A esclerose sistêmica (ES) é uma doença difusa do tecido conjuntivo caracterizada por fibrose e envolvimento vascular, com distúrbio generalizado da microcirculação, podendo resultar em hipertensão arterial pulmonar (HAP). Atualmente, com o avanço no tratamento das crises renais, a mortalidade desses pacientes está relacionada basicamente ao envolvimento pulmonar. A HAP grave é de difícil tratamento e de mal prognóstico. O gene do peptídeo natriurético tipo B (BNP) codifica um pró-hormônio que é clivado no cardiomiócito produzindo o hormônio ativo BNP e o fragmento N-terminal do proBNP (NT-proBNP), biologicamente inativo, mas secretado na circulação em quantidades equimolares ao BNP. O NT-proBNP, uma molécula maior contendo 76 aminoácidos, tem meia-vida plasmática mais longa do que a do BNP (120 minutos versus 20 minutos) e, conseqüentemente, níveis circulantes mais elevados, o que facilita sua dosagem do ponto de vista analítico. Os níveis de NT-proBNP estão aumentados não somente em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva e infarto agudo do miocárdio, mas também naqueles com hipertensão arterial pulmonar. Esta revisão aborda aspectos gerais do diagnóstico e manejo da esclerose sistêmica, com ênfase no envolvimento pulmonar; contempla também avaliação da estrutura e da importância dos peptídeos natriuréticos, com foco no NT-proBNP relacionado à hipertensão arterial pulmonar e esclerose sistêmica. / Systemic sclerosis (SSc) is a diffuse connective tissue disease, characterized by skin and visceral fibrosis and vascular dysfunction. It may lead to pulmonary arterial hypertension (PAH). Currently, with the advance in the treatment of renal problems, the mortality of these patients is related basically to pulmonary envolvement. Severe HAP is difficult to treat and has a poor prognosis. The B-type natriuretic peptide (BNP) gene encodes a pro-hormone, which is cleaved in the cardiomyocyte to produce the hormone, BNP, and the biologically inactive N-terminal proBNP (NT-proBNP) fragment. Both are secreted in equimolar quantities. NT-proBNP, composed of 76 amino acids, has a longer half-life than BNP (120 minutes versus 20 minutes), and thus higher circulating levels and better analytical performance. The NTproBNP levels are raised in patients with congestive heart failure, acute myocardial infarction and also in pulmonary arterial hypertension. This review highlights general aspects of diagnosis and management of systemic sclerosis, emphasizing pulmonary involvement. It also assesses the structure and importance of natriuretic peptides, focusing on the NT-proBNP related to pulmonary hypertension and systemic sclerosis.

O peptídeo liberador da gastrina (GRP) está estabelecido como um fator de crescimento no câncer. Os fatores de crescimento desempenham um papel importante na proliferação das células neoplásicas e progressão do câncer, estando envolvidos na invasão local, angiogênese, metástases à distância e apoptose. A superexpressão de receptores para fatores de crescimento em células malignas é geralmente um marcador de agressividade e está associada a um prognóstico reservado. Na busca por novas estratégias no tratamento do câncer, muitos esforços têm sido feitos para se identificar quais são esses receptores e desenvolver terapias dirigidas contra eles, explorando a especificidade molecular. O GRPR já foi identificado em diversas neoplasias humanas, mas até o presente momento não havia nenhum dado na literatura quanto à sua expressão no câncer de colo de útero. Considerando que esta neoplasia é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, objetivamos avaliar neste estudo o perfil de expressão de GRPR em lesões pré-invasivas e invasivas de colo de útero. Através da técnica da imunoistoquímica, lesões cervicais e tecidos não neoplásicos circundantes de 88 mulheres foram selecionados do arquivo de patologia do HCPA e avaliados quanto à expressão de GRPR. O receptor foi detectado em 99% das amostras tumorais, na maioria das vezes exibindo padrão de coloração difuso; moderado ou forte. Os GRPRs foram menos intensamente expressos em ectocervices adjacentes às lesões e praticamente não foram detectados nas endocérvices. Não foram encontradas diferenças na expressão de GRPR entre as formas pré-invasivas e invasivas de neoplasias cervicais. Este estudo demonstrou pela primeira vez a expressão aberrante de GRPRs em neoplasias cervicais humanas. A presença de receptores nos tecidos não neoplásicos circundantes pode ser associada a um papel fisiológico do GRP na renovação epitelial ou representar um processo carcinogênico incipiente. / Gastrin-releasing peptide (GRP) is already established as a growth factor in cancer. Growth factors are involved in cell proliferation and cancer progression, enhancing local invasion, angiogenesis, distant metastasis and apoptosis. Furthermore, the overexpression of growth factor receptors on the cell surface of malignant cells might be associated with a more aggressive behavior and a poor