Orientador: Eduardo Maffud Cillli / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Vani Xavier de Oliveira Júnior / Resumo: Neste trabalho foi avaliado o efeito da dimerização e do comprimento/polaridade do espaçador utilizado na formação dos dímeros, na estrutura e atividade biológica do peptídeo antimicrobiano: Gly-Trp-Leu-Asp-Val-Ala-Lys-Lys-Ile-Gly-Lys-Ala-Ala-Phe-Asn-Val-Ala-Lys-Asn-Phe-Leu-CONH2. Nesse sentido, o monômero e três dímeros com diferentes espaçadores foram sintetizados pelo método de síntese de peptídeo em fase sólida (SPFS) utilizando uma combinação das químicas Fmoc e Boc. Análises por cromatografia de fase reversa e espectrometria de massas confirmaram o sucesso das sínteses e das purificações. Os ensaios de atividade antimicrobiana, em termos de CIM mostraram que a dimerização não aumentou a capacidade do peptídeo de inibir o crescimento de bactérias e fungos. No entanto, quando analisada a capacidade dos peptídeos de matar E. coli, um menor tempo para produzir o efeito inibitório foi observado para os dímeros. Adicionalmente, a atividade hemolítica dos peptídeos também foi avaliada, encontrando-se um aumento significativo, aproximadamente 40 vezes, para os dímeros em relação ao monômero. Com o objetivo de tentar explicar esses efeitos, o teste de proteção osmótica foi realizado. No entanto, o tamanho dos poros foi semelhante, o que não permite explicar as diferenças em termos desta variável. Conhecendo seus diâmetros, foi possível determinar que o poro é formado por 6 moléculas monoméricas ou 3 diméricas. Estudos de permeabilização mostraram que a porcentagem e a velocidade de liberação de carboxifluoresceína foram maiores para os dímeros quando comparados com o monômero, especialmente em vesículas contendo esfingomielina. Este ensaio também mostrou que a duplicação da concentração de monômeros não é suficiente para atingir a capacidade de permeabilização dos dímeros, confirmando que a proximidade das cadeias é um fator... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work analyzed the effect of dimerization and the length/polarity of the spacer used in the formation of dimers, in the structure and biological activity of the antimicrobial peptide: Gly-Trp-Leu-Asp-Val-Ala-Lys-Lys-Ile-Gly-Lys-Ala-Ala-Phe-Asn-Val-Ala-Lys-Asn-Phe-Leu-CONH2. In this way, the monomer and three dimers (Lys-branched) with different spacer groups were synthesized by solid phase peptide synthesis methodology using a combination of Fmoc and Boc chemical approaches. Analysis by reverse phase chromatography and mass spectrometry confirmed the success of the synthesis and purifications. The antimicrobial activity assay, in terms of MICs showed that dimerization did not increase the ability of the peptides to inhibit the growth of bacteria and fungi. Nevertheless, when analyzing the peptides activity against E. coli in terms of kinetics, an increased velocity was observed for the dimers. The hemolytic activity of peptides was also evaluated, finding a very significant difference, approximately 40 times greater for dimers. Aiming to explain this difference, the osmotic protection test was performed, but the pore size was similar, which can not explain the differences in terms of this variable. Knowing the diameter of the pores, it was possible to determine that the pore is formed by six monomeric or three dimeric molecules. Additionally, permeabilization studies showed that the percentage and rate of carboxyfluorescein release were larger for the dimers compared with monomer, especially in vesicles containing sphingomyelin. This test also showed that the use of two times more monomer concentration's is not sufficient to reach dimers permeabilization capacity, confirming that the proximity of the chains is an important factor in the activity of this peptide. Analysis by circular dichroism revealed that peptides in aqueous solution are in random coil, whereas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A hepcidina é uma proteína que faz parte do sistema imune inato e desempenha um papel fundamental na regulação da homeostase do ferro. Este peptídeo foi previamente caracterizado em várias espécies, entretanto, até agora, não em ovinos. O objetivo deste estudo foi de determinar a sequência do RNAm codificante da hepcidina, bem como caracterizar e realizar a análise da expressão gênica deste peptídeo em diferentes tecidos de ovinos saudáveis. A região codificante da hepcidina consiste em 249 pares de base, as quais codificam um peptídeo contendo 82 aminoácidos. Este precursor, da forma bioativa da hepcidina, apresenta maior homologia com as sequências de Bos taurus e Bubalus bubalis. A hepcidina foi expressa predominantemente no fígado dos ovinos, contudo foram observados altos níveis de expressão no abomaso e baixos níveis nos outros tecidos. Estes resultados