As células-satélite musculares vêm sendo muito estudadas em diferentes pesquisas, especialmente com o objetivo de aumentar a compreensão do mecanismo de sua ação na regeneração muscular e as respectivas implicações nas diferentes miopatias, visando identificar possíveis alvos terapêuticos. Dois modelos para distrofias, os camundongos Largemy d e Lama2dy2j/J possuem um padrão de degeneração intenso e bastante semelhante, mas com diferenças na expressão de genes envolvidos na cascata de regeneração. Por isso, estes constituem interessantes modelos para o estudo de possíveis diferenças no mecanismo de ativação e atuação das células-satélite no músculo distrófico. Assim, os objetivos específicos deste projeto consistiram em: 1) isolar e caracterizar por citometria de fluxo as populações de células-satélite dos modelos Largemy d e Lama2dy2j/J em comparação com o normal C57Black6, quanto a expressão de marcadores de miogênese e de células-tronco pluripotentes; e 2) estudar e comparar o perfil de expressão gênica destas populações de células satélites através de microarray de expressão. Na caracterização fenotípica das células isoladas do músculo normal, aquelas que aderem mais precocemente (PP1) e mais tardiamente (PP2) mostram um padrão fenotípico semelhante entre si e com características mais próximas às miogênicas. Já a população de células de adesão bem mais tardia (PP6) apresentou um padrão de marcação misto, mantendo as características miogênicas, mas apresentando tambem padrão de células-tronco mesenquimais, sugerindo o fenótipo de células mais imaturas. Nos músculos distróficos, identificamos diferenças na constituição do pool de células presentes inicialmente no músculo, onde na linhagem Lama2dy2j/J há indícios de uma população em estágio proliferativo, enquanto que na linhagem Largemy d há presença de células com maior imaturidade. Os resultados da analise de expressão gênica nas populações caracterizadas se mostraram concordantes com os fenótipos celulares avaliados por citometria. Identificamos a hipo-expressão de genes ligados à regeneração e remodelamento muscular em ambos modelos distróficos. Considerando os genes diferentemente expressos somente em cada um dos modelos, os resultados sugerem ativação de proliferação celular e inibição da diferenciação na linhagem Lama2dy2j/J e distúrbios na miogênese na linhagem Largemy d. Assim, pudemos identificar vias importantes alteradas em cada um dos modelos que explicam parte das diferenças encontradas nos trabalhos anteriores / Muscle satellite cells have been widely studied, especially to understand their mechanism of action in muscle regeneration and correspondent implications in the different dystrophic processes, aiming the identification of potential therapeutic targets. Two mice models for muscular dystrophies, Largemyd and Lama2dy2j/J, have a pattern of an intense and very similar degeneration, but with differences in the expression of genes involved in the regeneration cascade. Therefore, they are interesting models to study possible differences in the mechanism of activation and action of satellite cells in the dystrophic muscle. The main objectives of this project are: 1) to isolate and characterize by flow cytometry, populations of satellite cells from Largemyd and Lama2dy2j/J models, as compared to normal C57Black6, evaluating the presence of myogenic and pluripotent stem cells markers; and 2) to study and compare gene expression profiles of these populations of satellite cells using microarray technique. In the phenotypic characterization of cells harvested from normal muscle, both faster (PP1) and slower (PP2) populations to adhere in culture flasks show similar phenotypic characteristics, which were closer to myogenic phenotype. On the other hand, the population of cells with very delayed adhesion ability (PP6) presented a mixed pattern, maintaining the myogenic characteristics, but associated to positive mesenchymal stem cell´s markers, suggesting a phenotype of more immature cells. In dystrophic muscles, we could identify differences in the constitution of the first pool of cells present in the Lama2dy2j/J muscle where there is evidence of a population in proliferative stage, while in the Largemyd strain, we found more immature cells. Gene expression profile in the characterized populations showed consistent concordance with the cellular phenotypes assessed by flow citometry. In both dystrophic models, we identified down-regulated genes related to regeneration and remodeling of the muscle. Considering only the genes differently expressed in each dystrophic model, data suggest the activation of cell proliferation and inhibition of differentiation pathways in Lama2dy2j/J strain and altered myogenesis in the Largemyd model. Thus, we identified important altered pathways in each of the dystrophic models that could explain most of the differences in gene expression profile in the muscle, described in our previous work

