La cristallisation est un processus d’auto-assemblement de molécules à partir d’une phase désordonnée (liquide, amorphe ou gazeuse). De façon générale, la miscibilité à l’état solide entre un constituant d’intérêt et son impureté dépendent d’une part, de la structure moléculaire de ces deux espèces, et d’autre part, de la structure cristalline du réseau hôte, c’est-à-dire celui du composé d’intérêt. En cas d’absence de miscibilité, l’optimisation des conditions de cristallisation permet un retrait total de l’impureté du composé visé. Cette thèse vise à démontrer que, lorsque deux molécules sont semblables et que leur structure cristalline est peu dense, des solutions solides de substitutions peuvent se former et empêcher le retrait de l’impureté de l’espèce cible. Inversement, lorsque les impuretés sont très diférentes de l’espèce à purifer, l’absence de solution solide est observée et permet leur élimination totale grâce à une bonne discrimination à l’état solide. Le système du phénanthrène, un composé servant entre autres de base pour la synthèse de composésmorphiniques, a été choisi pour illustrer cette thèse. Diverses méthodes de cristallisation (fusion de zone, co-cristallisation, recristallisation en solution, sublimation-condensation) ont été testées et ont permis, après optimisation et combinaison, l’obtention à l’échelle préparative de phénanthrène pur à plus de 99,999 % en moles, ce qui le place sur l’échelle de l’ultra-pureté (pureté > 99,9 % en moles). / Crystallization is a process during which molecules self assembly from a disordered (liquid, amorphous or gaseous) phase. The miscibility in the solid state between a component of interest and its impurity depends on: (i) their molecular structures, (ii) the crystal structure of the host lattice (namely, that of the component of interest). When no solid solution exists, the impurity can be completely eliminated from the target product after optimization of the crystallization conditions.The present thesis intends to demonstrate that, when two compounds present similar molecular structures with low-density crystal structures, solid solution formation can occur which prevents from their complete separation. Conversely, in case of sufcient dissimilarity, no solid solution is stable and their separation is possible thanks to a large discrimination in the solid state. The phenanthrene system – a model compound used as base for the synthesis of morphine derivatives – was chosen to illustrate this thesis. Several crystallization methods (zone melting, co-crystallization, solvent assisted crystallization and sublimation-condensation) were investigated and permitted, after optimization and combination, to obtain 99.999(9) mole % purity phenanthrene (which is above the ultrapure grade of 99.9 mole %).

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Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants organiques, ubiquistes, potentiellement toxiques et cancérigènes. Dans les sols, la dégradation des HAP est principalement due à l'activité microbienne. Certaines études ont montré que la biodégradation des HAP pouvait être augmentée dans la rhizosphère des plantes où le nombre et l'activité microbienne sont stimulés, grâce aux exsudats racinaires. Cependant les bénéfices des plantes ne sont pas toujours observés, et les exsudats pourraient aussi modifier la biodisponibilité des HAP. Les objectifs de ce travail ont été de mieux comprendre ces interactions sol-plante-microorganismes qui conditionnent le devenir des HAP dans la rhizosphère en suivant notamment (i) les bactéries possédant les gènes codant une HAP-dioxygènase, (ii) les espèces bactériennes impliquées dans la dégradation du phénanthrène, et (iii) la disponibilité et la biodégradation des HAP dans des terres industrielles historiquement contaminées.Les expériences ont été conduites dans des dispositifs à compartiments, lesquels permettent une diffusion des exsudats racinaires dans le sol tout en retenant physiquement les racines, puis en microcosmes avec un ajout d'exsudats racinaires naturels produits à partir d'une culture hydroponique de ray-grass (Lolium perenne, L). Les expériences ont été réalisées dans un premier temps avec du sable en ajoutant du phénanthrène (PHE) et un inoculum bactérien issu d'un sol d'une ancienne cokerie puis