresentaram alteração conformacional na presença das micelas. O peptídeo Lo, tanto em SDS, quanto em LPC, apresentou conformação não-ordenada, porém diferentes. Já o peptídeo L1 apresentou conformação -folha na presença de SDS e LPC, porém também com diferenças. Os resultados demonstram que o peptídeo com estrutura linear (L1) possui maior liberdade conformacional. Portanto, alguns fatores dirigem o processo de interação destes peptídeos: conformação e hidrofobicidade. Devido à diferença estrutural (cíclica e linear), esses peptídeos conferem diferentes hidrofobicidades, e isso interfere na conformação da molécula, além do meio lipídico. E finalizando o estudo, foi identificado através da DM que o resíduo de triptofano da posição 2 é o aminoácido mais inserido no meio apolar das micelas, após interação. Assim, um possível mecanismo de interação do peptídeo Lo é baseado, inicialmente, na adsorção do peptídeo na superfície lipídica. Em seguida ocorre a interação hidrofóbica membrana-peptídeo, acompanhada pela inserção do triptofano da posição 2 na região mais profunda da membrana, induzindo alterações conformacionais na molécula mediante a interação, dos outros resíduos, com a membrana. / Labaditin is a cyclic decapeptide with high hydrophobic character, extracted from Jatropha Multifida, a plant from Euphorbiaceae family. It is more resistant to proteolytic degradation than its corresponding linear isomers. Studies have been showed that conformational restriction of cyclic peptide increases its affinity and specificity to the membrane. Due to these physical characteristics and to the biological activities shown, such as inhibition of the classical pathway of human complement system in vitro and antibacterial activity for Streptococcus mutans, this peptide has attracted biological and pharmacological interest. However, neither the target nor the action mechanism are known yet. For this reason, the Labaditin (Lo) and the linear analogue (L1) peptides, different structures, were studied in an attempt to get information regarding the mechanism of action, interaction and possible conformational changes due to the interaction with biological membranes. The behavior of Lo and L1 was studied in the presence of different lipid compositions (DPPC, DPPC:Chol (9:1), DPPC:DPPS (8:2)) and of detergents (SDS and LPC), using membrane mimetic systems: monolayer, micelle and liposome. In monolayer, planar system, it was observed an increase of surface pressure, probably caused by the presence of peptide. In the systems composed by DPPC:Chol and DPPC:DPPS the effect was greater in the presence of L1, implying electrostatic interaction between the peptide and the monolayers. Lo peptide, on the other hand, due to the fact that it does not have charges, presented greater interaction with the DPPC monolayer, a zwitterionic molecule. Similar results were obtained through studies with liposome composed by DPPC, DPPC:Chol (9:1) and DPPC:DPPS (8:2). In all environments, through fluorescence spectroscopy, a blue-shift was observed, which means, migration of the tryptophan to a more non-polar environment. For Lo, it was higher in the presence of DPPC; for L1, in the presence of DPPC:Chol and DPPC:DPPS. Using the DSC technique an increase of enthalpy and a decrease of cooperativity was observed (t1/2), due to the presence of peptide in the bilayers. In DPPC:Chol (9:1) and DPPC:DPPS this effect was greater in the presence of L1; while in DPPC, in the presence of Lo, confirming the previous results. These peptide-membrane mimetic interaction was followed by conformational changes, observed through the CD. The Lo peptide has a unordered conformation in aqueous environment, and in the presence of liposomes also is unordered, although with differences. L1 peptide in aqueous environment presents random coil structure with interaction between tryptophan, but in DPPC and in DPPC:Chol (9:1) it suffers conformational changes, distancing tryptophan; in DPPC:DPPS (8:2) it changes to -sheet. This demonstrates that the lipidic composition induces conformational changes in peptides and it may affect their mechanism of action. In the study with micelles it was also observed interaction between peptides-SDS, and also with peptides-LPC. In SDS, the studies suggest that L1 is more inserted in the non-polar environment than Lo; in LPC, Lo is more inserted. These peptides also presented conformational changes in the presence of micelles. Lo peptide, both in SDS, and in LPC, presented unordered conformation, but differently. L1 peptide presented -sheet conformation in the presence of SDS and LPC, but also with differences. The results show that the peptide with linear structure (L1) has greater conformational liberty. Therefore, some factors are responsible to the interaction process of these peptides: conformation and hydrophobicity. Due to the structural difference (cyclic and linear), these peptides present different hydrophobicity, and it interferes in the conformation of the molecule, as well as the lipidic environment. On the last study it was identified through DM that the tryptophan residue from position 2 is the amino acid most inserted in the micelles, after interaction. Thus, a possible Lo peptide interaction mechanism is based, initially, on the adsorption of the peptide on the lipidic surface. Next, there is a hydrophobic interaction peptide-membrane followed by the tryptophan insertion of the position 2 in the deepest region of the membrane, inducing conformational changes in the molecule, through the interaction of the other residues with the membrane.