prognosis. Searching for new strategies for cancer treatment, much effort has been done to identify these receptors and to develop targeted therapies exploring their molecular specificity. The GRPR has been identified in many human malignancies, but to date, no information regarding its expression in cervical cancer was found in the literature. Considering that cervical cancer is a very important cause of morbidity and mortality worldwide, we aimed to evaluate the GRPR expression profile in preinvasive and invasive cervical lesions. Cervical lesions and surrounding nonneoplastic tissues from 88 women were selected from the pathology archive of HCPA and evaluated through immunohistochemistry. GRPR was detected in 99% of the neoplastic lesions, mostly exhibiting a diffuse strong staining. The receptors were less intensely expressed in ectocervix surrounding the lesions and were seldom detected in the endocervix. No correlation between GRPR expression and preinvasive and invasive neoplasms was found. This study demonstrated for the first time the aberrant GRPR expression in human cervical cancer. The presence of receptors in nonneoplastic surrounding tissues can be either associated with a physiological role of GRP on epithelium renewal or be related to an incipient carcinogenic processes.

A identificação de epitopos e motivos virais para serem utilizados na imunização de humanos e animais é um objetivo importante e essencial em pesquisa imunológica. No momento, com novas ferramentas de bioinformática, diferentes abordagens são possíveis. A importância da bioinformática reside na possibilidade de trabalhar com grandes quantidades de dados de forma que, várias etapas experimentais do desenvolvimento de vacinas podem ser abreviadas. Quando buscamos por motivos virais (objetivando a vacinação) é necessário estar ciente de todos os passos envolvidos na seleção e apresentação de peptídeos ao sistema imune. Devemos considerar que muitos peptídeos podem ser gerados a partir de uma única proteína, mas apenas uma fração destes peptídeos é realmente apresentada ao sistema imune, pois os peptídeos devem ser capazes de atravessar diferentes “bottlenecks” e apenas aqueles apresentando características específicas serão capazes de estimular o sistema imune. As abordagens apresentadas nesta tese incluem o estabelecimento de um banco de dados de epitopos virais descritos na literatura e a comparação desses epitopos buscando identificar características similares entre eles. Os epitopos selecionados foram classificados de acordo com suas propriedades físico-químicas (polaridade e carga dos grupos R de seus aminoácidos). Das 69 sequências de epitopos incluídas em nossa base de dados, 31 (44,93%) apresentaram, em sítios potenciais de ancoragem ao MHC, aminoácidos com resíduos não-polares. A partir desses resultados é possível inferir o seguinte motivo consenso: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM] para epitopos virais. As sequências virais foram então comparadas àquelas de outras proteínas buscando verificar se elas são exclusivamente representadas em vírus: 1) primeiro os epitopos foram comparados a todas as sequências depositadas no GenBank (independente da origem); 2) a seguir, as comparações foram direcionadas a sequências de origem humana. A segunda abordagem foi usada para verificar o potencial de indução de reações autoimunes. As sequências de saída foram classificadas de acordo com seu organismo de origem. Das 31 sequências alinhadas de acordo com a similaridade dos resíduos de ancoragem, 29 (93,54%) apresentaram similaridade significante (estabelecida como 80% ou mais) com outras sequências virais. Destas, 12 (38,71%) apresentavam similaridade apenas com outras sequências de origem viral, nove (29,03%) apresentavam similaridade com sequências de origem bacteriana e duas (6,45%) apresentavam similaridade com sequências humanas, sugerindo que a grande maioria dos epitopos virais pode ser utilizada no desenvolvimento de vacinas. A habilidade dos epitopos serem gerados pela via de processamento de antígenos foi também testada. Uma parte das proteínas citosólicas sofre o processo de ubiquitinação que as dirige para o complexo enzimático proteolítico, denominado proteossomo. Do total de epitopos, cinquenta (73,53%) apresentaram uma sequência que permitia um corte exato na extremidade carbóxi terminal. Este número alcançou 86,67% (26 epitopos), quando restringimos a análise aos epitopos apresentando os resíduos de ancoragem compartilhados, sugerindo que a maioria dos epitopos apresentava os requerimentos clássicos para o processamento antigênico. Das estruturas do Protein Data Bank e de dados de modelagem, foi possível observar que os sítios de clivagem preditos na região amino terminal dos epitopos eram estruturalmente relacionados a alças na estrutura da proteína original (66,7%). Estes dados sugerem que há uma clivagem preferencial em alças (χ2=6.09 p=0.047). O banco de dados de ligantes peptídicos do EpiJen foi utilizado para avaliar a capacidade