<p>The use of nano- and micro-particulate carriers as delivery systems for oral vaccines has been under investigation for several decades. Surprisingly little is known of their uptake in the human intestine, despite the fact that substantial improvement is required to achieve adequate immune responses in man after oral administration. </p><p>In this thesis, various aspects of particle transcytosis across the human intestinal epithelium were studied, in order to identify strategies for improved uptake of nano- and micro-particulate drug delivery systems. </p><p>The follicle associated epithelium (FAE) overlying Peyer´s patches contains M-cells, which have an increased capacity for uptake of particulate antigens. Therefore, a model of human FAE was developed to study mechanisms of particle uptake and transport.</p><p>Receptors that could be used for targeting to the FAE had previously not been identified in humans. By use of the model FAE, two new targets were identified on human intestinal FAE; CD9 and β1-integrin. Furthermore, studies of isolated human intestinal tissue showed that an integrin-adherent peptide motif, RGD, could be utilized to achieve selective and improved transport of nanoparticles into human Peyer´s patches.</p><p>Studies of factors influencing intestinal particle uptake and transcytosis revealed that two cytokines, TNF-α and LTα1/β2, but also one growth factor, TGF-β1, induced uptake of particles in Caco-2 cells and transcytosis of particles in the model FAE. Furthermore, it was shown that an enteric bacterium, Yersinia Pseudotuberculosis, could trigger uptake and transcytosis of particles across model absorptive epithelial cells.</p><p>In conclusion, this thesis provides a platform for further investigations of particle transcytosis across the human intestinal epithelium. The identification of two new proteins with increased expression in human FAE and a targeting sequence that improves particle uptake into Peyer’s patches, gives new hope for the development of subunit oral vaccines.</p>

The use of nano- and micro-particulate carriers as delivery systems for oral vaccines has been under investigation for several decades. Surprisingly little is known of their uptake in the human intestine, despite the fact that substantial improvement is required to achieve adequate immune responses in man after oral administration. In this thesis, various aspects of particle transcytosis across the human intestinal epithelium were studied, in order to identify strategies for improved uptake of nano- and micro-particulate drug delivery systems. The follicle associated epithelium (FAE) overlying Peyer´s patches contains M-cells, which have an increased capacity for uptake of particulate antigens. Therefore, a model of human FAE was developed to study mechanisms of particle uptake and transport. Receptors that could be used for targeting to the FAE had previously not been identified in humans. By use of the model FAE, two new targets were identified on human intestinal FAE; CD9 and β1-integrin. Furthermore, studies of isolated human intestinal tissue showed that an integrin-adherent peptide motif, RGD, could be utilized to achieve selective and improved transport of nanoparticles into human Peyer´s patches. Studies of factors influencing intestinal particle uptake and transcytosis revealed that two cytokines, TNF-α and LTα1/β2, but also one growth factor, TGF-β1, induced uptake of particles in Caco-2 cells and transcytosis of particles in the model FAE. Furthermore, it was shown that an enteric bacterium, Yersinia Pseudotuberculosis, could trigger uptake and transcytosis of particles across model absorptive epithelial cells. In conclusion, this thesis provides a platform for further investigations of particle transcytosis across the human intestinal epithelium. The identification of two new proteins with increased expression in human FAE and a targeting sequence that improves particle uptake into Peyer’s patches, gives new hope for the development of subunit oral vaccines.

