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This thesis explores bio-mediated processes in geotechnical and petroleum engineering. Worldwide energy consumption is rapidly increasing as the world population and per-capita consumption rises. The US Energy Information Agency (EIA) predicts that hydrocarbons will remain the primary energy source to satisfy the surging energy demands in the near future. The three topics described in detail in this document aim to link microbiology with geotechnical engineering and the petroleum industry. Microorganisms have the potential to exploit residual hydrocarbons in depleted reservoirs in a technique known as microbial enhanced oil recovery, MEOR. The potential of biosurfactants was analyzed in detail with a literature review. Biosurfactant production is the most accepted MEOR technique, and has been successfully implemented in over 700 field cases. Temperature is the main limiting factor for these techniques. The dissolution of carbonates by microorganisms was investigated experimentally. We designed a simple, economical, and robust procedure to monitor diffusion through porous media. This technique determined the diffusion coefficient of H+ in 1.5% agar, 1.122 x 10-5 cm2 sec-1, by using bromothymol blue as a pH indicator and image processing. This robust technique allows for manipulation of the composition of the agar to identify the effect of specific compounds on diffusion. The Red Sea consists of multiple seeps; the nearby sediments are telltales of deeper hydrocarbon systems. Microbial communities associated with the sediments function as in-situ sensors that provide information about the presence of carbon sources, metabolites, and the remediation potential. Sediments seeps in the Red Sea revealed different levels of bioactivity. The more active seeps, from the southern site in the Red Sea, indicated larger pore sizes, higher levels of carbon, and bioactivity with both bacteria and archaeal species present.

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Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_D.pdf: 7821596 bytes, checksum: b0f165c3b35ff62438f4e8f59035eb82 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O processo de biodegradação do petróleo em reservatórios pode resultar em mudanças na composição e propriedades físico-químicas de óleos brutos e gases naturais, as quais levam à diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados, produzindo óleos mais pesados e com baixo valor econômico. O uso combinado de técnicas dependentes e independentes de cultivo pode nos permitir um melhor entendimento acerca da comunidade de micro-organismos que habita os reservatórios de petróleo, incluindo aqueles responsáveis por esta biodegradação. O conhecimento sobre a composição microbiana, suas funções e interações com outros micro-organismos e com o ambiente pode levar à definição de estratégias de monitoramento e/ou controle da biodegradação em reservatórios. Este estudo teve como finalidade avaliar a diversidade de micro-organismos e genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos presentes em amostras de petróleo provenientes de dois poços terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado), através da construção de bibliotecas de genes catabólicos (alcano monooxigenases - alk, dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos ¿ ARHDs e 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hidroxilase - bamA) e sequenciamento em larga escala de metagenoma e metatranscriptoma de enriquecimentos microbianos aeróbios. Os resultados obervados mostraram uma distribuição diferencial dos genes catabólicos entre os reservatórios, sendo o óleo biodegradado mais diverso para os genes alk e bamA. As sequências foram semelhantes aos genes alkB dos gêneros Geobacillus, Acinetobacter e Streptomyces, aos genes ARHD dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia, e aos genes bamA do gênero Syntrophus. A análise quantitativa dos genes catabólicos de degradação de hidrocarbonetos presentes e expressos nos enriquecimentos microbianos em diferentes etapas da biodegradação do óleo, através de PCR Tempo Real, demonstrou maior atividade do gene que codifica a enzima dioxigenase nas comunidades microbianas enriquecidas, e os resultados obtidos pela técnica de microarray sugeriram a existência de novas sequências dos genes alk e ARHD provindas do reservatório de petróleo. As análises das sequências obtidas a partir do metagenoma e metatranscriptoma mostraram que a comunidade bacteriana recuperada no enriquecimento aeróbio é bastante diversa, com predominância do Filo Actinobacteria, seguido de Proteobacteria. As sequências com maior abundância e níveis de expressão foram relacionadas aos genes que codificam as proteínas ligase CoA de ácido graxo de cadeia longa, envolvida na degradação de compostos aromáticos; descarboxilase, envolvida com o ciclo do glioxilato, e o fator sigma da RNA polimerase, envolvida com a regulação da resposta ao estresse oxidativo, sugerindo uma adaptação da comunidade microbiana às condições do enriquecimento e um processo inicial de biodegradação dos hidrocarbonetos. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados inéditos sobre a diversidade de genes catabólicos e de membros da comunidade microbiana potencialmente envolvidos com a degradação do óleo em reservatórios de petróleo / Abstract: The process of oil biodegradation in reservoirs may result in changes in the composition and physico-chemical properties of crude oils and natural gases, which lead to the decrease of the content of saturated hydrocarbons, producing heavy oils and with low economic value. The combined use of both dependent and independet cultivation techniques may allow us to better understand the microbial community inhabiting oil reservoirs, including those microorganisms responsible for oil degradation. The knowledge about the microorganisms, ther functions and interactions with other microorganisms and the environment may lead to the definition of monitoring and/or control strategies of biodegradation in oil reservoirs. This study aimed at evaluating the diversity of microorganisms and genes involved in the degradation of hydrocarbons present in oil samples from two onshore reservoirs at Potiguar Basin (RN), identified as GMR75 (biodegraded) and PTS1 (non- biodegraded), through the construction of catabolic gene libraries (alkane monooxygenases - alk, aromatic ring hydroxylating dioxygenases ¿ ARHD and 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hydroxylase - bamA) and highthroughput sequencing of metagenome and metatranscriptome from aerobic microbial enrichments. Results observed showed a differential distribution of catabolic genes between the reservoirs, being the biodegraded oil more diverse for the alk and bamA genes. The sequences were similar to alkB genes from Geobacillus, Acinetobacter and Streptomyces genera, to the ARHD genes from Pseudomonas and Burkholderia genera, and to the bamA genes from Syntrophus genus. Quantitative analysis of the hydrocarbon degradation genes present and expressed in the microbial enrichments during the different phases of oil biodegradation by Real-Time PCR showed that there was a higher activity of dioxygenase enzymes in the enriched microbial communities and results from microarray assays suggested the existence of new alk and ARHD gene sequences originated from the oil reservoir. Metagenomic and metatranscriptomic analyses showed a highly diverse bacterial community, dominated by the Phylum Actinobacteria, followed by Proteobacteria. The most abundant and active sequences were affiliated to the Long-chain-fatty-acid-CoA ligase protein, involved in the degradation of aromatic compounds; decarboxylase, which is involved with the glyoxylate cycle, and RNA polymerase sigma factor, which is involved in regulating the oxidative stress response, suggesting an adaptation of the microbial community to the enrichment conditions and an initial process of biodegradation of hydrocarbon compounds. The results obtained in this work bring innovative data on the diversity of catabolic genes and microbial community members potentially involved with oil degradation in petroleum reservoirs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os métodos tradicionais de estimular a produção de petróleo, envolvendo a injeção de água, vapor, gás ou outros produtos, estabeleceram a base conceitual para novos métodos de extração de óleo, utilizando micro-organismos e processos biológicos. As tecnologias que empregam os processos de bioestimulação e bioaumentação já são amplamente utilizadas em inúmeras aplicações industriais, farmacêuticas e agroindustriais, e mais recentemente, na indústria do petróleo. Dada a enorme dimensão econômica da indústria do petróleo, qualquer tecnologia que possa aumentar a produção ou o fator de recuperação de um campo petrolífero gera a expectativa de grandes benefícios técnicos, econômicos e estratégicos. Buscando avaliar o possível impacto de MEOR (microbial enhanced oil recovery) no fator de recuperação das reservas de óleo e gás no Brasil, e quais técnicas poderiam ser mais indicadas, foi feito um amplo