dos epitopos em serem carreados pelo complexo da TAP. A partir dessa comparação observamos que o motivo predito estava mais representado do que todas outras possíveis sequências entre as saídas, sugerindo novamente que estas características são necessárias à seleção e apresentação de epitopos. Concluindo, sugerimos que é possível identificar padrões entre epitopos derivados de virus e que a predição de motivos virais conservados pode ser aplicada ao desenvolvimento de vacinas. Além disso, considerando a existência de reatividade cruzada, sugerimos que é possível imunizar contra uma quantidade consideravelmente grande de alvos virais utilizando um número de epitopos reduzido. Estudos sobre os aspectos e características dos epitopos virais são o primeiro passo rumo a uma nova geração de vacinas. / The identification of epitopes and viral motifs to be used in the immunization of both humans and other animals is an important and essential objective in immunology research. At present, with the new tools of the bioinformatics different approaches are possible. The importance of the bioinformatics is exemplified by its capacity to handle a large amount of data in order to bypass several methodological steps in vaccine development. When searching for conserved viral motifs it is necessary to be aware of all the steps involved in peptide selection and presentation. In this way, we should consider that many different peptides can be generated from a given protein, but only a fraction of these peptides will actually be presented to the immune system. The approaches presented in this thesis include the establishment of a viral epitope databank from sequences described in the literature and the comparison of these epitopes in order to identify similar features among then. The selected epitopes were classified according to their physicochemical properties (i.e. polarity and charge of their amino acid–R groups). From the 69 sequences of epitopes included in our database, 31 (44.93%) presented, in potential MHC anchor sites, amino acids whit non-polar residues. From this, it is possible to infer the following consensus motif: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM]. The viral sequences were then compared to those of other proteins in order to verify if they are exclusively represented in viruses: 1) first, the epitopes were compared to all sequences stored in GenBank (disregarding their origin); 2) then, the comparisons were directed to the sequences from human origin. The output sequences were classified according to the organism of origin. From the 31 sequences aligned according to their anchor residues, 29 (93.54%) presented significant similarity (established as 80% or above) with other viral sequences. From these, 12 (38.71%) presented similarity only with other sequences from viral origin, nine (29.03%) presented similarity with sequences from bacterial origin and two (6.45%) presented significant similarity to human sequences, suggesting that a great majority of these viral epitopes could be used in vaccine development. The hability of the epitopes to be generated by antigen processing pathway was also tested. A fraction of all cytosolic proteins suffers the ubiquitination process that directs them to the proteolytic enzymatic complex, called proteasome. From the whole databank, fifty epitopes (73.53%) presented a sequence that allowed a precise cut at the carboxy terminal region. This number reached 86.67% (26 epitopes) when we restricted this analysis to the epitopes presenting the shared anchor residues, suggesting that the majority of the epitopes presented the classical requirements to antigenic processing. From the Protein Data Bank structures and from the modelling data, we could observe that the predicted cleavage sites on the amino-terminal region of the epitopes were structurally related to loops on the structure of the original protein (66.7%), suggesting a preferential cleavage at loops (χ2=6.09 p=0.047). The TAP ligands peptide database of EpiJen was used in order to evaluate the epitopes capacity to be carried by the TAP complex. We were able to observe that our predicted motif was present more frequently than every other possible sequence among the outputs, again suggesting that this feature is necessary to epitope selection and presentation. In conclusion, we suggest that it is possible to identify patterns among virus-derived epitopes and that the prediction of viral conserved motifs would allow the development of vaccines. Also, considering the existence of cross reactivity, we suggest that it will be possible to cover a considerably large amount of targets using a limited number of viral peptides. Equally important is the immunogenicity of viral peptides, since only a fragment and not the whole viral particle will challenge the immune system, therefore reducing risks of undesired immune responses. Studies on viral epitopes features and characteristics are the first step towards a new generation of vaccines.