Nous avons mis en évidence la présence des phagocytes exprimant le lysozyme dans les Plaque de Peyer chez l’Homme et montré que, comme chez la souris, elles sont principalement localisées dans le SED et sont distinctes des cDC. Dans un deuxième temps, nous avons étudié dans les PP de souris la fonction des différentes populations de phagocytes nouvellement caractérisées. Nous avons en particulier étudié l’impact de la détection d’un acide nucléique d’origine virale par les phagocytes en utilisant un agoniste synthétique du TLR7 : le R848. Bien que TLR7 soit exprimé par les cellules dérivées de monocytes et les DC plasmacytoïdes mais pas par les cDC, nous avons mis en évidence un processus d’activation rapide des cDC impliquant le TNF. Celui-ci conduit à une migration des cDC depuis les villosités adjacentes au dôme vers les IFR et à une forte augmentation de l’expression du CMH-II, des molécules co-stimulatrices ainsi que des gènes dépendants de l’interféron. L’activation du TLR7 induit également une forte expression de la sous unité p40 de l’IL-12 par les LysoDC et certains macrophages. De manière intéressante, nous avons également observé une forte expression d’IL-12 p40 par les LysoDC et certains macrophages peu de temps après le sevrage. Cela nous a conduits à étudier le rôle de cette cytokine dans la mise en place de la réponse immunitaire mucosale. Notre étude a donc des répercussions sur la compréhension des mécanismes conduisant à la mise en place de la réponse immunitaire mucosale en réponse à l’implantation du microbiote intestinal peu de temps après la naissance. / In this study, we first showed that lysozyme expressing cells are found in human PP and share features with their mouse counterpart, such as location and origin. Then, we investigated the behaviour of mouse PP phagocytes upon TLR7 stimulation, using the small synthetic agonist, R848. In PP TLR7 is expressed by monocyte derived cells and plasmacytoid DC, but not by cDC. Nevertheless, TLR7 stimulation triggers a quick activation of cDC. This activation relies on TNF secretion and leads to a massive migration of cDC from the dome associated villi to the IFR and to an increase of MHCII, co-stimulatory molecules and interferon-stimulated gene expression. Stimulation by TLR7 also induces a massive production of IL12p40 by LysoDC and some macrophages. Interestingly, we observed a similar increase of IL-12 p40 production by LysoDC and macrophages shortly after weaning. We thus investigated the impact of Il-12 p40 secretion on the development of the mucosal immune response. Therefore, our study provides clues on the mechanisms involved in the establishment of the mucosal immune response following microbiota colonization.

La maladie de Crohn (MC) est une affection inflammatoire chronique du tube digestif dont l'étiologie est multifactorielle. Les lésions iléales des patients atteints de MC sont anormalement colonisées par des souches pathogènes de Escherichia coli appartenant au pathovar AIEC («Adherent-Invasive E. coli»). Ces souches sont capables d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales, et ont la capacité de survivre et de se multiplier fortement en macrophages en induisant une synthèse intense de TNF-α. L'objectif de ce travail s'inscrit dans la compréhension des mécanismes permettant aux bactéries AIEC de coloniser la muqueuse intestinale et d'induire les stades précoces de la pathologie. Une précédente étude menée au laboratoire avait permis de mettre en évidence l'importance de l'activation de la voie de régulation dépendante du facteur bactérien sigma alternatif RpoE (ou σE) dans le processus d'adhésion et d'invasion des cellules épithéliales intestinales par la souche AIEC de référence LF82 via l'expression des pili de type 1 et des flagelles. En continuité de ces travaux, nous montrons que l'activation de la voie de signalisation dépendante du facteur σE est également primordiale pour la capacité des souches AIEC à former des biofilms, et une analyse bioinformatique ayant pour but d'identifier les gènes régulés par σE a montré que l’opéron waaWVL, impliqué dans la biosynthèse du lipopolysaccharide, est primordial pour la formation de biofilm par les souches AIEC. De plus, nous avons mis en évidence que les long polar fimbriae (LPF) sont impliqués dans le ciblage de l'épithélium associé aux plaques de Peyer par les bactéries AIEC, et ceci en leur permettant de cibler spécifiquement les cellules M. L'inactivation du gène Nod2, gène de susceptibilité à la MC, conduit à une augmentation du nombre de plaques de Peyer ainsi que des cellules M à leur surface, indiquant que les bactéries AIEC pourraient tirer avantage d'une susceptibilité génétique pour cibler les plaques de Peyer. / 2026/5000Crohn's disease (CD) is a chronic inflammatory condition of the gastrointestinal tract with a multifactorial etiology. The ileal lesions of MC patients are abnormally colonized by pathogenic strains of Escherichia coli belonging to the AIEC ("Adherent-invasive E. coli") pathovar. These strains are able to adhere and invade intestinal epithelial cells, and have the ability to survive and multiply strongly in macrophages by inducing intense TNF-α synthesis. The aim of this work is to understand the mechanisms by which AIEC bacteria colonize the intestinal mucosa and induce early stages of the pathology. A previous study carried out in the laboratory had made it possible to highlight the importance of the activation of the regulatory pathway dependent on the bacterial factor sigma alternative RpoE (or σE) in the process of adhesion and invasion of intestinal epithelial cells by the AIEC reference strain LF82 via expression of type 1 pili and flagella. As a continuation of this work, we show that the activation of the σE-dependent signaling pathway is also essential for the ability of AIEC strains to form biofilms, and a bioinformatic analysis aimed at identifying σE-regulated genes. showed that the waaWVL operon, which is involved in the biosynthesis of lipopolysaccharide, is essential for biofilm formation by AIEC strains. In addition, we have shown that long polar fimbriae (LPF) are involved in the targeting of Peyer's plaque-associated epithelium by AIEC bacteria, allowing them to specifically target M cells. Inactivation of the MC susceptibility gene, Nod2, leads to an increase in the number of Peyer's patches as well as M cells on their surface, indicating that AIEC bacteria could benefit from genetic susceptibility to target Peyer's patches.