ampliam o conhecimento comparativo deste peptídeo, mostrando a relação da hepcidina ovina com a de outras espécies de mamíferos e será útil para estudos futuros sobre o metabolismo de ferro e do processo inflamatório nos ovinos. / Abstract: Hepcidin is part of the innate immune system, and plays a central role in the regulation of iron homeostasis. This peptide has been previously characterized in several species but not in sheep until now. The aim of this study was to sequence, characterize and perform hepcidin gene expression analysis in different tissues of healthy sheep. The resulting ORF consisted of 249 bp predicted to encode an 82 amino acids peptide. The deduced precursor was mostly homologous to Bos taurus and Bubalus bubalis. Hepcidin was predominantly expressed in liver, although high expression was present in abomasum and lower level expression occurred in other tissues. These findings extend our comparative knowledge of this peptide, showing the relationship between sheep hepcidin and other mammalian hepcidins and might be helpful for additional studies on iron metabolism and inflammatory process in sheep. / Orientador: Alexandre Secorun Borges / Coorientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Juliana Regina Peiró / Mestre

Orientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Pedro Geraldo Pascutti / Banca: Luiz Carlos Gomide de Freitas / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Valmir Fadel / Resumo: Os Mastoparanos são peptídeos curtos e catiônicos extraídos do veneno de vespas. Estes peptídeos dependem de sua seqüência primária, composição, hidrofobicidade, ângulo polar, anfipaticidade e amidação do C-terminal para apresentar diferentes atividades biológicas. A conformação em hélice anfipática parece ser fundamental para interação destes peptídeos com a bicamada membranar. Neste trabalho buscamos as correlações destas características com as atividades antimicrobianas e hemolíticas apresentadas por três mastoparanos conhecidos, usando simulações por dinâmica molecular em misturas de TFE-água. Misturas de TFE-água apresentam um caráter hidrofóbico e hidrofílico assim como o ambiente membranar. Um dos peptídeos estudados é o Eumenine Mastoparano-AF (EMP-AF), no qual constatamos que a desamidação do C-terminal acarretou na desestruturação da conformação helicoidal e na perda da anfipaticidade nesta região, devido à atração eletrostática entre a carga negativa do grupo carboxila e os grupos catiônicos das cadeias laterais de alguns resíduos. Por esse fato a atividade hemolítica é perdida. Outro peptídeo investigado é o Paulista-MPI, para o qual propomos como estrutura estável uma hélice-.. anfipática. Para este caso, também exploramos as razões da existência de atividade antimicrobiana e ausência da atividade hemolítica. O outro peptídeo estudado foi o Anoplin com e sem o grupo amida do C-terminal. O Anoplin natural, Anoplin-NH2 é um peptídeo antimicrobiano. Novamente esta atividade pode ser associada com sua estrutura helicoidal anfipática que se apresenta estável por fatores como o equilíbrio eletrostático entre os grupos carregados das cadeias laterais; pela predominância dos grupos apolares das moléculas de TFE na região dos átomos eletronegativos da cadeia principal; e pela solvatação da cadeia lateral... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastoparans is a class of peptides extracted from wasp venom, named after their first recognized biological action, the degranulation of mast cells. They are short and cationic peptides that depending on their primary sequence, degree of charge and amidation of Cterminal present different biological activities. Fundamental for their interactions with biological membranes seems to be an amphipatic helix conformation. In this work we search for correlations among these characteristics and the antimicrobial and hemolytic activities of three known mastoparans, using molecular dynamics simulation in TFEwater mixtures. TFE-water media shows both hydrophobic and hydrophilic character and in this way mimics a membrane-like environment. The peptides studied are the Eumenine Mastoparan (EMP-AF), for which the desamidation of the C-terminal leads to the lost of the helix conformation and amphipaticity at this region, due to the electrostatic attraction among the negative charge of carboxylate group and the cationic groups of the lateral chain of some residues. Consequently the hemolytic activity is lost. Another peptide studied is Paulista-MPI, for which an amphipatic ..-helix is proposed as a stable structure. We rationalize also the reasons for its antimicrobial activities and the absence of hemolytic activity. The last peptide studied is Anoplin, the C-terminal amidated wild type and its carboxylated analog. The former type, Anoplin-NH2, is an antimicrobial and nonhemolytic peptide. Again this can be associated to the amphipatic helical structure, that we show is maintained by factors as the electrostatic equilibrium between charged groups, predominance of apolar groups of TFE molecules around the electronegative atoms of the main chain and solvation of lateral side chains. Deamidation of C-terminal, rendering Anoplin-OH, abolishes its antimicrobial activity due to the unfolding of the helix terminal... (Complete abstract, click electronic address below / Doutor

Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Younés Messaddeq / Coorientador: Ana Maria Minarelli Gaspar / Banca: Eduardo Hochuli Vieira / Banca: Orivaldo Lopes da Silva / Banca: Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia / Banca: José Mauro Granjeiro / Resumo: Esta tese apresenta a preparação e caracterização de novos materiais compósitos orgânico-inorgânicos baseados em celulose bacteriana (CB) produzida pela bactéria Gluconacetobacter xylinus, colágeno tipo I (COL), hidroxiapatita (HA) e peptídeos regulatórios de fatores de crescimento, "osteogenic growth peptide" OGP e "osteogenic growth peptide [10-14]" OGP [10-14] para aplicação em regeneração óssea. Estudos in vitro e in vivo foram realizados para avaliar o potencial osteocondutor, osteoindutor e a bioatividade destes compósitos. Os peptídeos foram sintetizados pelo método da fase sólida (estratégia Fmoc; SPFS-Fmoc); foram purificados e caracterizados por HPLC, espectrometria de massas e análise de aminoácidos. Os compósitos foram preparados nas seguintes composições, CBCOL, CB-HA, (CB-COL)-HA e (CB-HA)-COL. Os compósitos CB-COL foram preparados inicialmente pela funcionalização da CB pura hidratada pela esterificação do aminoácido glicina empregando a metodologia SPFS-Fmoc, e em seguida realizou-se a incorporação do colágeno empregando 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC). Nos compósitos CB-HA, a precipitação da HA foi realizada em CB pura hidratada seguindo ciclos alternados de imersão em soluções de cloreto de cálcio e fosfato de sódio, respectivamente. Adicionalmente, para preparação dos compósitos (CB-COL)-HA, o compósito CB-COL foi empregado como matriz para precipitação da HA, cuja precipitação foi similar ao compósito CBHA. Para preparação dos compósitos (CB-HA)-COL, foram utilizadas matrizes de CB-HA para incorporação do colágeno empregando EDC. As caracterizações realizadas neste trabalho confirmaram a incorporação do COL às matrizes de CB e CB-HA por análises de espectroscopia (FT-IR e Raman) e a difração de raios-X (DRX)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This thesis presents the preparation and characterization of new organic-inorganic composite materials based on bacterial cellulose (BC) synthesized by bacteria Gluconacetobacter xylinus, type I collagen (COL), hydroxyapatite (HA) and regulatory peptides of growth factors, osteogenic growth peptide (OGP) and osteogenic growth peptide [10-14] (OGP[10-14]) for application in bone regeneration. In vitro and in vivo studies were performed to evaluate the properties osteoconductive and osteoinductive, and bioactivity these composites. The peptides were synthesized through solid phase methodology (SPS - Fmoc strategy) and purified and characterized by HPLC, mass spectrometry and amino acid assay. The composites were prepared such as, BC-COL, BC-HA, (BC-COL), HA and (BC-HA)- COL. Hydrated BC was modified initially by esterification of glycine amino acid through SPS - Fmoc strategy followed by cross-linking of type I collagen employing 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) for preparation of BC-COL composite. In the BC-HA composite, the biomimetic precipitation technique was performed for precipitation of HA on hydrated BC; BC membranes were sequentially incubated in solutions of CaCl2 followed by Na2HPO4, respectively. Additionally, the preparation of (BC-COL)-HA composites, the BC-COL composite was used as template for precipitation of HA crystals, following the biomimetic precipitation technique employed to BC-HA composite; and the preparation of (BC-HA)-COL, the BC-HA composite was used as template for collagen incorporation employing EDC. Characterizations performed in this study confirmed collagen incorporation to BC and BC-HA matrices by spectroscopy analysis (FT-IR and Raman) and that by X-ray diffraction (XRD) showed changes in the pattern BC crystallinity after collagen incorporation. In the composites containing HA, analysis of scanning... (Complete abstract click electronic access bel / Doutor