O peptídeo liberador da gastrina (gastrin-releasing peptide, GRP), pertencente à família dos peptídeos semelhantes à bombesina, e seus receptores estão presentes em todo o sistema nervoso central, em particular em áreas límbicas cerebrais como o hipocampo e a amídala, as quais estão envolvidas de forma importante na regulação emocional, na função cognitiva e em transtornos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos. Há estudos sugerindo que receptores GRP podem ter um papel na regulação da plasticidade sináptica, de respostas emocionais e da formação da memória. Apesar disso, esse sistema tem sido relativamente pouco estudado quanto a seu papel na função cerebral e não são conhecidos os mecanismos celulares envolvidos na transdução de sinal ativada por receptores GRP no sistema nervoso. Estudos em outros tipos de células sugerem que a ativação de receptores GRP pode levar a uma ativação das vias de transdução de sinal mediadas por proteína cinase C (protein kinase C, PKC) e pela proteína cinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase, MAPK). O envolvimento da via da adenilato ciclase/AMPc/proteína cinase A (protein kinase A, PKA) é controverso. Por outro lado, já está estabelecido que as vias de sinalização da PKC, MAPK e PKA estão envolvidas de forma crucial na formação da memória emocional na área CA1 do hipocampo dorsal. Assim, é possível que a ativação de receptores GRP module a memória através da ativação de uma ou mais dessas vias. No presente trabalho, propomos uma abordagem farmacológica de investigação, utilizamos para isso, um modelo bem estabelecido de memória emocional em roedores, para analisar as interações entre receptores GRP e os eventos biológicos que se seguem à ativação do receptor, ou seja, a ativação de cascatas de sinalização neuronal mediadas por proteínas cinases, na região CA1 do hipocampo dorsal. Ratos Wistar machos foram tratados com uma infusão bilateral de agonista do GRPR, bombesina, no hipocampo dorsal imediatamente após o treino em esquiva inibitória. Doses intermediárias de bombesina induziram uma facilitação, enquanto doses mais altas prejudicaram a retenção da memória medida 24 horas após o treino. A facilitação da memória induzida pela bombesina foi prevenida por infusões pré-treino de um antagonista GRP ou de inibidores de PKC, MAPK ou PKA, mas não por um antagonista do receptor de neuromedina B (NMB). Os resultados indicam que a modulação da consolidação da memória por GRPRs hipocampais depende das vias da PKC, MAPK e PKA. / Gastrin-releasing peptide (GRP), a bombesin-like peptide, and their receptors are gifts in all the central nervous system, particular in cerebral limbic areas as hippocampus and amigdala, which are involved in an important way in the emotional regulation, cognitive function and neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. Studies suggest that GRPR can act in synaptic plasticity regulation, emotional answers and memory formation. Although this, this system has been relatively little studied how much its paper in the cerebral function and the involved cellular mechanisms in the transdução of signal are not known activated for receivers GRP in the nervous system. Studies in other cell types suggest that activation of GRPR can active signal transduction pathways mediated by protein cinase C (protein kinase C, PKC) and mitogen-activated protein kinase (MAPK). The envolvement of protein kinase A (PKA) pathways are controversial. Already it is established that PKC, MAPK and PKA signal pathways are involved of crucial form in emotional memory formation in CA1 area of dorsal hippocampus. Thus, it is possible that the activation of GRPR modulates the memory through the activation of one or more than these ways. In present study, we propose an pharmacological investigation, using an established emotional memory model in rodents, to analyze the interactions between GRPRs and the biological events following to the receptores activation in other words, the neuronal sign cascades activation mediated by proteins kinases, in CA1 hippocampus area. Male Wistar rats received bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin into the dorsal hippocampus immediately after inhibitory avoidance training. Intermediate doses of bombesin enhanced, whereas a higher doses impaired 24-h memory retention. The bombesin-induced memory enhancement was prefented by pretraining infusions of a GRPR antagonist or inhibitors of PKC, MAPK and PKA, but not a neuromedin B (NMB) antagonist. We conclude that memory modulation by hippocampal GRPRs is mediated by the PKC, MAPK and PKA pathways.