Certaines fibres alimentaires réduiraient l'apparition des cancers colorectaux mais l'hypothèse reste contreversée. Un des mécanismes fait intervenir la production par fermentation de butyrate. Nous avons testé deux fibres butyrogènes chimiquement différentes (fructo-oligosaccharides à chaîne courte scFOS, et amidon résistant) versus une fibre faiblement productrice de butyrate (son de blé désamidonné) chez la souris Min, un modèle de carcinogenèse intestinale spontanée. Seul le régime scFOS réduisait le nombre de tumeurs coliques et stimulait l'immunité locale. La nature chimique de la fibre ou bien les propriétés prébiotiques des scFOS (ils favorisent la croissance de bactéries lactiques qui agiraient sur la réaction immunitaire) sont donc impliquées. Deux autres types d'amidons résistants réduisaient le nombre de petites tumeurs. L'addition de bifidobactéries à l'un de ces deux régimes réduisait le nombre de petites tumeurs, mais augmentait celui de grosses tumeurs illustrant le concept de modulation par l'immunogénicité de la dualité immunofacilitation/surveillance. La déplétion en lymphocytes T associée au régime scFOS doublait le nombre de tumeurs par rapport aux souris immunocompétentes. Le régime scFOS diminuait l'expression du récepteur à l'IL2 à la surface des lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) suggérant la mise en anergie temporaire du système immunitaire, mais pouvant aussi signifier l'implication d'une autre voie d'activation des LIE. Enfin, pour mettre en place une modélisation des intéractions lympho-épithéliales, nous avons croisé des souris C57BL6 et Min avec la souris transgénique Immortomouse et isolé à partir de primo-cultures de muqueuses des lignées cellulaires conditionnellement immortalisées saines et mutées sur Apc. Ce modèle permettra d'étudier en co-culture sur filtre, l'influence des glucides indigestibles et de leurs produits de fermentation sur les interactions lympho-épithéliales au cours de la carcinogenèse.

Le tropisme cellulaire des prions infectieux diffère selon lespèce animale, celui-ci est corrélé à la souche infectieuse et à des facteurs spécifiques de lhôte. Par exemple, certains prions infectieux sont lymphotropiques, notamment en cas de scrapie chez les moutons et de variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ) chez lhomme. Par opposition, certains prions se caractérisent par un neurotropisme comme observé chez des patients Creutzfeldt-Jakob atteints de la forme sporadique ou chez des bovins atteints dencéphalopathies spongiformes bovines (ESB). Lhypothèse de notre travail repose sur les observations suivantes : dans le cas du variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob et des encéphalopathies spongiformes bovines, lagent responsable est identique, la voie dinoculation et les lésions neurologiques le sont également, seul le tropisme de cette souche pour les organes lymphoïdes diffère. En effet, les amygdales, la rate et lappendice sont infectieux chez lhomme. Par contre, linfectiosité est surtout confinée au niveau du système nerveux chez le bovin. Lors dune inoculation expérimentale par voie orale de lagent responsable de lESB chez les bovins, les plaques de Peyer iléales sont les seuls tissus lymphoïdes infectieux. Notre hypothèse de travail est que des propriétés de lhôte interviennent dans le tropisme de lagent infectieux. Deux axes de recherche ont été envisagés afin de vérifier cette hypothèse :  Lanalyse de la distribution des fibres nerveuses au sein des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT) des espèces bovine et humaine  Létude de lexpression de PrPc et de ses isoformes au sein des tissus lymphoïdes et nerveux des espèces bovine et humaine. Pour atteindre au mieux nos objectifs, il nous manquait un outil essentiel permettant la caractérisation spécifique des FDC bovines. En effet, aucun marqueur spécifique de ces cellules nétait commercialisé. Nous avons donc produit, en collaboration avec le Centre dEconomie Rural de Marloie, un anticorps monoclonal spécifiquement dirigé contre les cellules folliculaires dendritiques (FDC) bovines. Cet anticorps nous a permis détudier la distribution des FDC au sein des organes lymphoïdes bovins. Une attention particulière a été portée aux FDC isolées à partir des plaques de Peyer jéjunales (PPJ) et iléales (PPI). Lapparente différence dinfectivité de ces tissus lymphoïdes chez des bovins atteints expérimentalement dESB nous a conduit à comparer les capacités fonctionnelles des FDC isolées à partir de