Orientador: Aline Thaís Bruni / Banca: Alexandre Pereira Chadad / Banca: Elso Drigo Filho / Resumo: Neste trabalho foi utilizada a Metodologia de Análise conformacional Sistemática por Pares (MASP)[1] para estudar o peptídeo IAN e fragmentos menores. Nesta metodologia, a análise conformacional é feita de maneira sistemática analisando as combinações de pares de ângulos diedros que compõem o peptídeo avaliado. As energias referentes a cada conformacão foram obtidas por meio do método mecânico-quântico semi-empírico AM1. As regiãoes de menor energia nas Superfícies de Energia Potencial (PES - Potential Energy Surface) foram obtidas com auxílio de quimiometria, por meio da Análise de Componentes Principais (PCA - Principal Component Analysis). Um dos objetivos do trabalho é determinar um limite do número de graus de liberdade (diedros) sob o qual a aproximação por pares do MASP pode ser feita. Para o peptídeo IAN, com 11 diedros consecutivos, foi possível reproduzir grande parte da PES[2]. Foram estudadas 117 ções diferentes do peptídeo IAN e seus fragmentos, cujos tamanhos variaram de 4 a 11 e casos adicionais com 13 diedros. Os resultados deste trabalho mostraram que o valor do mínimo de energia diminui com o aumento do tamanho da molécula estudada. Para fragmentos com 4 diedros, o MASP reproduz toda a PES quando comparada com a Análise Conformacional Sistemática Completa. Quando o MASP é aplicado aumentando o tamanho da cadeia, em alguns casos as energias das conformações de partida otimizadas eram menores que as energias das conformações finais. Estes resultados sugerem que o MASP é factíıvel com um limite superior de seis ângulos de diedro. / Abstract: In this work the Systematic Conformational Analysis by Pairs Method (MASP)[1] was used to study the IAN peptide and its fragments. In this method, the conformational analysis is carried out in a systematic procedure analyzing combinations of dihedral angles pairs of the investigated peptide. Energies associated with each conformation were obtained through semi-empirical quantum-mechanic method AM1. Low energy regions of the Potential Energy Surface (PES) were obtained with help of chemometrics, using Principal Component Analysis (PCA). One of the goals of this work is to determine the upper limit of number of degrees of freedom (dihedral angles) under which the MASP can be successfully applied. For the peptide IAN, with 11 dihedral angles, it was possible to obtain a considerable fraction of its PES [2]. 117 conformations of the IAN peptide and its fragments were studied, with sizes varying from 4 to 11 dihedrals, and additional cases with 13 dihedrals. The results show that the energy minimum decreases with the studied molecule size. For fragments with 4 dihedrals, MASP recover all PES when compared with a full systematic conformational analysis. Applying MASP with increasing size of the system, in some cases, it was observed that the energies for the optimized starting conformations were lower than the energies obtained for the final conformations. The results suggest that MASP is reliable with upper limit of six dihedral angles. / Mestre

Orientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Luiz Carlos Gomide Freitas / Resumo: Moléculas de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) em solução aquosa podem formar aglomerados micelares em condições adequadas de concentrações, pH, temperatura e força iônica, devido às características polar/apolar de suas cabeças/caudas. Essas micelas, aniônicas, mimetizam o ambiente da membrana de células procariontes e são usados como modelo no estudo da interação de peptídeos antimicrobianos com membranas das bactérias. Neste trabalho usamos simulações por dinâmica molecular de equilíbrio para estudar a interação do peptídeo Polybia MP-I com micela de SDS em solução aquosa, considerando tanto a situação em que a micela está pré-formada como a de automontagem da micela na presença do peptídeo. Mostramos que em ambos os casos o peptídeo se insere na micela de forma aproximadamente paralela à membrana, com a cadeia principal enterrada na região de interface entre as caudas e as cabeças polares das moléculas de SDS e os grupos carregados localizados na interface das cabeças polares com a solução. Estes dados confirmam modelos de inserção de peptídeos antimicrobianos em membranas existentes na literatura. Discutimos também a estabilidade da estrutura helicoidal anfipática do peptídeo em função da solvatação de sua cadeia principal, que proporciona a manutenção de uma rede de ligações de hidrogênio do tipo NH --- O entre resíduos do tipo n-(n+4) da cadeia principal, típicos de estruturas em α - hélice. Além disso, os resultados indicam que pontes salinas formadas entre os grupos negativos dos resíduos do ácido aspártico (Asp) 2 e 8 com resíduos de lisinas 5 e 11 são importantes para a manutenção da estrutura do peptídeo. Os resultados indicam também que a estrutura micelar mantém-se aproximadamente esférica com ou sem o peptídeo independente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) molecules can form micellar agregates in