Resumo não disponível

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-04-05T17:22:12Z No. of bitstreams: 1 2016_GabrielAvohayAlvesCampos_Parcial.pdf: 296772 bytes, checksum: e004e390adc429a7c62acd3c1277343a (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-04-06T11:11:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_GabrielAvohayAlvesCampos_Parcial.pdf: 296772 bytes, checksum: e004e390adc429a7c62acd3c1277343a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-06T11:11:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_GabrielAvohayAlvesCampos_Parcial.pdf: 296772 bytes, checksum: e004e390adc429a7c62acd3c1277343a (MD5) / A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa implacável e fatal, progressivamente debilitante e que causa uma série de prejuízos para os seus portadores, tanto econômicos quanto sociais e psicológicos. As principais características patológicas da DP são a degeneração de neurônios dopaminérgicos dos Núcleos da Base, em especial da Substância Negra (SN), e a presença de corpos de inclusão eosinófilos no citoplasma dos neurônios, os chamados Corpos de Lewy. A ausência de medicamentos aprovados para uso em humanos capazes de modificar a progressão da doença, somada aos efeitos adversos associados às terapias existentes, traz urgência no desenvolvimento tanto de novas ferramentas no estudo da DP quanto de novos tratamentos mais eficazes ou que modifiquem o curso da doença. Este trabalho teve como objetivo, portanto, avaliar a atividade antiparkinsoniana do peptídeo sintético Neurovespina, análogo a um peptídeo isolado de vespa social, no modelo murino da Doença de Parkinson por injeção unilateral intraestriatal da neurotoxina 6-OHDA. Foram utilizados ensaios para avaliar, após três administrações do peptídeo e durante 22 dias, o efeito de três diferentes doses da Neurovespina. Para tal finalidade, foram realizados os seguintes procedimentos: avaliação do comprometimento motor no equipamento RotaRod, avaliação sensório-motora no teste de remoção de fita, teste de rotações induzidas por apomorfina, além da marcação imunoistoquímica da enzima tirosina hidroxilase (TH) na região da SN (e da região VTA anexa à SN) e de projeções dopaminérgicas na região do estriado (Densidade Ótica estriatal). Avaliando-se o comprometimento motor dos animais por meio da aferição da latência de queda dos animais no aparelho RotaRod, o tratamento com Neurovespina nas doses de 7mg/kg e de 4mg/kg resultou em uma diminuição do comprometimento motor induzido pela administração de 6-OHDA, de forma persistente ao longo de todo o período experimental. Na avaliação sensitivo-motora, somente foi possível observar diferenças significativas do grupo Sadio e o tratado com 4mg/kg em comparação com o grupo Lesado no último dia de experimento. O teste de rotações induzidas por apomorfina demonstrou diferença significativa somente entre os controles Sadio e Lesado, além de uma leve diminuição na média de rotações do grupo tratado com 7mg/kg (não significativa). Na análise de neurônios THr remanescentes (porcentagem em relação ao lado contralateral) na SN, foi observada diferença significativa entre as médias do tratamento com 4mg/kg e o controle Lesado, indicando ação neuroprotetora do peptídeo em neurônios dopaminérgicos nessa dose. O mesmo, entretanto, não foi observado para a região VTA, tão pouco para a análise Densidade Ótica. Estes dados mostraram que a administração do peptídeo Neurovespina na dose de 4mg/kg foi capaz não só de diminuir a descoordenação motora gerada pela infusão intraestriatal de 6-OHDA como também foi capaz de proteger os neurônios dopaminérgicos da SN, se mostrando uma potencial ferramenta para o estudo da DP e potencial fármaco-modelo para o desenvolvimento de novas moléculas neuroativas. / Parkinson's Disease (PD) is a relentless, progressively debilitating and fatal neurodegenerative disorder that causes both economic, social and psychological damage in patients with this disorder. The main pathological features of PD are the degeneration of dopaminergic neurons of the basal ganglia, especially the Substantia Nigra (SN), and the presence of eosinophilic inclusion bodies in the cytoplasm of neurons, the so-called Lewy bodies. In addition to the fact that there is no drug approved for use in humans able to modify the progression of the disease, the standard treatment for PD is associated with several adverse effects. This scenario brings urgency in the development of new tools for the study of PD, as well as new treatments that are more effective and able to modify the course of degeneration. Therefore, this study evaluated the antiparkinsonian activity of the synthetic peptide Neurovespina, analogous to a peptide isolated from a social wasp, in the murine model of PD by intrastriatal unilateral injection of the neurotoxin 6-OHDA. For this purpose, several assays were conducted, after three administrations of the peptide and for 22 days, to assess the effect of three different doses of Neurovespina. For such purposes, the following procedures were performed: assessment of motor impairment on the RotaRod equipment, motor-sensory evaluation in the adhesive tape removal test, apomorphine induced rotations test and immunohistochemical labelling of the enzyme tyrosine hydroxylase (TH) of the SN (and VTA region near the SN) and dopaminergic projections into the striatum region (striatum Optical Density). Evaluating motor impairment by measuring the animal’s latency to fall in the RotaRod apparatus, Neurovespina at the doses of 7mg/kg and 4 mg/kg resulted in a decrease of the motor impairment induced by the administration of 