PPJ et de PPI. Ces observations sont décrites et discutées dans le chapitre 1. Dans le chapitre 2, nous avons établi une cartographie des fibres nerveuses au sein des amygdales, des plaques de Peyer iléales et jéjunales bovines de plusieurs catégories dâge et ensuite comparé ce pattern dinnervation à celui des amygdales humaines; ceci permettra de pister les voies potentielles de neuro-invasion. Une attention particulière a été portée à linterface cellules folliculaires dendritiques fibres nerveuses. En effet, les FDC matures jouent un rôle prépondérant dans la pathogenèse des maladies à prion puisquen leur absence, une infection périphérique na pas lieu. De plus, la proximité entre fibres nerveuses et FDC est un paramètre intervenant dans la neuro-invasion; nous avons dès lors aussi analysé les contacts entre les FDC et les éléments nerveux. Lexpression de la PrPc est une condition sine qua non pour la formation de PrPres. Cette protéine cellulaire sert probablement de récepteur pour son homologue infectieux mais sert surtout de substrat pour lamplification de PrPres ; toute modification au niveau de sa synthèse pourrait entraîner un changement de la cinétique dinfection et pourrait expliquer lapparente absence dinfectivité constatée au niveau du système immunitaire chez les bovins. Lexpression tissulaire et cellulaire spécifique disoformes de la PrPc représente un facteur de lhôte potentiellement capable dinfluencer le tropisme cellulaire de lagent infectieux chez lhumain et le bovin. Cette expression a été étudiée dans les systèmes MALT bovins et humains. Pour affiner notre étude, nous avons analysé, par des techniques de western-blotting, le glycopattern de la PrPc ainsi que lexpression de ses formes tronquées dans les tissus lymphoïdes humains et bovins mais également dans des populations cellulaires spécifiques, les lymphocytes et les FDC. Afin de vérifier si les isoformes de PrPc sont spécifiques aux tissus lymphoïdes, nous avons effectué une étude comparative du pattern de glycosylation et du ratio des formes clivées de PrPc, exprimés au sein de différentes régions du système nerveux central bovin et humain. Les résultats de ces travaux sont repris dans le chapitre 3.

Chez les mammifères, le développement du système immunitaire intestinal est initié in utero par un programme déterminé génétiquement. Cependant, le développement complet de ce système immunitaire et sa maturation finale n'ont lieu qu'après la naissance, sous l'influence des très nombreuses bactéries qui colonisent alors l'intestin et qui composent le microbiote intestinal. L'utilisation de modèles in vivo originaux de souris axéniques, sans germe, et gnotoxéniques, colonisées avec des bactéries individuelles ou des groupes de bactéries plus ou moins complexes, nous a permis d'identifier le rôle particulier de la bactérie segmentée filamenteuse (ou SFB) dans la maturation des réponses immunes intestinales adaptatives, IgA et lymphocytaires T. Sa capacité singulière à adhérer à l'épithélium des plaques de Peyer suggère un rôle important de ces formations lymphoïdes dans l'initiation des réponses immunes induites par la SFB. Nos résultats renforcent l'idée du rôle majeur des plaques de Peyer dans l'initiation des réponses IgA intestinales par le microbiote. De façon inattendue, en l'absence de ces structures, la SFB induit dans le chorion des souris, la néogenèse de structures lymphoïdes tertiaires capables d'initier des réponses IgA associées à une forte réponse IL-17 spécifique de la SFB. Ces résultats suggèrent que les puissantes propriétés immunostimulantes de la SFB sont soutenues par de multiples voies d'induction des réponses immunes qui pourraient être liées à son adhésion à la muqueuse intestinale

Les plaques de Peyer (PP) sont les principaux sites inducteurs de la réponse immunitaire mucosale.L’épithélium associé aux follicules comprend des cellules épithéliales spécifiques, appelées cellules M et spécialisées dans le transport du matériel présent dans la lumière intestinale vers le dôme sous épithélial (SED) où il sera pris en charge par les cellules du système phagocytaire mononuclée (MPS) qui orchestreront ensuite les réponses immunitaires mucosales.Nous avons effectué une analyse complète du phénotype, de la distribution, de l’ontogénie, de la fonction et des profils transcriptomiques du MPS des PP. Nous avons montré que les monocytes donnent naissance à deux populations: les lysoDC et les lysoMac. La première exprime de fort niveau de CMH-II et de molécules de