directement avec des sols historiquement contaminés en HAP. Les nombres de copies de gènes codant pour l'ADNr 16S et pour des HAP-dioxygènases ont été quantifiés par PCR en temps réel pour estimer la proportion de bactéries dégradantes. Les structures des communautés ont été comparées par électrophorèses (TTGE). En plus de l'analyse des 16 HAP totaux, une extraction non exhaustive des HAP a été réalisée à la cyclodextrine pour en estimer la disponibilité. L'utilisation de la méthode SIP (stable isotope probing) avec du 13C-phénanthrène a permis d'identifier les bactéries directement impliqués sa dégradation dans un sol historiquement contaminé. Les expériences en dispositifs à compartiments ont confirmé que la dissipation du phénanthrène est plus importante lorsque la distance aux racines est plus faible, et montrent que le nombre de copies de gène 16S et de gène de HAP-dioxygénase varie avec l'âge des plantes et du temps de contact des compartiments latéraux avec le tapis racinaire. Mais elles montrent aussi que la dissipation du phénanthrène n'est pas plus importante dans les pots plantés, tandis que dans les expériences en microcosmes une inhibition de la dissipation du PHE a même été observée en présence d'exsudats. La présence d'exsudats racinaires a profondément modifié la structure des communautés dégradant les HAP, et l'expérience SIP a permis d'identifier les bactéries directement impliquées dans la dégradation du 13C-phénanthrène et de montrer qu'elles étaient différentes en présence ou non d'exsudats. En présence d'exsudats, la proportion des bactéries dégradantes dans la population totale est passée de 1 % dans la terre d'origine et dans les traitements sans exsudats à plus de 10 %. Même si les exsudats racinaires ralentissent la dissipation du phénanthrène, en fournissant une source de carbone plus facilement métabolisable, ils ont augmenté la quantité de HAP extractibles à la cyclodextrine dans deux des trois sols historiquement contaminés, suggérant un effet de ceux-ci sur la biodisponibilité des HAP / Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) are organics pollutants, ubiquitous, toxics and potentially carcinogenic. In soil, PAH degradation is mainly attributed to microbial organism. Several studies have thus reported enhanced PAH degradation in soil in the presence of plants. Rhizospheric soil increase the number et the activity of microorganisms in soil by the release of roots exudates. However, bene?cial effects of plants in the remediation are not always observed and roots exudates could be limited PAH biodegradation. The object of this study was to investigate the fate of PAHs in rhizosphere, following (i) the PAH-dioxygenase genes DNA to quantify the PAH-degrading bacteria, (ii) species implicated in phenanthrene biodegradation, and (iii) PAH availability and biodegradation from industrial soils.Different experimental devices have been designed to study detailed processes in the rhizosphere. First is a compartments devices were a nylon mesh permits diffusion of plant soluble substances towards the adjacent root free compartment as a rhizosphere. Secondly microcosms were enriched with natural roots exudates from hydroponic culture of ray-grass (Lolium perenne L.). In first time, experiments were conducted using sand and bacterial inoculum from an industrially PAH-contaminated soil and then directly with a soil historically contaminated by PAH. The Real-Time PCR quantification of 16S rRNA gene copy and of functional PAH-RHD? genes permitted to assess the proportion of a degrading bacteria. Bacterial community structure was approached from Temporal Thermal Gradient gel Electrophoresis (TTGE) fingerprinting, and bands sequencing. Nonexhaustive cyclodextrin-based extraction technique provided a estimate of the ?labile? or available pool of PAH in soil. Use of stable isotope probing (SIP) technique with [13C]phenanthrene allowed a bacterial identification of directly implicated in industrial soil.The presence of exudates modified microbial community of PAH-degrading bacteria. SIP experiment showed that 13C-labelled PHE-degrading bacteria was different depending on the exudates input. Many species having to degrade phenanthrene were able to use exudates. Presence of root exudates increased the proportion of PAH-RHD? genes compared to the bulk soil at the beginning and in microcosms without exudates (respectively 10% and 1 %). However, phenanthene dissipation in sand or soil were weaker with root exudates and aged PAH concentrations has not shifted during incubation time. Nevertheless, the root exudates increased the PAH labile fraction extract with cyclodextrin solution into two in three soils historically contaminated