6-OHDA. Moreover, this effect was persistent throughout the experimental period. In the sensory-motor evaluation by the tape removal test, significant difference between the group treated with 4 mg/kg and the Lesioned group was observed only in the last of three evaluations. The apomorphine-induced rotations test showed a significant difference only between the Sham and Lesioned controls, plus a slight decrease in the average rotations of the group treated with 7 mg / kg (not significant). Analysis of the remaining THr neurons in SN showed significant difference between the treatment with 4 mg / kg and the Lesioned control, indicating a neuroprotective action of the peptide on dopaminergic neurons at this dose. In account of the VTA region and striatal Optical Density, there was no difference between the Lesioned group and the treatments. These data showed that the administration of the Neurovespina peptide at a dose of 4 mg/kg not only reduced the motor impairment generated by intrastriatal infusion of 6-OHDA, but also protected dopaminergic neurons in the SN. This indicates Neurovespina as a potential tool for the study of PD and a potential template molecule for the development of novel neuroactive compounds.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-16T15:09:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 989533 bytes, checksum: 691738d9623dc109309055a3300f56c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T15:09:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 989533 bytes, checksum: 691738d9623dc109309055a3300f56c3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O vírus da Dengue é um arbovírus da família Flaviviridae que acomete grande parte da população mundial, possuindo quatro sorotipos (1-4), os quais ocasionam respostas imunes duradouras, mas diferentes. São vírus de RNA fita simples com polaridade positiva de aproximadamente 11Kb, codificando 10 proteínas, sendo 3 delas estruturais e 7 não estruturais. Estudos revelam que peptídeos de secreção de anfíbios possuem várias funções, dentre elas estão atividades antiviral e antimicrobiana, com isso, sequências destes peptídeos vêm sendo sintetizadas e testadas in vitro, a fim de obter compostos ativos para a fabricação de drogas de amplo espectro e de múltipla aplicabilidade. Os peptídeos de atividade antimicrobiana (PAM) são os mais estudados e eles devem apresentar uma toxicidade seletiva e rápida ação frente aos microorganismos. Por não existir nenhuma droga antiviral eficaz conta o vírus em questão, temos por objetivo avaliar a atividade antiviral de um peptídeo sintético, denominado HS-1, onde sua sequência foi obtida previamente da secreção do anfíbio anuro Hypsiboas semilineatus. Após realizar um teste de citotoxicidade, foram realizados ensaios de neutralização a fim de se investigar seu mecanismo de ação contra o vírus da dengue. Com o intuito de verificar uma possível proteção dos receptores celulares, o peptídeo foi incubado previamente com as células, em um ensaio posterior o peptídeo foi incubado previamente com o vírus, para verificar se o PAM agia sobre a partícula viral e em seguida foram realizados ensaios para verificar se o peptídeo tinha ação sobre a adsorção, internalização e replicação viral. Os resultados foram promissores, pois mostraram que o peptídeo em questão age sobre a partícula viral dos 4 sorotipos da dengue de uma forma muito eficaz, sendo que nas maiores concentrações a inibição chega a 100%, além de ter efeito sobre a inibição da adsorção, o que foi observado para os sorotipos 2 e 3. / Dengue virus is an arbovirus of Flaviviridae family, which has been the most within the world population. There are four serologic types of dengue virus (DENV 1-4), which cause long lasting, though different, immune responses. They are single positive-strand RNA viruses with of approximately 11Kb in length. This RNA is responsible for encoding 10 proteins, 3 structural and 7 non-structural. Several studies reveal that some peptides from skin of amphibians have antimicrobial and antiviral activities. Therefore, sequences of these peptides were synthesized and tested in vitro in order to obtain biologically active compounds to develop drugs with wide spectrum and multiple applicability. The antimicrobial peptides are the most studied and they must present a selective toxicity and quick action against microorganism. Effective drugs against dengue virus haven’t been developed yet. Thereat, the present study aimed to evaluate the antiviral activity against dengue virus of the synthetic peptide HS-1, which sequence was previously obtained from the skin of the anuran Hypsiboas semilineatus. In the cytotoxicity assay, and afterwards neutralization assays were performed to investigate the mechanism of action of the HS-1 peptide against Dengue virus. The first neutralization assay was carried out to determine whether the HS-1 peptide could confer protection to cell receptors against viral infection. For this, the peptide was pre-incubated with VERO cells. In the second neutralization assay the peptide was pre-incubated with Dengue virus to evaluate the ability of this peptide to act directly on viral particle. The subsequent assays were performed in order to determine whether the peptide would act over adsorption, internalization and virus replication. The results were promising; they showed that the peptide in question acts on the viral particle of the four dengue serotypes in a very effective manner. With higher concentrations of peptide, the inhibition reached 100%. In addition, it was found very promising results against inhibition adsorption to serotypes 2 and 3.