Com a utilização dos atuais protocolos de tratamento, 70-80% dos casos de leucemia linfóide aguda (LLA) na infância têm obtido sobrevida livre de eventos em cinco anos. Entretanto, os 20% restantes, que se mostram resistentes ao tratamento, apresentam recidivas e as causas desse insucesso no tratamento ainda permanecem desconhecidas. Dessa forma, com o intuito de melhor compreender os mecanismos moleculares que participam desse processo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil de expressão de um painel de genes que foram previamente associados à resistência e/ou sensibilidade aos quimioterápicos: prednisona (F8A, CDK2AP1, BLVRB, CD69), vincristina (RPLP2, CD44, TCFL5, KCNN1, TRIM24), daunorrubicina (MAP3K12, SHOC2, PDCH9, EGR1, KCNN4) e asparaginase (GPR56, MAN1A1, CLEC11A, IGFBP7, GATA3). Para a realização do estudo, foram utilizadas inicialmente amostras de medula óssea de pacientes portadores de LLA pertencentes a quatro grandes centros de oncologia pediátrica do Estado de São Paulo e que foram submetidos ao protocolo de tratamento do GBTLI-99. A análise da expressão gênica foi realizada pela técnica de PCR quantitativa em tempo real, utilizando-se o reagente SYBR Green, o gene GUS? como controle endógeno e amostras de medula óssea normais como referência. A análise dos dados de expressão gênica em relação aos diversos parâmetros clínicos e laboratoriais avaliados na LLA, demonstrou associações importantes entre os diversos genes estudados e variáveis clínicas importantes como contagem de glóbulos brancos ao diagnóstico, presença do antígeno CD10 (CALLA), translocação TEL/AML1, presença de doença residual mínima entre outras. Dentre os genes avaliados destacaram -se como possíveis marcadores de bom prognóstico os genes SHOC2 e GPR56. Posteriormente, reavaliou-se o perfil de expressão desses genes em pacientes submetidos ao protocolo de tratamento europeu do grupo BFM com o intuito de verificar o padrão de expressão em pacientes com um background genético distinto e submetidos a um protocolo terapêutico distinto. Os resultados confirmaram os dados encontrados anteriormente e demonstraram a hiperexpressão do gene SHOC2 (que foi previamente associado à sensibilidade à daunorrubicina) associada ao grupo de pacientes bons respondedores, sugerindo a correlação desse gene com critérios favoráveis de prognóstico. Para verificar o nível de interação desse gene avaliou-se ainda a expressão protéica do mesmo, que confirmou os padrões de expressão gênica obtidos por RQ-PCR. A função do gene SHOC2, que embora não esteja completamente elucidada, já foi anteriormente descrita pela literatura, que demonstra a participação do gene no processo de ativação da proteína Erk pela via Ras. Finalmente para melhor compreender os possíveis mecanismos que envolvem o gene SHOC2 no processo de melhor resposta à quimioterapia, utilizou-se a técnica de RNAi para silenciá- lo na linhagem celular leucêmica Jurkat. Os resultados demosntraram a associação da expressão do gene SHOC2 com proliferação celular e também com a indução de apoptose. Esses dados sugerem que a hiperexpressão desse gene pode ser importante para o processo de sensibilidade das células leucêmicas ao tratamento. Como conclusão, este trabalho demonstrou a associação de diversos genes com importantes parâmetros clínicos da LLA e destaca principalmente o papel do gene SHOC2 como possível alvo terapêutico para o tratamento da leucemia linfóide aguda. / Major improvements have been made in the ALL treatment, which achieved successful rates of approximately 80% of long-terms survival. Despite the significant percentage of success, the remaining 20 % still presents treatment failure and the molecular mechanisms involved in the resistance process remains unclear. The present study was undertaken to analyze and validate the gene expression pattern of the previously described genes related to prednisolone (F8A, CDK2AP1, BLVRB, CD69), vincristine (RPLP2, CD44, TCFL5, KCNN1, TRIM24), daunorubicin (MAP3K12, SHOC2, PDCH9, EGR1, KCNN4) and Lasparaginase (GPR56, MAN1A1, CLEC11A, IGFBP7, GATA3) in order to better inderstand these mechanisms. Bone marrow samples of ALL patients, obtained at diagnosis, in four oncology centers and treated according to the Brazilian protocol (GBTLI-99). The relative mRNA expression levels were quantified using real-time PCR analysis. Amplification of the specific sequences was performed with SYBR® Green reagent; GUSB was used as the reference gene and normal bone marrow samples used as calibrator. The expression profile analisis showed important associations among the studied genes and clinical features as WBC count at diagnosis, CALLA, TEL/AML1 translocation and minimal residual disease. Among the analyzed genes, possible therapy targets were found at SHOC2 and GPR56. Further we addressed the expression profile of these genes in ALL patients, treated according to the BFM protocol, which chacarterize a group of distinct genetic\'s background. The results confirmed the data previously obtained. The overexpression of the gene SHOC2, that was primaraly associated to sensibility to dauborubicin, was related to patients who presented good prednisone response, suggesting the correlation of SHOC2 with good prognostic factors. In order to acess the interaction level of this gene, the protein expression was analyzed and confirmed the mRNA expression data. Despite its lack of information, the data on SHOC2 shows its role as na important element in the Erk activation by Ras induced pathway. Finally, to better understand the possible mechanisms which involve SHOC2 gene to the chemotherapy response process, Jurkat cells was transfect with siRNA to silence the gene SHOC2. Further, functional assays were done to characterize the mechanisms involved. The results showed the association of SHOC2 gene expression with processes of cell proliferation and apoptosis induction, thus suggesting that the overexpression of SHOC2 could play an important role in leukemic cell\'s sensibility to chemotherapy agents, and consequently in patients\' treatment outcome. In conclusion, this work demonstrated the association of the expression profile of many genes with important clinical and laboratorial features. Furthermore, this data present the gene SHOC2 as a possible therapy target to acute lymphoblastic leukemia \'s treatment.