estudo dessas técnicas e de diversos aspectos da geologia no Brasil. Também foram realizados estudos preliminares de uma técnica de MEOR (bioacidificação) com possível aplicabilidade em reservatórios brasileiros. Os resultados demonstram que as técnicas de MEOR podem ser eficazes na produção, solubilização, emulsificação ou transformação de diversos compostos, e que podem promover outros efeitos físicos no óleo ou na matriz da rocha reservatório. Também foram identificadas bacias petrolíferas brasileiras e recursos não convencionais com maior potencial para utilização de determinadas técnicas de MEOR. Finalmente, foram identificadas algumas técnicas de MEOR que merecem maiores estudos, entre as técnicas mais consolidadas (como a produção de biossurfatantes e biopolímeros, e o controle da biocorrosão), e as que ainda não foram completamente viabilizadas (como a gaseificação de carvão, óleo e matéria orgânica; a dissociação microbiana de hidratos de gás; a bioconversão de CO2 em metano; e a bioacidificação). Apesar de seu potencial ainda não ser amplamente reconhecido, as técnicas de MEOR representam o limiar de uma nova era na estimulação da produção de recursos petrolíferos existentes, e até mesmo para os planos de desenvolvimento de novas áreas petrolíferas e recursos energéticos. Este trabalho fornece o embasamento técnico para sugerir novas iniciativas, reconhecer o potencial estratégico de MEOR, e para ajudar a realizar seu pleno potencial e seus benefícios. / The traditional methods of stimulating production, involving the injection of water, steam, gas or other products, have established the conceptual basis for new methods of oil extraction, utilizing microorganisms and biological processes. Technologies that employ biostimulation and bioaugmentation processes are widely utilized in numerous industrial, pharmaceutical and agroindustrial applications, and, more recently, in the oil industry. Given the enormous economic dimension of the oil industry, any technology that can increase production or recovery of an oil field creates the expectation of large technical, economic and strategic benefits. In order to assess the possible impact of MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) on the recovery factor of oil and gas reserves in Brazil, and which techniques might be most indicated, a wide ranging study of those techniques and of various aspects of the geology of Brazil was carried out. Preliminary studies of a MEOR technique (bioacidification) with possible application in Brazilian reservoirs were also carried out. The results demonstrate that MEOR techniques can be effective in the production, solubilization, emulsification or transformation of several compounds, and that they can promote other physical effects in the oil or the reservoir rock matrix. Brazilian oil basins and unconventional resources with potential for utilization of certain MEOR techniques were also identified. Finally, certain MEOR techniques that deserve further studies were identified, involving both more consolidated techniques (such as biosurfactant and biopolymer production, and the control of microbially induced corrosion), as well as those that have not yet fully proven their viability (such as coal, oil and organic matter gasification; microbial dissociation of gas hydrates; bioconversion of CO2 into methane; and bioacidification). Despite the fact that their potential is not yet fully recognized, MEOR techniques represent the dawn of a new era in the stimulation of production of existing oil resources, and even in the production development plans of new oil and other energy resources. This work furnishes the technical basis for suggesting new initiatives, for recognizing the strategic potential of MEOR, and for helping to realize the full potential of MEOR and its benefits.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os métodos tradicionais de estimular a produção de petróleo, envolvendo a injeção de água, vapor, gás ou outros produtos, estabeleceram a base conceitual para novos métodos de extração de óleo, utilizando micro-organismos e processos biológicos. As tecnologias que empregam os processos de bioestimulação e bioaumentação já são amplamente utilizadas em inúmeras aplicações industriais, farmacêuticas e agroindustriais, e mais recentemente, na indústria do petróleo. Dada a enorme dimensão econômica da indústria do petróleo, qualquer tecnologia que possa aumentar a produção ou o fator de recuperação de um campo petrolífero gera a expectativa de grandes benefícios técnicos, econômicos e estratégicos. Buscando avaliar