<p>In this work, a simple, less time consuming electrochemical method in the form of an electrochemical sensor has been developed for the detection of PAHs. The sensor was fabricated by the deposition of silver-gold (1:3) alloy nanoparticles (Ag-AuNPs) on ultrathin overoxidized polypyrrole (PPyox) film which formed a PPyox/Ag-AuNPs composite on glassy carbon electrode (PPyox/Ag-AuNPs/GCE). The silver-gold alloy nanoparticles deposited to form the composite were chemically prepared by simultaneous reduction of silver nitrate (AgNO3) and chloroauric acid (HAuCl4) using sodium citrate and characterized by UV-visible spectroscopy technique which confirmed the homogeneous formation of the alloy nanoparticles.</p>

Η απορρύπανση των υδάτων αποτελεί αναγκαία και καθιερωμένη από δεκαετίες πρακτική. Η απορρύπανση με τη μέθοδο της ρόφησης είναι μία από την πληθώρα των τεχνικών που εφαρμόζονται. Το περισσότερο διαδεδομένο ροφητικό υλικό είναι ο ενεργός άνθρακας, του οποίου όμως το υψηλό κόστος παραγωγής, οδήγησε την επιστημονική έρευνα στην αναζήτηση εναλλακτικών, υλικών χαμηλότερου κόστους. Για το σκοπό αυτό, το επιστημονικό ενδιαφέρον έχει στραφεί σε πολλά υλικά κυρίως οργανικής προέλευσης, αλλά και σε ανόργανα υλικά, όπως τα οξείδια των μετάλλων, τα οποία αφθονούν στη φύση. Στην παρουσα εργασία έγινε μελέτη της ροφητικής ικανότητας φυσικών οξειδίων, για τη ρόφηση αρωματικών οργανικών ενώσεων και βαρέων μετάλλων. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε ο μηχανισμός της ρόφησης του φαινανθρενίου, της 2-ναφθόλης και του υδραργύρου από οξείδια αργιλίου, τιτανίου, αργιλίου/πυριτίου και σιδήρου, με σκοπό την αξιολόγηση των υλικών αυτών ως ροφητικών υλικών και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων με αυτά της ρόφησης των αντίστοιχων ρύπων από υλικά που παρασκευάζονται από την πυρόλυση πρώτης ύλης βιολογικής προέλευσης. Για τη μελέτη της κινητικής της ρόφησης του φαινανθρενίου και της 2-ναφθόλης πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, σε θαλασσινό και γλυκό συνθετικό νερό, με διαφορετικές ποσότητες ροφητικού υλικού (χωρίς χημική επεξεργασία) και για διαφορετικό χρόνο επαφής. Από τα πειράματα αυτά μετρήθηκε η κινητική της ρόφησης καθώς και το ποσοστό απομάκρυνσης των ρύπων από το διάλυμα. Από τις μετρήσεις που έγιναν, προέκυψε ότι το ποσοστό απομάκρυνσης του φαινανθρενίου από το διάλυμα αυξάνεται αυξανομένης της ποσότητας του ροφητικού υλικού. Η σταθερά της ρόφησης Kd, κυμάνθηκε σε ένα εύρος τιμών από 1 έως 10 L/Kg, τιμές 2 έως 4 τάξεις μεγέθους μικρότερες από αυτές άλλων ροφητικών υλικών βιολογικής προέλευσης, ή προϊόντων πυρόλυσης. Τη μεγαλύτερη ικανότητα ρόφησης φαινανθρενίου επέδειξε η γ-αλούμινα με ειδική επιφάνεια 270 m2/g, με μέγιστη απομάκρυνση φαινανθρενίου το 55 % της αρχικής συγκέντρωσης έπειτα από 8 ημέρες, ενώ τη μικρότερη ικανότητα ρόφησης η γ-αλούμινα με ειδική επιφάνεια 120 m2/g, με μέγιστη απομάκρυνση το 14 % της αρχικής συγκέντρωσης, έπειτα από 10 ημέρες. Η τιτάνια, με ειδική επιφάνεια 120 m2/g, είχε ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση του 52 % της αρχικής συγκέντρωσης φαινανθρενίου, σε 8 ημέρες. Από τα πειράματα ρόφησης της 2-ναφθόλης από την γ-αλούμινα, δεν προέκυψε μετρήσιμη ρόφηση. Η ρόφηση του υδραργύρου από την γ-αλούμινα (ειδική επιφάνεια 131 m2/g), και τα οξείδια σιδήρου μελετήθηκε με πειράματα στους 25 °C, σε pH 5 και με χρόνο εξισορρόπησης τις 24 h. Από τα πειράματα προέκυψε ισόθερμη καμπύλη και έγινε προσπάθεια προσαρμογής της σε μοντέλα ρόφησης. Παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού απομάκρυνσης του υδραργύρου, με αύξηση της μάζας της γ-αλούμινας. Το μέγιστο ποσοστό απομάκρυνσης, ήταν το 93 % της αρχικής συγκέντρωσης και επιτεύχθηκε με μάζα γ-αλούμινας ίση και μεγαλύτερη από 1 g. Για τιμή Ce=15 mg/L, μετρήθηκε qe=0,91 mg/g, τιμή 1 έως 2 τάξεις μεγέθους μικρότερη από αυτές άλλων ροφητικών υλικών βιολογικής προέλευσης ή προϊόντων πυρόλυσης. Τα οξείδια σιδήρου, παρότι είχαν ειδική