Questiona-se um possível papel deletério da endometriose sobre a qualidade oocitária (QO), que é, em grande parte, condicionada pelo papel das células do cumulus. A função dessas células envolve a expressão de diversas moléculas codificadas por genes específicos, regulada a nível de transcrição, pós-transcrição e tradução. Os microRNAs atuam como reguladores póstranscricionais da expressão gênica, de modo que qualquer alteração nesse mecanismo pode levar a anormalidades no desenvolvimento oocitário. Desta forma, propusemos um estudo inédito da análise de microRNAs em células do cumulus (CC) de mulheres inférteis com e sem endometriose com o objetivo de evidenciar processos biológicos e vias de atuação correlacionados com o papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto na aquisição da competência oocitária. Foram incluídas no estudo 15 pacientes inférteis (5 controles com fator tubário e/ou masculino, 5 com endometriose estágios I/II e 5 com endometriose estágios III/IV) submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI). Imediatamente após a captação oocitária, as CCs foram isoladas e armazenadas para extração dos miRNAs. O perfil de 754 miRNAs foi analisado por meio da técnica de TaqMan®Array Human MicroRNA Cards. Considerou-se significativo p<0,05. Os miRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose I/II comparadas às controles. Os miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsamiR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV em relação às controles. Ao comparar-se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV entre si, os miRNAs hsa-miR-187-3p e hsa-miR-532- 3p foram menos expressos e os miRNAs hsa-let-7f-1# e hsa-miR-362-3p mais expressos nas pacientes com endometriose III/IV. A análise de enriquecimento identificou os genes regulados pelos miRNAs e as respectivas vias metabólicas em que estão envolvidos, sugerindo aumento de apoptose, diminuição de proliferação celular, alterações no controle do ciclo celular e no metabolismo energético das CCs de mulheres com a doença inicial e avançada. Os dados apontam para alterações na regulação pós-transcricional em CCs de mulheres inférteis com endometriose inicial e avançada, o que pode afetar processos e vias essenciais à aquisição de competência oocitária e estar envolvido na infertilidade associada à doença. Este estudo contribui para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose identificando mecanismos pós-transcricionais relacionados à piora da qualidade gamética nestas mulheres. / It is questioned a possible deleterious role of endometriosis on oocyte quality (OQ), which is largely conditioned by the function of cumulus cells. The role of these cells involve the expression of several molecules encoded by specific genes, regulated at transcription level, post-transcription and translation. The microRNAs act as transcriptional regulators of gene expression, thus any alteration in this mechanism can lead to abnormalities in oocyte development. In this way, we proposed an unpublished study of the microRNAs analysis in cumulus cells (CC) of infertile women with and without endometriosis, aiming to evidence the biological processes and pathways of action correlated with the presence of endometriosis in infertility and its possible impact on the acquisition of oocyte competence. Fifteen infertile patients (5 controls with tubal factor and/or male, 5 with stage I/II of endometriosis and 5 with stages III/IV of endometriosis) submitted to the controlled ovarian stimulation (EOC) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were included in the study. Immediately after oocyte uptake, CCs were isolated and stored for miRNA extraction. The 754 miRNAs profile was analyzed using the TaqMan®Array Human MicroRNA Cards technique. Significant values were considered when p <0.05. The hsa-miR-218, hsa-miR-301 and hsa-miR-629-5p miRNAs were identified as less expressed in the patients with endometriosis I/II compared to controls. The miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p and hsa-miR- 629-5p were identified as less expressed in patients with endometriosis III/IV compared to controls. Comparing the groups with endometriosis I/II and endometriosis III/IV, hsa-miR-187- 3p and hsa-miR-532-3p miRNAs were less expressed and hsa-let-7f-1# and hsa-miR-362-3p more expressed in patients with endometriosis III/IV. The enrichment analysis identified the genes regulated by the miRNAs and the respective metabolic pathways in which they are involved, suggesting apoptosis increase, decreased cell proliferation, alterations in the cell cycle control and energetic metabolism of the CCs of women with initial and advanced disease. The data point to changes in post-transcriptional regulation in CCs of infertile women with early and advanced endometriosis, which may affect processes and pathways essential for acquiring oocyte competence and resulting in infertility associated with the disease. This study contributes to the understanding of the etiopathogenesis of infertility related to endometriosis by identifying post-transcriptional mechanisms related to the deterioration of quality of gametes in these women.

As células-satélite musculares vêm sendo muito estudadas em diferentes pesquisas, especialmente com o objetivo de aumentar a compreensão do mecanismo de sua ação na regeneração muscular e as respectivas implicações nas diferentes miopatias, visando identificar possíveis alvos terapêuticos. Dois modelos para distrofias, os camundongos Largemy d e Lama2dy2j/J possuem um padrão de degeneração intenso e bastante semelhante, mas com diferenças na expressão de genes envolvidos na cascata de regeneração. Por isso, estes constituem interessantes modelos para o estudo de possíveis diferenças no mecanismo de ativação e atuação das células-satélite no músculo distrófico. Assim, os objetivos específicos deste projeto consistiram em: 1) isolar e caracterizar por citometria de fluxo as populações de células-satélite dos modelos Largemy d e Lama2dy2j/J em comparação com o normal C57Black6, quanto a expressão de marcadores de miogênese e de células-tronco pluripotentes; e 2) estudar e comparar o perfil de expressão gênica destas populações de células satélites através de microarray de expressão. Na caracterização fenotípica das células isoladas do músculo normal, aquelas que aderem mais precocemente (PP1) e mais tardiamente (PP2) mostram um padrão fenotípico semelhante entre si e com características mais próximas às miogênicas. Já a população de células de adesão bem mais tardia (PP6) apresentou um padrão de marcação misto, mantendo as características miogênicas, mas apresentando tambem padrão de células-tronco mesenquimais, sugerindo o fenótipo de células mais imaturas. Nos músculos distróficos, identificamos diferenças na constituição do pool de células presentes inicialmente no músculo, onde na linhagem Lama2dy2j/J há indícios de uma população em estágio proliferativo, enquanto que na linhagem Largemy d há presença de células com maior imaturidade. Os resultados da analise de expressão gênica nas populações caracterizadas se mostraram concordantes com os fenótipos celulares avaliados por citometria. Identificamos a hipo-expressão de genes ligados à regeneração e remodelamento muscular em ambos modelos distróficos. Considerando os genes diferentemente expressos somente em cada um dos modelos, os resultados sugerem ativação de proliferação celular e inibição da diferenciação na linhagem Lama2dy2j/J e distúrbios na miogênese na linhagem Largemy d. Assim, pudemos identificar vias importantes alteradas em cada um dos modelos que explicam parte das diferenças encontradas nos trabalhos anteriores / Muscle satellite cells have been widely studied, especially to understand their mechanism of action in muscle regeneration and correspondent implications in the different dystrophic processes, aiming the identification of potential therapeutic targets. Two mice models for muscular dystrophies, Largemyd and Lama2dy2j/J, have a pattern of an intense and very similar degeneration, but with differences in the expression of genes involved in the regeneration cascade. Therefore, they are interesting models to study possible differences in the