A osteoindução tem sido tentada por diversos meios para tratar defeitos ósseos. Alguns estudos clínicos têm demonstrado que um peptídeo de união celular sintético associado à matriz de osso bovino inorgânico tem a capacidade de melhorar a regeneração óssea. Estes estudos sugeriram que são necessárias mais informações histológicas para uma melhor compreensão deste processo. O objetivo deste estudo foi avaliar clínica e histologicamente o uso de um peptídeo de união celular adsorvido a superficie da matriz inorgânica derivada de osso bovino, associado ou não à membrana reabsorvível na regeneração de defeitos ósseos alveolares crônicos. Seis cães adultos, machos, de raça não definida foram usados. Defeitos alveolares bilaterais tipo classe III foram criados cirurgicamente após a extração dos segundos pré-molares. Após um período de cicatrização de 8 semanas, retalhos muco-periósteos totais foram elevados e o material, associado ou não à membrana absorvível foi implantado em 10 sítios contralaterais. Dois sítios não receberam nenhum material e serviram como controle. Os retalhos muco-periósteos foram reposicionados sobre o material e suturados. Avaliações clínicas foram realizadas no pré e pós-operatório utilizando sonda periodontal e espessímetro. Após 12 semanas, os animais foram sacrificados, amostras foram colhidas, processadas e avaliadas histologicamente. Os resultados clínicos não mostraram aumento estatisticamente significativo nos sítios controle (0.0 0.6 mm). Nos sítios teste com e sem o uso da membrana reabsorvível, um considerável aumento do rebordo foi observado (2.9 1.9 mm e 3.6 2.0 mm, respectivamente). Histologicamente, todos os sítios teste demonstraram formação óssea ativa com osteoblastos cubóides e deposição de matriz osteóide. O crescimento ósseo preencheu os sítios tratados com o peptideo associado a membrana. Algumas partículas do material foram identificadas no tecido fibroso celularizado que circundava o osso trabeculado neoformado. Este material associado ou não a membrana reabsorvível, produziu um aumento clínico de rebordo ósseo alveolar significativo. Histologicamente, foi observada neoformação óssea em todos os sítios teste. A associação da membrana reabsorvível pareceu influenciar positivamente o processo de formação óssea / Osteoinduction has been attempted by several means to treat osseous defects. Some clinical studies have demonstrated that a synthetic cell binding peptide with anorganic bovine derived bone matrix has the ability to enhance bone regeneration. These studies have suggested that more histological data is necessary to better understand this process. The objective of this study was to evaluate clinically and histologically the use of this material associated or not with a bioabsorbable membrane to regenerate localized chronic alveolar ridge defects. Six adult, male mongrel dogs were used in this study. Bilateral, class III, alveolar defects were surgically produced following extraction of the mandibular second premolar teeth. After an 8-week healing interval, mucoperiosteal flaps were elevated. The material associated or not with resorbable membrane was implanted into contralateral defects in 10 sites. Two sites received no biomaterial to serve as controls. Mucoperiosteal flaps were advanced over the constructs and sutured. Clinical evaluation pre and post-augmentation was made utilizing periodontal probe and caliper. The animals were euthanised at 12 weeks post-augmentation and block specimens processed for histologic evaluation. Clinical results showed no significant statistical augmentation on the control group (0.0 0.6 mm). In all experimental sites, whith and whithout resorbable membrane, relevant ridge augmentation was observed (2.9 1.9 mm and 3.6 2.0 mm, respectively). Histologically, all experimental sites showed active bone formation with plump osteoblast and osteoid matrix deposition. Bone ingrowth filled the area of the defects treated with the material associated to the membrane. Few particles were seen in the cellular fibrous tissue surrounding the new formed bone trabeculae. The material with or without membrane can produce a significant clinical ridge augmentation. Bone formation was histologically observed in all test areas. The association of a membrane seemed to enhance the process of bone formation