aqueous solution under appropriate concentration, pH, temperature and ionic strength conditions due to the polar/apolar features of its head and tail. The anionic micelles formed mimic the environment of the prokaryotic cells membrane of bacteria. In this work we use equilibrium molecular dynamics simulation to study the interaction of the peptide Polybia MP-I with SDS micelles in aqueous solution considering both a preformed micelle and a micelle obtained by self-assembling the SDS molecules in the presence of the peptide. We show that in both cases the peptide inserts in an almost parallel way relative to the micelle surface, with the main chain buried in the interface region between the tails and polar heads of SDS molecules and the charged groups of the peptide located at the interface with the polar heads the solution. These data support models of insertion of antimicrobial peptides in membranes in the literature. We also discuss the stability of the amphipathic helical structure of the peptide as a function of salvation of the main chain, which contributes to the maintenance of the network of hydrogen bonds in the main chain of type NH --- O between residues n and n+4 that are typical of structures in α-helix. Furthermore, the results indicate that salt bridges formed between the negative groups of aspartic acid residues (Asp) 2 and 8 with lysine residues 5 and 11 are importance in maintaining the structure of the peptide. The results also indicate that the micellar structure remains approximately spherical with and without the peptide, independent of the process as it is obtained, whether preformed or self-assembled. The micellar radius increases to accommodate the peptide and in the case of self-assembled micelle... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Neste trabalho estudou-se a estrutura, função e mecanismo de ação do peptídeo antibacteriano Protonectarina-MP (isolado de veneno da vespa social Protonectarina sylveirae) tendo seu resíduo C-terminal nas formas ácida (-OH) e amidada (-NH2). Os peptídeos foram sintetizados, utilizando-se a estratégia Fmoc, purificados por cromatografia líquida de alta performance. O monitoramento do material sintético foi feito por espectrometria de massas ESI-MS e por seqüenciamento através de Química Degradativa de Edman. A estrutura secundária foi investigada pelo uso de espectroscopia de dicroísmo circular e modelagem molecular. Atividade lítica (extravasamento) e interação do resíduo de triptofano em vesículas foram investigadas pelo uso de espectrômetro de fluorescência. Foram realizados ensaios sobre as interações desses peptídeos em meio de vesículas zwitteriônicas e aniônica, formando complexos proteolipossomos que foram submetidos à troca isotópica H/D monitorada por espectrometria de massas ESI-MS e MS/MS. Além disso, foram realizados ensaios biológicos de atividade hemolítica, de desgranulação de mastócito, de liberação da enzima citoplasmática Lactato Desidrogenase e de atividade antimicrobianas. Os dados de CD revelam uma tendência dos peptídeos se estruturarem em hélice-α em ambiente hidrofóbico e em ambiente de membranas. Porém, o mesmo não pode ser observado em meio aquoso. Os modelos obtidos para ambos os peptídeos por modelagem molecular mostram uma estruturação em hélice-α anfipática. Nos ensaios de atividade lítica em vesículas, os peptídeos apresentaram um processo com cooperatividade positiva, com curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Os resultados da fluorescência do triptofanos mostram um deslocamento da emissão para a região de onda do azul para o peptídeo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the present work was studied the structure, function and mechanism of action of the antibacterial peptide Protonectarina-MP (isolated from venom of social wasp Protonectarina sylveirae) with its carboxyamidation (-NH2) and carboxyl-free (-OH) Cterminal forms. The peptides were manually synthesized on-solid phase by using Fmoc strategy and purified under HPLC. The homogeneity of the synthetic material was analyzed by ESI mass spectrometry and Edman Degradation Chemistry. The secondary structure was investigated through circular dichroism (CD) spectroscopy and molecular modeling. Lytic activity and peptides interaction with the membranes was also investigated through tryptophan emission, by fluorescence spectrometry. The interaction of peptides with zwitterionic and anionic vesicles was investigated through the combination of H/D exchange and ESI-mass spectrometry. Some biological activities, like: mast cell degranulation, release of cytoplasmic enzyme lactate dehydrogenase, hemolysis and antibiosis were investigated for both peptides. The CD spectra revealed that the peptides in hydrophobic environments or in presence of biological membranes have the tendency to