mechanism of activation and action of satellite cells in the dystrophic muscle. The main objectives of this project are: 1) to isolate and characterize by flow cytometry, populations of satellite cells from Largemyd and Lama2dy2j/J models, as compared to normal C57Black6, evaluating the presence of myogenic and pluripotent stem cells markers; and 2) to study and compare gene expression profiles of these populations of satellite cells using microarray technique. In the phenotypic characterization of cells harvested from normal muscle, both faster (PP1) and slower (PP2) populations to adhere in culture flasks show similar phenotypic characteristics, which were closer to myogenic phenotype. On the other hand, the population of cells with very delayed adhesion ability (PP6) presented a mixed pattern, maintaining the myogenic characteristics, but associated to positive mesenchymal stem cell´s markers, suggesting a phenotype of more immature cells. In dystrophic muscles, we could identify differences in the constitution of the first pool of cells present in the Lama2dy2j/J muscle where there is evidence of a population in proliferative stage, while in the Largemyd strain, we found more immature cells. Gene expression profile in the characterized populations showed consistent concordance with the cellular phenotypes assessed by flow citometry. In both dystrophic models, we identified down-regulated genes related to regeneration and remodeling of the muscle. Considering only the genes differently expressed in each dystrophic model, data suggest the activation of cell proliferation and inhibition of differentiation pathways in Lama2dy2j/J strain and altered myogenesis in the Largemyd model. Thus, we identified important altered pathways in each of the dystrophic models that could explain most of the differences in gene expression profile in the muscle, described in our previous work

Com a utilização dos atuais protocolos de tratamento, 70-80% dos casos de leucemia linfóide aguda (LLA) na infância têm obtido sobrevida livre de eventos em cinco anos. Entretanto, os 20% restantes, que se mostram resistentes ao tratamento, apresentam recidivas e as causas desse insucesso no tratamento ainda permanecem desconhecidas. Dessa forma, com o intuito de melhor compreender os mecanismos moleculares que participam desse processo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil de expressão de um painel de genes que foram previamente associados à resistência e/ou sensibilidade aos quimioterápicos: prednisona (F8A, CDK2AP1, BLVRB, CD69), vincristina (RPLP2, CD44, TCFL5, KCNN1, TRIM24), daunorrubicina (MAP3K12, SHOC2, PDCH9, EGR1, KCNN4) e asparaginase (GPR56, MAN1A1, CLEC11A, IGFBP7, GATA3). Para a realização do estudo, foram utilizadas inicialmente amostras de medula óssea de pacientes portadores de LLA pertencentes a quatro grandes centros de oncologia pediátrica do Estado de São Paulo e que foram submetidos ao protocolo de tratamento do GBTLI-99. A análise da expressão gênica foi realizada pela técnica de PCR quantitativa em tempo real, utilizando-se o reagente SYBR Green, o gene GUS? como controle endógeno e amostras de medula óssea normais como referência. A análise dos dados de expressão gênica em relação aos diversos parâmetros clínicos e laboratoriais avaliados na LLA, demonstrou associações importantes entre os diversos genes estudados e variáveis clínicas importantes como contagem de glóbulos brancos ao diagnóstico, presença do antígeno CD10 (CALLA), translocação TEL/AML1, presença de doença residual mínima entre outras. Dentre os genes avaliados destacaram -se como possíveis marcadores de bom prognóstico os genes SHOC2 e GPR56. Posteriormente, reavaliou-se o perfil de expressão desses genes em pacientes submetidos ao protocolo de tratamento europeu do grupo BFM com o intuito de verificar o padrão de expressão em pacientes com um background genético distinto e submetidos a um protocolo terapêutico distinto. Os resultados confirmaram os dados encontrados anteriormente e demonstraram a hiperexpressão do gene SHOC2 (que foi previamente associado à sensibilidade à daunorrubicina) associada ao grupo de pacientes bons respondedores, sugerindo a correlação desse gene com critérios favoráveis de prognóstico. Para verificar o nível de interação desse gene avaliou-se ainda a expressão protéica do mesmo, que confirmou os padrões de expressão gênica obtidos por RQ-PCR. A função do gene SHOC2, que embora não esteja completamente elucidada, já foi anteriormente descrita pela literatura, que demonstra a participação do gene no processo de ativação da proteína Erk pela via Ras. Finalmente para melhor compreender os possíveis mecanismos que envolvem o gene SHOC2 no processo de melhor resposta à quimioterapia, utilizou-se a técnica de RNAi para silenciá- lo na linhagem celular leucêmica Jurkat. Os resultados demosntraram a associação da expressão do gene SHOC2 com proliferação celular e também com a indução de apoptose. Esses dados sugerem que a hiperexpressão desse gene pode ser importante para o processo de sensibilidade das células leucêmicas ao tratamento. Como conclusão, este trabalho demonstrou a associação de diversos genes com importantes parâmetros clínicos da LLA e destaca principalmente o papel do gene SHOC2 como possível alvo terapêutico para o tratamento da leucemia linfóide aguda. / Major improvements have been made in the ALL treatment, which achieved successful rates of approximately 80% of long-terms survival. Despite the significant percentage of success, the remaining 20 % still presents treatment failure and the molecular mechanisms involved in the resistance process remains unclear. The present study was undertaken to analyze and validate the gene expression pattern of the previously described genes related to prednisolone (F8A, CDK2AP1, BLVRB, CD69), vincristine (RPLP2, CD44, TCFL5, KCNN1, TRIM24), daunorubicin (MAP3K12, SHOC2, PDCH9, EGR1, KCNN4) and Lasparaginase (GPR56, MAN1A1, CLEC11A, IGFBP7, GATA3) in order to better inderstand these mechanisms. Bone marrow samples of ALL patients, obtained at diagnosis, in four oncology centers and treated according to the Brazilian protocol (GBTLI-99). The relative mRNA expression levels were quantified using real-time PCR analysis. Amplification of the specific sequences was performed with SYBR® Green reagent; GUSB was used as the reference gene and normal bone marrow samples used as calibrator. The expression profile analisis showed important associations among the studied genes and clinical features as WBC count at diagnosis, CALLA, TEL/AML1 translocation and minimal residual disease. Among the analyzed genes, possible therapy targets were found at SHOC2 and GPR56. Further we addressed the expression profile of these genes in ALL patients, treated according to the BFM protocol, which chacarterize a group of distinct genetic\'s background. The results confirmed the data previously obtained. The overexpression of the gene SHOC2, that was primaraly associated to sensibility to dauborubicin, was related to patients who presented good prednisone response, suggesting the correlation of SHOC2 with good prognostic factors. In order to acess the interaction level of this gene, the protein expression was analyzed and confirmed the mRNA expression data. Despite its lack of information, the data on SHOC2 shows its role as na important element in the Erk activation by Ras induced pathway. Finally, to better understand the possible mechanisms which involve SHOC2 gene to the chemotherapy response process, Jurkat cells was transfect with siRNA to silence the gene SHOC2. Further, functional assays were done to characterize the mechanisms involved. The results showed the association of SHOC2 gene expression with processes of cell proliferation and apoptosis induction, thus suggesting that the overexpression of SHOC2 could play an important role in leukemic cell\'s sensibility to chemotherapy agents, and consequently in patients\' treatment outcome. In conclusion, this work demonstrated the association of the expression profile of many genes with important clinical and laboratorial features. Furthermore, this data present the gene SHOC2 as a possible therapy target to acute lymphoblastic leukemia \'s treatment.