Introdução: A artrite reumatoide é caracterizada pela invasão de fibroblastos sinoviais no interior da cartilagem e pela erosão do osso ocasionando uma progressiva destruição da articulação. A invasão de fibroblastos in vitro é correlacionada com o dano articular na AR, entretanto pouco é sabido sobre esta regulação. O peptídeo liberador da gastrina (GRP) é um homólogo funcional da bombesina e sua sinalização através de seu receptor está envolvida em diversas funções, incluindo a resposta inflamatória. O GRP e seu receptor (GRPR) têm sido encontrados na membrana sinovial e no fluído de pacientes com AR, mas o envolvimento dos mesmos na AR não está completamente elucidado. Em paralelo, estudos tem mostrado que a sinalização GRP/GRPR está relacionada com a sinalização PI3K/AKT. Esta última, é uma via de sinalização que apresenta um papel chave em diversos processos celulares, como proliferação, migração e invasão celular. O RC-3095 é um antagonista do GRPR. Objetivo: Avaliar o envolvimento do GRP e do GRPR no comportamento invasivo dos FLS de camundongo com artrite, bem como o envolvimento do GRP na sinalização da via PI3K/AKT Métodos: FLS foram isolados das articulações de camundongos com artrite induzida por colágeno. A expressão de GRPR foi investigada por imunocitoquímica e por western blot. A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de sulforodamina B após o tratamento dos FLS com GRP e/ou RC-3095 (antagonista do GRP), e/ou Ly294002 (inibidor da via PI3K/AKT) e a capacidade invasora dessas células após o tratamento com GRP, RC-3095 ou Ly249002 foi avaliada utilizando um ensaio de invasão em matrigel. A fosforilação da AKT foi analisada através de western blot. Resultados: A proteína GRPR foi detectada por imunocitoquímica e western blot. A exposição ao GRP aumentou cerca de duas vezes a invasão comparado com células não tratadas (p<0,05), enquanto que o RC-3095 reverteu este efeito (p<0,001). O GRP também aumentou a expressão de AKT fosforilada. Por fim, quando adicionado Ly294002 com GRP, o mesmo preveniu o aumento da invasão induzida por GRP (p<0.001). Conclusão: Esta é a primeira vez que a expressão de GRPR está sendo demonstrado nos FLS. Além disso, este trabalho sugere que o GRP aumenta o comportamento invasor dos FLS. Este efeito ocorre em parte através da ativação da AKT. Entretanto, mais estudos devem ser realizados sobre a via GRP/GRPR, já que a mesma pode ser relevante para o desenvolvimento de terapias cujo alvo são os FLS. / Introduction: Rheumatoid Arthritis (RA) is characterized by invasion of fibroblast-like synoviocytes (FLS) into de articular cartilage and by bone erosion leading to progressive joint destruction. FLS in vitro invasiveness correlates with articular damage in RA, yet little is known about this regulation. Gastrin-releasing peptide (GRP) is a functional homologue of bombesin, and its receptor signaling is involved in several functions, including the inflammatory response. GRP and its receptor (GRPR) have been found in synovial membrane and fluid of RA patient, but their involvement with RA is not completely elucidated. In parallel, studies have shown that GRP/GRPR is related with PI3K/AKT signaling. This pathway plays a key role in multiple cellular processes such as cell proliferation, migration and invasion. RC-3095 is an antagonist of GRPR. Objective: To examine the role of gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptor (GRPR) on the invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes (FLS) from arthritic mice, as well as to evaluate GRP-induced signaling on PI3K/AKT pathway Methods: FLS were isolated from the joints of mice with collagen-induced arthritis (CIA). Expression of GRPR in FLS was investigated by immunocytochemistry and western blot (WB). FLS treated with GRP and/or RC-3095 (GRP antagonist), and/or Ly294002 (inhibitor of PI3K/AKT pathway) were assessed for proliferation by sulforhodamine B assay over a three-day period, and for invasion using a Matrigel-coated transwell system over 24 hours. Akt phosphorylation was assessed by WB. Results: GRPR protein was detected in FLS by immunocytochemistry and WB. Exposure to GRP increased FLS invasion by nearly two-fold, compared with untreated cells (p<0.05), while RC-3095 reversed that effect (p<0.001). GRP also increased phosphorylated AKT expression in FLS. When Ly294002 was added with GRP, it prevented the GRP-induced increased cell invasiveness (p<0.001). Conclusion: GRPR was expressed on FLS and mediates the GRP-induced increased invasiveness. This effect occurs at least in part through the AKT activation. Further understanding of the GRP/GRPR pathway could be relevant in the development of FLS-targeted therapy for RA.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.