As mitocôndrias são os principais locais de geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), que são produzidos como subprodutos da cadeia de transporte de elétrons. O ferro livre e as ERO podem se envolver em processos potencialmente nocivos, sendo que a desregulação do metabolismo do ferro nessa organela tem sido associada a várias doenças, como a Ataxia de Friedreich (FA). O transporte seletivo de quelantes de ferro a esta organela é proposto como um meio de melhorar sintomas de FA. A desferrioxamina (DFO) é um sideróforo bacteriano com grande afinidade ao ferro, mas baixa penetração celular. Já os peptídeos altamente catiônicos TAT49-57 (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 1A (Fx-Arg-Fx-Lys-Fx-Arg-Fx -Lys), SS02 (Dmt-(D)-Arg-Phe-Lys) e SS20 (Phe-(D)-Arg-Phe-Lys) são conhecidos por permear as membranas citossólicas e mitocondriais. Nós preparamos conjugados de DFO com peptídeos que penetram as mitocôndrias e estudamos suas características de ligação ao ferro in vitro. Eles foram preparados e conjugados em fase sólida com DFO (produzindo quatro mtDFO), que em seguida foram purificados e caracterizados por meio de LC/MS e análise de aminoácidos. Os mtDFO de alta pureza exibiram capacidade de ligação de ferro idêntica à do quelante livre DFO. Os mtDFO também foram capazes de suprimir a oxidação catalisada pelo sistema ferro-ascorbato. A fim de avaliar a localização intracelular dos mtDFO, estes foram marcados com TAMRA (mtDFO-TAMRA). Frente a uma linhagem de carcinoma de ovario, os mtDFO foram em geral pouco tóxicos e altamente localizados nas mitocôndrias. Não foram observados níveis expressivos de danos a DNA, indução de apoptose, geração de ERO na mitocôndria, arraste de ciclo celular ou de apoptose. Resultados preliminares da aplicação dos mtDFO a cardiomiócitos murínicos com baixo nível de frataxina (modelo de FA) indicam um restabelecimento de aproximadamente 60% na morfologia mitocondrial, o que pode ser interpretado como uma melhora nas funções dessa organela. Estes resultados indicam que os mtDFO produzidos podem ser uma parte importante no arsenal terapêutico para FA. / Mitochondria are the main site for the generation of reactive oxygen species (ROS) as sub products of electron transport chain. Free iron and ROS may interact to generate potentially harmful species, and iron homeostasis in this organelle has been linked to several diseases, such as Friedreich Ataxia (FA). Selective targeting of iron chelators to mitochondria has been proposed as a means of alleviating FA symptoms. Desferrioxamine (DFO) is a bacterial siderophore with high affinity for iron, however low cell penetration. Highly charged peptides TAT49-57 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 1A (Fx-Arg-Fx-Lys-Fx-Arg-Fx -Lys), SS02 (Dmt-(D)-Arg-Phe-Lys) and SS20 (Phe-(D)-Arg-Phe-Lys) are known as both cell- and mitochondria-permeant. We prepared conjugates of DFO with mitochondria-penetrating peptides and studied their iron binding characteristics in vitro. They were prepared in solid phase and conjugated to DFO (generating four mtDFO), which were then purified and characterized by LC/MS and Amino acid analysis. MtDFO exhibited iron binding ability identical to free DFO. The mtDFO of high purity were also able to quench the oxidation catalyzed by the iron-ascorbate system. Cell localization studies were performed by tagging mtDFO with TAMRA. In A2780 cells, mtDFO displayed in general low toxicity and high levels of mitochondrial location. No expressive levels of DNA damage, apoptosis, mitochondrial ERO generation or cell cycle arresting were observed. Preliminary results of the application of mtDFO on mouse cardiomiocytes with low levels of frataxin (animal model of FA) indicate a recovery of ca. 60% of mitochondrial morphology. This is interpreted as an improvement of the functions of the organelle. These results indicate that mtDFO may be important allies in the therapy of FA.