Questiona-se um possível papel deletério da endometriose sobre a qualidade oocitária (QO), que é, em grande parte, condicionada pelo papel das células do cumulus. A função dessas células envolve a expressão de diversas moléculas codificadas por genes específicos, regulada a nível de transcrição, pós-transcrição e tradução. Os microRNAs atuam como reguladores póstranscricionais da expressão gênica, de modo que qualquer alteração nesse mecanismo pode levar a anormalidades no desenvolvimento oocitário. Desta forma, propusemos um estudo inédito da análise de microRNAs em células do cumulus (CC) de mulheres inférteis com e sem endometriose com o objetivo de evidenciar processos biológicos e vias de atuação correlacionados com o papel da endometriose na infertilidade e seu possível impacto na aquisição da competência oocitária. Foram incluídas no estudo 15 pacientes inférteis (5 controles com fator tubário e/ou masculino, 5 com endometriose estágios I/II e 5 com endometriose estágios III/IV) submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI). Imediatamente após a captação oocitária, as CCs foram isoladas e armazenadas para extração dos miRNAs. O perfil de 754 miRNAs foi analisado por meio da técnica de TaqMan®Array Human MicroRNA Cards. Considerou-se significativo p<0,05. Os miRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose I/II comparadas às controles. Os miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsamiR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa-miR-629-5p foram identificados menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV em relação às controles. Ao comparar-se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV entre si, os miRNAs hsa-miR-187-3p e hsa-miR-532- 3p foram menos expressos e os miRNAs hsa-let-7f-1# e hsa-miR-362-3p mais expressos nas pacientes com endometriose III/IV. A análise de enriquecimento identificou os genes regulados pelos miRNAs e as respectivas vias metabólicas em que estão envolvidos, sugerindo aumento de apoptose, diminuição de proliferação celular, alterações no controle do ciclo celular e no metabolismo energético das CCs de mulheres com a doença inicial e avançada. Os dados apontam para alterações na regulação pós-transcricional em CCs de mulheres inférteis com endometriose inicial e avançada, o que pode afetar processos e vias essenciais à aquisição de competência oocitária e estar envolvido na infertilidade associada à doença. Este estudo contribui para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose identificando mecanismos pós-transcricionais relacionados à piora da qualidade gamética nestas mulheres. / It is questioned a possible deleterious role of endometriosis on oocyte quality (OQ), which is largely conditioned by the function of cumulus cells. The role of these cells involve the expression of several molecules encoded by specific genes, regulated at transcription level, post-transcription and translation. The microRNAs act as transcriptional regulators of gene expression, thus any alteration in this mechanism can lead to abnormalities in oocyte development. In this way, we proposed an unpublished study of the microRNAs analysis in cumulus cells (CC) of infertile women with and without endometriosis, aiming to evidence the biological processes and pathways of action correlated with the presence of endometriosis in infertility and its possible impact on the acquisition of oocyte competence. Fifteen infertile patients (5 controls with tubal factor and/or male, 5 with stage I/II of endometriosis and 5 with stages III/IV of endometriosis) submitted to the controlled ovarian stimulation (EOC) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were included in the study. Immediately after oocyte uptake, CCs were isolated and stored for miRNA extraction. The 754 miRNAs profile was analyzed using the TaqMan®Array Human MicroRNA Cards technique. Significant values were considered when p <0.05. The hsa-miR-218, hsa-miR-301 and hsa-miR-629-5p miRNAs were identified as less expressed in the patients with endometriosis I/II compared to controls. The miRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p and hsa-miR- 629-5p were identified as less expressed in patients with endometriosis III/IV compared to controls. Comparing the groups with endometriosis I/II and endometriosis III/IV, hsa-miR-187- 3p and hsa-miR-532-3p miRNAs were less expressed and hsa-let-7f-1# and hsa-miR-362-3p more expressed in patients with endometriosis III/IV. The enrichment analysis identified the genes regulated by the miRNAs and the respective metabolic pathways in which they are involved, suggesting apoptosis increase, decreased cell proliferation, alterations in the cell cycle control and energetic metabolism of the CCs of women with initial and advanced disease. The data point to changes in post-transcriptional regulation in CCs of infertile women with early and advanced endometriosis, which may affect processes and pathways essential for acquiring oocyte competence and resulting in infertility associated with the disease. This study contributes to the understanding of the etiopathogenesis of infertility related to endometriosis by identifying post-transcriptional mechanisms related to the deterioration of quality of gametes in these women.