costimulation, a une courte durée de vie et est capable d’activer les lymphocytes T naïfs pour sécréter de l’IFNγ tandis que la deuxième exprime faiblement le CMH-II, à une longue durée de vie et n’est pas capable d’activer les LT naïfs. Ces deux populations ont toutefois des propriétés communes de phagocytose et de défense innée contre les virus et les bactéries entéropathogènes. Nous avons identifié deux populations distinctes de lysoMac selon l’expression de Tim4: les lysoMac Tim4+ situés dans l’IFR et la partie inférieure du follicule ; les lysoMac Tim4- situés dans le SED et la partie supérieure du follicule. Nous avons aussi déterminé 4 états de maturation pour les lysoDC suivant l’expression d’Emb, Jam-A et CD24. Nous avons également redéfini la localisation de chaque population du MPS des PP fournissant ainsi une base solide pour étudier le rôle de chacun de ses membres dans l’immunité mucosale. / Peyer’s patches (PPs) are primary inductive sites of mucosal immunity. The follicle-associated epithelium contains specialized epithelial cells, called M cells, that bind and rapidly transport microorganisms from the lumen to the subepithelial dome (SED) where they are internalized by cells of the mononuclear phagocyte system (MPS) which are involved in the initiation of the mucosal immune responses. MPS comprise monocytes, macrophages (Mφ) and dendritic cells (DC). Here, we provide a comprehensive analysis of the phenotype, distribution, ontogeny, function, and transcriptional profile of PP MPS. We show that monocyte give rise to two different cell populations named lysoDC and lysoMac. The former express high levels of MHCII and costimulatory molecules, have a short half life and are able to prime naïve T cells for IFNγ production while the latter display low levels of MHCII, have a long half life and are unable to prime naïve T cells efficiently. However, these two cell populations share common features such as phagocytosis and antimicrobial defense mechanisms. LysoMac can be separated in two subpopulations according to Tim4 expression: Tim4+ lysoMac located in the IFR and the lower part of the follicle; Tim4- lysoMac located in the SED and upper part of the follicle. LysoDC can be separated in four different maturation stages according to Emb, Jam-A and CD24 expression. Finally, we redefined the location of each PP MPS population. In summary, we provide a comprehensive map of the PP MPS which will allow to study its role in mucosal immune response initiation and regulation.

La maladie de Crohn (MC) est une affection inflammatoire chronique du tube digestif dont l'étiologie est multifactorielle. Les lésions iléales des patients atteints de MC sont anormalement colonisées par des souches pathogènes de Escherichia coli appartenant au pathovar AIEC pour " Adherent-Invasive E. coli ". Ces souches sont capables d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales, et ont la capacité de survivre et de se multiplier fortement en macrophages en induisant une synthèse intense de TNF-α. L'objectif de ce travail s'inscrit dans la compréhension des mécanismes permettant aux bactéries AIEC de coloniser la muqueuse intestinale et d'induire les stades précoces de la pathologie. Une précédente étude menée au laboratoire avait permis de mettre en évidence l'importance de l'activation de la voie de régulation dépendante du facteur bactérien sigma alternatif RpoE (ou σE) dans le processus d'adhésion et d'invasion des cellules épithéliales intestinales par la souche AIEC de référence LF82 via l'expression des pili de type 1 et des flagelles. En continuité de ces travaux, nous montrons que l'activation de la voie de signalisation dépendante du facteur σE est également primordiale pour la capacité des souches AIEC à former des biofilms, et une analyse bioinformatique ayant pour but d'identifier les gènes régulés par σE a montré que l'opéron waaWVL, impliqué dans la biosynthèse du lipopolysaccharide, est primordial pour la formation de biofilm par les souches AIEC. De plus, nous avons mis en évidence que les long polar fimbriae (LPF) sont impliqués dans le ciblage de l'épithélium associé aux plaques de Peyer par les bactéries AIEC, et ceci en leur permettant de cibler spécifiquement les cellules M. L'inactivation du gène Nod2, gène de susceptibilité à la MC, conduit à une augmentation du nombre de plaques de Peyer ainsi que des cellules M à leur surface, indiquant que les bactéries AIEC pourraient tirer avantage d'une susceptibilité génétique pour cibler les plaques de Peyer.