o possível impacto de MEOR (microbial enhanced oil recovery) no fator de recuperação das reservas de óleo e gás no Brasil, e quais técnicas poderiam ser mais indicadas, foi feito um amplo estudo dessas técnicas e de diversos aspectos da geologia no Brasil. Também foram realizados estudos preliminares de uma técnica de MEOR (bioacidificação) com possível aplicabilidade em reservatórios brasileiros. Os resultados demonstram que as técnicas de MEOR podem ser eficazes na produção, solubilização, emulsificação ou transformação de diversos compostos, e que podem promover outros efeitos físicos no óleo ou na matriz da rocha reservatório. Também foram identificadas bacias petrolíferas brasileiras e recursos não convencionais com maior potencial para utilização de determinadas técnicas de MEOR. Finalmente, foram identificadas algumas técnicas de MEOR que merecem maiores estudos, entre as técnicas mais consolidadas (como a produção de biossurfatantes e biopolímeros, e o controle da biocorrosão), e as que ainda não foram completamente viabilizadas (como a gaseificação de carvão, óleo e matéria orgânica; a dissociação microbiana de hidratos de gás; a bioconversão de CO2 em metano; e a bioacidificação). Apesar de seu potencial ainda não ser amplamente reconhecido, as técnicas de MEOR representam o limiar de uma nova era na estimulação da produção de recursos petrolíferos existentes, e até mesmo para os planos de desenvolvimento de novas áreas petrolíferas e recursos energéticos. Este trabalho fornece o embasamento técnico para sugerir novas iniciativas, reconhecer o potencial estratégico de MEOR, e para ajudar a realizar seu pleno potencial e seus benefícios. / The traditional methods of stimulating production, involving the injection of water, steam, gas or other products, have established the conceptual basis for new methods of oil extraction, utilizing microorganisms and biological processes. Technologies that employ biostimulation and bioaugmentation processes are widely utilized in numerous industrial, pharmaceutical and agroindustrial applications, and, more recently, in the oil industry. Given the enormous economic dimension of the oil industry, any technology that can increase production or recovery of an oil field creates the expectation of large technical, economic and strategic benefits. In order to assess the possible impact of MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) on the recovery factor of oil and gas reserves in Brazil, and which techniques might be most indicated, a wide ranging study of those techniques and of various aspects of the geology of Brazil was carried out. Preliminary studies of a MEOR technique (bioacidification) with possible application in Brazilian reservoirs were also carried out. The results demonstrate that MEOR techniques can be effective in the production, solubilization, emulsification or transformation of several compounds, and that they can promote other physical effects in the oil or the reservoir rock matrix. Brazilian oil basins and unconventional resources with potential for utilization of certain MEOR techniques were also identified. Finally, certain MEOR techniques that deserve further studies were identified, involving both more consolidated techniques (such as biosurfactant and biopolymer production, and the control of microbially induced corrosion), as well as those that have not yet fully proven their viability (such as coal, oil and organic matter gasification; microbial dissociation of gas hydrates; bioconversion of CO2 into methane; and bioacidification). Despite the fact that their potential is not yet fully recognized, MEOR techniques represent the dawn of a new era in the stimulation of production of existing oil resources, and even in the production development plans of new oil and other energy resources. This work furnishes the technical basis for suggesting new initiatives, for recognizing the strategic potential of MEOR, and for helping to realize the full potential of MEOR and its benefits.

Soil contamination by gasoline underground storage tanks is a critical environmental problem. The results herein show that in situ bioremediation using indigenous soil microorganisms is the method of choice. Five sites were selected for bioremediation based on the levels of benzene, toluene, ethylbenzene and xylene and the amount of total petroleum hydrocarbons in the soil. Bacteria capable of degrading these contaminants were selected from the contaminated sites and grown in 1,200 I mass cultures. These were added to the soil together with nutrients, water and air via PVC pipes.