INTRODUÇÃO: Recentemente, a classificação molecular do câncer gástrico (CG) emergiu como opção promissora para definir subgrupos prognósticos, distinguir o comportamento biológico, além de permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos para drogas específicas. Por meio de técnicas moleculares, o CG foi dividido em 4 subtipos: instabilidade de microssatélites (MSI), vírus Epstein-Barr (EBV)-positivo, genomicamente estável (GS) e instabilidade cromossômica (CIN). Os custos associados à complexidade técnica das metodologias moleculares são ainda um obstáculo para sua implantação na prática de rotina. OBJETIVOS: Determinar os grupos da classificação molecular por meio da expressão proteica de marcadores associados a cada subtipo. Comparar as diferentes classificações moleculares existentes e propor um novo modelo. MÉTODOS: Foram avaliados, retrospectivamente, 287 pacientes com CG submetidos à gastrectomia-D2 curativa, por meio da construção de tissue microarray. A expressão das proteínas de reparo do DNA, E-caderina e p53 foram avaliadas por imuno-histoquímica (IH), determinando os grupos MSI, GS e CIN, respectivamente. O EBV foi detectado por hibridização in situ (ISH). RESULTADOS: Após avaliação histopatológica, 179 (62,4%) pacientes foram classificados como CIN, 58 (20,2%) MSI, 30 (10,5%) EBV e 20 (7%) como GS. Os subtipos associaram-se com características distintas, tais como: gênero masculino (EBV, p=0.101); idade avançada (MSI, p=0,017), menor relação neutrófilo-linfócito (CIN, p=0,029), gastrectomia total (EBV, p < 0,001), localização distal (MSI, p=0,004), Laurén difuso (GS, p < 0,001), e estádio avançado (GS, p=0,014). O subtipo MSI apresentou melhor sobrevida livre de doença (SLD) (82,8%), seguido pelo EBV e CIN (ambos com 70%) e GS (50%) (p=0.005). A sobrevida global (SG) foi maior nos tumores MSI (75,9%), seguido pelo EBV (73,3%), CIN (65.4%) e GS (45%, mediana de 25 meses) (p=0.007). Em análise multivariada, gastrectomia total, pT, pN e os subtipos tumorais foram fatores significativos associados à SLD (MSI p=0,012; EBV p=0,037; CIN p=0,018; GS referência). Do mesmo modo, o tipo de cirurgia, pT, e os subtipos tumorais foram fatores independentes associados a SG (MSI p=0,010; EBV p=0,006; CIN p=0,025; GS referência). Com base no risco de recidiva dos pacientes do estudo, nova classificação, que inclui 5 subtipos, foi proposta. Evidenciou-se que a classificação por risco e cluster tiveram melhor acurácia para identificar recidivas e óbitos respectivamente. CONCLUSÃO: A análise IH/ISH foi capaz de determinar subtipos de CG com características clinicopatológicas e prognósticos distintos, reproduzindo os subtipos obtidos pela classificação molecular / BACKGROUND: Recently, the molecular classification of gastric cancer (CG) emerged as a promising option to define prognostic subgroups, to distinguish biological behavior, and to identify potential therapeutic targets for specific drugs. Through molecular techniques, GC was divided into 4 subtypes: microsatellite instability (MSI), Epstein-Barr virus (EBV) positive, genomically stable (GS) and chromosomal instability (CIN). The costs associated with the technical complexity of the molecular methodologies are still an obstacle to its implementation in routine practice. OBJECTIVES: To determine molecular classification groups by means of protein expression of markers associated with each subtype. To compare the different existing molecular classifications and propose a new model. METHODS: We retrospectively evaluated 287 CG patients submitted to curative D2-gastrectomy through the construction of tissue microarray. Expression of the DNA repair proteins, E-cadherin and p53 were evaluated by immunohistochemistry (IH), determining the MSI, GS and CIN subtypes, respectively. EBV was detected by in situ hybridization (ISH). RESULTS: After the histopathological evaluation, 179 (62.4%) patients were classified as CIN, 58 (20.2%) MSI, 30 (10.5%) EBV and 20 GS (7%) as GS. The subtypes presented associations with distinct characteristics, such as: male gender (EBV, p=0.101); advanced age (MSI, p=0.017), Laurén diffuse type (GS, p < 0.001), lower neutrophil-lymphocyte ratio (CIN, p=0.029), total gastrectomy (EBV, p < 0.001), distal location (MSI, p=0.004), and advanced stage (GS, p=0.014). The MSI subtype presented better disease-free survival (DFS) (82.8%), followed by the EBV and CIN subtypes (both with 70%) and GS (50%) (p=0.005). Overall survival (OS) was higher in MSI tumors (75.9%), followed by EBV (73.3%), CIN (65.4%) and GS (45%, median of 25 months) (p=0.007). In multivariate analysis, total gastrectomy, tumor invasion, lymph node metastasis, and tumor subtypes were significant factors associated with SLD (MSI p=0.012, EBV p=0.037, CIN p=0.018, GS reference). Likewise, type of surgery, pT, and tumor subtypes were independent factors associated with OS (p=0.010, p=0.010, EBV p=0.006, CIN p=0.025, GS reference). Based on the risk of recurrence, a new classification including 5 subtypes was proposed. It was evidenced that the risk classification and cluster had better accuracy to identify recurrences and deaths respectively. CONCLUSION: The IH / ISH analysis was able to determine CG groups with clinicopathological characteristics and distinct prognoses, reproducing the subtypes obtained by the molecular classification

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-19Bitstream added on 2014-06-13T19:07:44Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_lhb_me_arafcf.pdf: 553720 bytes, checksum: b0f8f04b07802f8bf467e43259c87fba (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A maior expressão de alvos transcricionais e componentes da via NFkB é uma característica distintiva das células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO) e pode estar relacionada com o estado mais primitivo das CTH dos neonatos. No entanto, as células CD34+ são um grupo heterogêneo de célulastronco (CT) e progenitoras em diferentes estágios de maturação e diferenças na composição celular entre MO e SCU poderiam contribuir para os resultados mencionados. Estudos recentes têm identificado o marcador de superfície CD133, como um marcador de CT mais primitivas, expresso em uma subpopulação de células CD34bright, com um sugestivo potencial de hemangioblasto. Com o objetivo de caracterizar a composição celular de MO e SCU e identificar mecanismos moleculares envolvidos com a maior primitividade das células CD133+, propusemos avaliar o perfis imunofenotípico (quanto à expressão de CD34 e CD133) por citometria de fluxo e de expressão