form helix conformations; however, organized structures were not observed in aqueous or buffer solutions. The models obtained by molecular modeling show that both peptides form an amphipathic α-helix. The peptides presented a positive cooperative process in the lytic activity of vesicles, with dose-response curves presenting a sigmoidal dependence with the peptide concentration. The results of the fluorescence of tryptophans showed a shift of the emission wavelength to the blue region of the peptide Protonectarina-MP (-NH2), which was not observed for its analogue presenting the C-terminal residue in free acid form. This is indicating a greater interaction of the amidated peptide in membranes, when compared to the peptide... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: João Ruggiero Neto / Banca: Ivo Lebrun / Banca: Pietro Ciancaglini / Mestre

Resumo: Angiotensina II, um peptídeo hipertensivo, e bradicinina, um peptídeo hipotensivo, são fatores humorais cruciais para a regulação da pressão sanguínea. A enzima chave desse sistema é a enzima conversora de angiotensina que produz angiotensina II a partir de angiotensina I e degrada bradicinina. A descoberta dos primeiros inibidores naturais dessa enzima, os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), tornou possível o desenvolvimento dos primeiros medicamentos utilizados no controle da pressão arterial humana. Caracteristicamente, os BPPs contêm de 5 a 13 resíduos de aminoácidos apresentando um resíduo de piroglutâmico no N-terminal e um resíduo de prolina no Cterminal. O precursor de BPPs encontrado na glândula de veneno de Bothrops jararaca contém 256 resíduos de aminoácidos e codifica para sete BPPs alinhados em tandem seguidos pelo peptídeo natriurético tipo-C. Até o momento, não se conhecem os mecanismos envolvidos para a liberação desses peptídeos da proteína precursora. Dessa forma, a resolução da estrutura dessa proteína pode contribuir para a elucidação do mecanismo evolvido no processamento do precursor para a liberação dos BPPs. Duas construções da proteína precursora de BPPs (domínio BPP e domínios BPP+CNP) da glândula de veneno de B. jararaca foram expressas, purificadas e suas identidades confirmadas por experimentos de western blotting. A pureza das amostras foi avaliada por SDS-PAGE e a presença de enovelamento após expressão heteróloga foi observada por experimentos de dicroísmo circular e fluorescência. Os ensaios de cristalização não foram promissores. Isso pode ser explicado pela baixa concentração da proteína usada no experimento. Assim, devido ao baixo nível de expressão de ambas as proteínas, métodos para maximização da expressão foram empregados resultando em significante...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Angiotensin II, a hypertensive peptide, and bradykinin, a hipotensive peptide, are crucial humoral factors for the regulation of blood pressure. The key enzyme for this system is the angiotensin-converting enzyme that produces angiotensin II from angiotensin I and degrades bradykinin. The discovery of the first natural inhibitors for this enzyme, the bradykinin potentiating peptides (BPPs), made it possible to develop the early drugs aimed at controlling unbalanced cardiovascular functions. Characteristically, BPPs contain 5 to 13 amino acid residues that have a pyroglutamyl residue at the N-terminus and a praline residue at the C-terminus. The BPP precursor protein contains 256 amino acid residues coding for seven BPPs aligned in tandem followed by the C-type natriuretic peptide. At present, there are no suggested mechanisms for understanding the release of BPPs from the precursor protein. Two constructs of the BPP precursor protein (BPP domain and BPP+CNP domains) from the venom gland of Bothrops jararaca were over-expressed, purified and the identity of both recombinant proteins confirmed by western blotting experiments. The purity of the samples was assessed by SDS-PAGE and the protein fold after expression was observed by circular dichroism and fluorescence experiments. Crystallization assays were not successful, probably due to the low protein concentration used for the experiment. Considering the low expression level observed for both recombinant proteins, the experimental methods were optimized to maximize the yield and resulted in high protein amounts in inclusion bodies. Methods were applied aiming at the solubilization of the proteins from the insoluble fraction and protein purification under denaturing conditions was carried out yielding high amounts of pure protein. Until this moment, none of the procedures were successful in producing refolded proteins. Work ...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Coorientador: Mirian Akemi Furue Hayashi / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Patrick Jack Spencer / Mestre