2-Cys Prx compõem um grupo de enzimas antioxidantes homodiméricas que atuam na decomposição de hidroperóxidos utilizando uma cisteína reativa (cisteína peroxidásica - CysP). A alta reatividade da CysP é alcançada com o envolvimento de dois aminoácidos vicinais à CysP: uma treonina e uma arginina, que constituem a tríade catalítica. Após a decomposição do hidroperóxido, a CysP forma um dissulfeto intermolecular com um segundo resíduo de cisteína (cisteína de resolução - CysR), o qual é reduzido pela tiorredoxina (Trx). Durante o ciclo redox, estas enzimas sofrem alterações estruturais, mas os mecanismos envolvidos neste processo eram pouco compreendidos. Neste trabalho foi obtida a estrutura cristalográfica de Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae, uma 2-Cys Prx. Através de abordagens envolvendo bioquímica e biologia molecular, foi verificada a importância de aminoácidos envolvidos na reatividade e em transições da estrutura terciária e quaternária. Por fim, foram realizados esforços para a determinação da estrutura cristalográfica de mutantes obtidos neste trabalho. / 2-Cys Prx constitute a group of homodimeric antioxidant enzymes that act in the decomposition of hydroperoxides using a reactive cysteine (peroxidase cysteine - CysP). The high reactivity of the CysP is achieved by the participation of two vicinal amino acids: a threonine and an arginine, which constitute the catalytic triad. After the decomposition of hydroperoxide, the CysP forms an intermolecular disulfide with a second cysteine residue (resolving cysteine - CysR), which is reduced by the thioredoxin (Trx). During the redox cycle, these enzymes undergo to changes in the structure, but the molecular mechanisms involved in this process were poorly understood. In this study we have obtained the crystallographic structure of the 2-Cys Prx enzyme Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae. By means of biochemical and molecular biology approaches, the importance of amino acids involved in reactivity and structural transitions were determined. Finally, efforts have been performed to the determination of the crystallographic structures of mutant proteins obtained in this study.

As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1Δtsa2Δ se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1Δtsa2Δ produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1Δtsa2Δ. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 °C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1Δtsa2Δ cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1Δtsa2Δ cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1Δtsa2Δ compared to WT cells. Relevantly, tsa1Δtsa2Δ cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.

As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1Δtsa2Δ se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1Δtsa2Δ produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1Δtsa2Δ. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 °C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1Δtsa2Δ cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1Δtsa2Δ cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1Δtsa2Δ compared to WT cells. Relevantly, tsa1Δtsa2Δ cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.

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No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) Previous issue date: 2015-10-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Reactive oxygen species (ROS) are products naturally generated by the cell metabolism and at low levels play an important physiological role in intracellular regulation, whereas in excess can cause damage to cells. To combat this damage, cells present a complex defense mechanism including different enzymes which act as antioxidants. Among these enzymes, and especially in cells such as erythrocytes, which are exposed to high levels of molecular oxygen, the Peroxiredoxins (Prxs), stand out for the abundance and great reactivity with its substrates. In this cell type, when occurs hemolytic diseases such as sickle cell anemia and beta thalassemia, increased production of ROS and consequently oxidative damage are observed, greatly aggravating the clinical picture of patients affected by these diseases. In these diseases, the PRDX2 appears to be a major line of antioxidant defense, as it is the third most present protein in the cytosol of the erythrocyte. Therefore, this study aimed to assess the role of PRDX2 in differentiated K562 cells for the expression of erythroid characteristics, through gene silencing using shRNA_PRDX2. It was possible to obtain a 70% of the PRDX2 expression inhibition, which caused a decrease in the proliferation, cell viability and interaction, showing the importance of PRDX2 in oxidative protection on this cell type. In order to evaluate the modulation of antioxidant system in these cells, we also analyzed the pattern of gene and protein expression of all other PRDXs beyond the gene expression of other antioxidant enzymes during the process of differentiation. We found that inhibition of PRDX2 expression adversely affects the expression of PRDX5 and causes increased expression of their biological reducing agents, which increase the recycling PRDX2, compensating for their lack the cell. These data are not get described in the literature and additional analysis is needed to better understand this interaction beyond the molecular mechanisms involved in the expression of related enzymes in protection against ROS. Understanding these mechanisms seems important to work with a better insight of the pathophysiology of hemolytic diseases by identifying possible targets to assist in the management and can mitigate the effects of the disease in these patients. / Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos gerados naturalmente pelo metabolismo celular e em baixos níveis fisiológicos desempenham importante papel na regulação intracelular, enquanto que em excesso podem causar diversos danos às células. Para combater esses danos, as células apresentam um complexo mecanismo de defesa incluindo diferentes enzimas que atuam como antioxidantes. Dentre estas enzimas e, principalmente em células como os eritrócitos, que são expostas a altos teores de oxigênio molecular, as Peroxirredoxinas (Prxs), se destacam pela abundância e grande reatividade com os seus substratos. Neste tipo celular, quando ocorrem doenças hemolíticas como a anemia falciforme e a beta talassemia, uma maior produção de EROs e consequentemente de danos oxidativos são observados, agravando sobremaneira o quadro clínico dos pacientes acometidos por estas doenças. Nessas doenças, a PRDX2 aparenta ser uma importante linha de defesa antioxidante, já que é a terceira proteína mais presente no citosol do eritrócito. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo a avaliação do papel de PRDX2 em células K562 diferenciadas para a expressão de características eritróides, através do silenciamento gênico de PRDX2 utilizando shRNA. Foi possível a obtenção de uma inibição de 70% da expressão de PRDX2, a qual causou diminuição na proliferação, viabilidade e interação celular, mostrando a importância da PRDX2 na proteção oxidativa nesse tipo celular. Com o objetivo de avaliar a modulação do sistema antioxidante nestas células, analisamos também, o padrão de expressão gênica e proteica de todas as outras PRDXs além da expressão gênica de outras enzimas antioxidantes durante o processo de diferenciação. Verificamos que a inibição da expressão de PRDX2 afeta negativamente a expressão de PRDX5 e causa o aumento da expressão de seus redutores biológicos, o que aumentaria a reciclagem de PRDX2 compensando sua falta na célula. Esse dado é inédito na literatura e análises adicionais são necessárias para melhor compreender essa interação além dos mecanismos moleculares envolvidos na expressão de enzimas relacionadas na proteção contra EROS. A compreensão destes mecanismos parece importante para colaborar com o melhor entendimento da fisiopatologia de doenças hemolíticas, identificando possíveis alvos que auxiliem no manejo e que possam amenizar os efeitos da doença desses pacientes.