gênica de células CD34+ e células CD133+ selecionadas imunomagneticamente, de ambas as fontes, pelas técnicas de microarray e PCR em tempo real. Nossos resultados revelaram que enquanto a maioria das células CD133+ são CD34+, independente da fonte, as células CD34+ de SCU possuem uma porcentagem significativamente maior de células CD133+ do que às células CD34+ de MO. A análise de clusterização revelou que as células CD133+ de MO se agrupam com as células de SCU (CD34+ e CD133+), enquanto as CD34+ de MO aparecem como um grupo distinto. A comparação dos perfis de expressão gênica entre as células CD133+ e as células CD34+, revelou a hiper-expressão... / A higher expression of transcription targets and components of the NF-kB pathway is a distinctive feature of umbilical cord blood (UCB) CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) when compared to bone marrow (BM) CD34+ HSC and this could be related to the more primitive state of the newborn’s HSC. However, CD34+ cells represent a heterogeneous group of cells composed by stem and progenitors cells in different developmental stages, and differences in cellular composition between both sources could contribute for these finding. The surface marker CD133 has been identified as a very primitive marker, expressed in a subpopulation of CD34bright, with a proposal hemangioblast potential. Thus, in attempt to better characterize the cellular composition of UCB and BM and to identify molecular mechanisms related to the more primitive characteristics of CD133+ cells, we proposed to evaluate the immunophenotypic profile (expression of CD34 and CD133) by flow-cytometry and the gene expression profiles of immunomagnetically selected CD34+ and CD133+ cells, from both sources, by microarray and Real time PCR. Our results highlighted that, while almost all CD133+ cells are CD34+ independently of the evaluated source, the UCB CD34+ cells showed a significantly higher proportion of CD133 expression, compared to BM CD34+ cells. After obtaining the expression profiles from distinct HSC pooled samples generated by microarrays, cluster analysis showed that BM CD133+ cells preferentially grouped with UCB cells (CD34+ and CD133+) instead of BM CD34+ cells, which appeared as a very distinct profile The comparison between CD133+ and CD34+ samples revealed the over-expression of 47 transcriptional factors (TF) in CD133+ cells, many of them well-known and related... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-08T18:20:15Z No. of bitstreams: 1 cp124617.pdf: 1851616 bytes, checksum: 98299c340bd6b09b83e3fdf34f6adcf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-08T18:20:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp124617.pdf: 1851616 bytes, checksum: 98299c340bd6b09b83e3fdf34f6adcf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T18:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp124617.pdf: 1851616 bytes, checksum: 98299c340bd6b09b83e3fdf34f6adcf5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / Introdução: Transplante alogênico de células tronco hematopoéticas (TCTH) é uma importante terapia para doenças hematológicas, mas o sucesso de uma porção de transplantes é limitado pela doença do enxerto versus hospedeiro(GVHD). Os fatores de risco conhecidos para GVHD agudo (aGVHD) não fornecem uma estimativa precisa do risco individual e não auxiliam na individualização da terapia. Até o momento, não existe método diagnóstico que permita predizer aGVHD. A identificação de pacientes que desenvolverão aGVHD poderia permitir a individualização da terapia para uns e evitaria imunossupressão intensa para outros. Objetivos: Revelar um classificador molecular preditivo de aGVHD. Descobrir genes diferencialmente expressos e analisar eventos precoces que desencadeiam aGVHD. Explorar categorias funcionais e tipos celulares relacionados ao desenvolvimento de aGVHD. Casuística e métodos: Foram isolados, amplificados, marcados e co-hidridados com lâminas de microarray contendo 22.000 sondas, amostras de RNA mensageiro de 89 pacientes submetidos a TCTH HLA-idêntico mieloablativo ou de toxicidade reduzida, obtido de células mononucleares periféricas durante a enxertia medular. Os pacientes foram divididos em grupo treino e grupo teste, um modo utilizado para construir um modelo que discrimine pacientes com e sem aGVHD, e para testar o modelo em amostras independentes. Os genes informativos foram selecionados utilizando recursive feature elimination, seguido de sete diferentes algoritmos de classificação multivariados para estabelecer o classificador molecular no grupo treino. Os genes diferencialmente expressos entre amostras de pacientes com e sem GVHD foram submetidos a análise de enriquecimento das vias funcionais e agrupados de acordo com o perfil de expressão com células e tecidos através do SymAtlas. Resultados: Encontramos um classificador molecular composto de 233 genes nas amostras do grupo treino, que foram selecionados baseados na mais precisa classificação. No grupo teste da amostra, cerca de 80% dos pacientes puderam ser classificados. Para estes pacientes, o classificador mostrou uma acurácia preditiva de 75% (sensibilidade de 71% e especificidade de 78%). Analisando a anotação funcional dos genes diferencialmente expressos, observamos que em pacientes que desenvolveram aGVHD, houve aumento de expressao de genes da resposta antimicrobiana, transporte de gases, metabolismo de hemoglobina, além das alarminas. Nestas amostras também observamos a diminuição da expressão da IL1 e outros genes envolvidos na via do NF-kB. Vários genes super-expressos no periodo precoce do aGVHD foram associados a células precursoras. Conclusões: Nossos resultados mostram que um classificador molecular é capaz de identificar pacientes sob alto risco de desenvolver aGVHD. Estabelecer métodos de diagnóstico preditivo para aGVHD é o primeiro passo para a individualização da estratégia terapêutica após TCTH. Além disso, os resultados da análise de enriquecimento funcional e a expressão de genes em diferentes populações celulares, sugerem que eventos precoces envolvendo múltiplas populações de células precursoras possam predefinir a interação futura entre o enxerto em desenvolvimento e o paciente. / Background: Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is an important last resort therapy for hematological diseases. Unfortunately, the success of a large proportion of these transplants is limited by graft-versus-host disease (GVHD). Currently known risk factors for acute GVHD (histoincompatibility, sex mismatch, older patients, previous pregnancies) do not provide a precise estimate of individual patient risk and do not help for individualization of the therapy. Early identification of those patients who will develop aGVHD may allow for individualized treatment, and also for the reduction of unnecessary treatment for those patients not at risk. Nowadays, however, there is no diagnostic method that allows prediction of aGVHD. Objectives: The goal of our study was to reveal a gene expression profile that would predict the occurrence of aGVHD. In addition, using enrichment of gene ontology categories, to analyze differentially expressed genes in order to better understand biology of the events preceding aGVHD. Material and methods: we collected blood samples from 89 recipients of myeloablative and reduced conditioning regimen HLA-identical sibling allogeneic hematopoietic stem cell transplants at the time of successful engraftment. We isolated total RNA from the peripheral blood mononuclear cells, amplified it, labeled, and co-hybridized to the microarray slides containing probes for 22,000 genes..The patients were divided into training and test groups, the former used to build a model discriminating patients with and without aGVHD and the latter - to test the model on independent samples. We selected the informative genes using “recursive feature elimination” method followed by seven different multivariate classification algorithms in order to establish a molecular classifier in the training set. Then we validated this new classifier in the test set of patients.. We found differentially expressed genes using T-test and accepted those with estimated false discovery rate below 10%. We have used Biobase Explain to find enrichment of functional groups among differentially expressed genes.Results: We found a molecular classifier comprised by 233 gene probes in the training set of samples which were selected based on the most accurate classification. In the test group of samples, we found that 80% of patients could be classified based on the concordance between classification methods as described above. For these patients, the classifier showed 75% of a predictive accuracy (71% of sensitivity and 78% of specificity). Analysis of functional annotations of differentially expressed genes showed that patients that developed acute GVHD have increased expression of antimicrobial genes, hemaglobin metabolism genes and alarmins. In these samples we also observed decreased expression of IL-1 and other genes involved in NF-kB activation. Several genes up-regulated before aGVHD were associated with multiple types of precursor cells. Conclusion: Our results show that molecular profiling is able to identify patients under high risk of acute GVHD at the time of engraftment. Establishing of a predictive diagnostic method for aGVHD is the first step of individualization of therapeutic strategy after hematopoetic stem cell transplantation. In addition, the results of functional enrichment analysis and expression in different cell populations suggest that early events during engrafment involving precursor cell populations might predefine results of interaction between stem cell allograft and patient body.

Sugarcane smut is a worldwide distributed disease important to agribusiness, since it can affect sugarcane yield drastically. The disease is caused by the Basidiomycete Sporisorium scitamineum, a biotrophic fungus that colonizes mainly sugarcane. Sugarcane-smut interaction has been extensively studied by this research group for the past few years in their various aspects, considering both the pathogen attack and plant defenses. This work aimed to functionally address fungal candidate effector proteins associated with this pathosystem. Effectors are essential to modulate host metabolism to allow pathogen colonization. The identification of such proteins may assist in recognition of resistance genes relevant to genetic breeding programs. Based on the complete genome sequence of S. scitamineum and the dual transcriptomic data candidate genes were selected in silico. Selection strategies were based on the predicted secretome and differential expression levels of the genes in planta. Candidate effectors were analyzed regarding their expression pattern, subcellular location and influence over basal plant defenses and plant immunity. The results showed that the S. scitamineum candidate effector genes are expressed under the influence of the host genotype. It was observed various expression patterns in the set of selected genes and differential subcellular localization patterns. These results will enable future researches considering virulence level of different isolates and also help decision making in plant breeding programs. / O carvão da cana-de-açúcar é uma doença cosmopolita de grande importância para o agronegócio, uma vez que pode afetar a produtividade da cultura. A doença é causada pelo basidiomiceto Sporisorium scitamineum, fungo biotrófico que coloniza exclusivamente a cana-de-açúcar. A interação cana-carvão vem sendo extensivamente estudada por este grupo de pesquisa nos últimos anos em seus vários aspectos, considerando as atividades de ataque e defesa do patógeno e da planta, respectivamente. Este trabalho teve como finalidade o estudo funcional de proteínas candidatas a efetores neste patossistema. Efetores são moléculas essenciais na manipulação do metabolismo e fisiologia do hospedeiro de forma a permitir sua colonização. A identificação de tais proteínas auxilia no reconhecimento de genes de resistência podendo gerar informações relevantes a programas de melhoramento genético na produção de variedades resistentes. A estratégia de seleção utilizada se baseia em características do secretoma predito e da expressão diferencial de genes do patógeno in planta. Os candidatos foram analisados quanto ao padrão de expressão gênica, à localização sub celular e sua influência sobre a defesa basal e imunidade em plantas. Os resultados demonstraram que a expressão dos genes que codificam para as proteínas efetoras de S. scitamineum e é influenciada pelo genótipo das plantas infectadas. Foram observadas variações no padrão de expressão entre o conjunto de efetores selecionados, bem como padrões diferenciais de localização sub celular e influência sobre a imunidade em plantas. Os resultados gerados por este trabalho servirão de subsídio para estudos futuros sobre os níveis de virulência dos diferentes isolados do patógeno bem como para auxiliar a tomada de decisão em programas de melhoramento genético de variedades resistentes ao carvão da cana.