επιφάνεια 55 m²/g, δεν παρουσίασαν μετρήσιμη ροφητική ικανότητα για κανέναν από τους ρύπους, που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία. Συνοψίζοντας μπορούμε να πούμε ότι τα ανόργανα υλικά που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, παρόλο που παρουσιάζουν μεγάλες τιμές ειδικής επιφάνειας, δεν μπορούν να χαρακτηρισθούν ως αξιόλογα ροφητικά υλικά, τόσο για τη ρόφηση των οργανικών ρύπων φαινανθρένιο και 2-ναφθόλη, όσο και για τη ρόφηση του υδραργύρου. / Water treatment is a necessary and standard practice since decades. Adsorption technology in water treatment is one of many techniques being used. Activated carbon is the most widely applied adsorbent in water treatment, however its high production cost has led scientific research to investigate alternative low cost sorbent materials. This need has developed scientific interest towards novel materials most of them derived from biomass, but also inorganic oxides that are abundant in nature. The present study focuses on the investigation of the capacity of natural oxides to adsorb aromatic organic compounds and heavy metals. Specifically, sorption of phenanthrene, 2-naphthol and mercury onto aluminum, titanium, silicon and ferric oxides was examined, for the evaluation of these materials as sorbents, compared to pyrolized biomaterials. For the study of sorption of phenanthrene and 2-naphthol, batch experiments were conducted at room temperature, using artificial seawater and fresh water, different mass of sorbent material at different contact time. Sorption kinetics and the pollutant removal percentages were determined. The proportion of phenanthrene removal increased with the increase of the mass of the sorbent material. Sorption distribution coefficient Kd ranged between 1 and 10 L/Kg. These values are 2 to 4 orders of magnitude lower than the respective values shown for biomaterials and for pyrolysis products, respectively. Maximum sorption capacity of phenanthrene (55 % proportion removal) was shown by γ-alumina, with a specific surface area equal to 270 m2/g, after 8 days. Minimum sorption capacity (14 % proportion removal) was shown by γ-alumina, with a specific surface area equal to 120 m2/g, after 10 days. Titania, with a specific surface area equal to 120 m2/g, adsorbed a proportion of 52 % of the initial concentration of phenanthrene, after 8 days. Sorption experiments of 2-naphthol from γ-alumina, did not show a measurable sorption. Sorption of mercury from γ-alumina and ferric oxides was studied, conducting batch experiments at 25 °C, pH 5, 24 h contact time. The experiments resulted to an isotherm curve that was evaluated using different sorption isotherm models. An increase of the proportion of mercury removal, with the increase of the mass of γ-alumina was observed. Maximum proportion of mercury removal (93% of the initial concentration) was observed with the addition of γ-alumina of 1 g or more. At Ce=15 mg/L, qe=0,91 mg/g was measured. This value is 1 to 2 orders of magnitude lower, than the respective values shown for biomaterials and for pyrolysis products, respectively. Even though ferric oxides’ specific surface area was estimated at 55 m²/g, they did not show a measurable sorption capacity for any of the pollutants tested in the present study. Even though the materials examined in the present study, were of large specific surface area, their sorptive properties shown, are not competitive with the respective properties of biomaterials. Thus, they cannot be considered as promising sorbents for the removal of phenanthrene, 2-naphthol, or mercury from water.

<p>In this work, a simple, less time consuming electrochemical method in the form of an electrochemical sensor has been developed for the detection of PAHs. The sensor was fabricated by the deposition of silver-gold (1:3) alloy nanoparticles (Ag-AuNPs) on ultrathin overoxidized polypyrrole (PPyox) film which formed a PPyox/Ag-AuNPs composite on glassy carbon electrode (PPyox/Ag-AuNPs/GCE). The silver-gold alloy nanoparticles deposited to form the composite were chemically prepared by simultaneous reduction of silver nitrate (AgNO3) and chloroauric acid (HAuCl4) using sodium citrate and characterized by UV-visible spectroscopy technique which confirmed the homogeneous formation of the alloy nanoparticles.</p>

L’analyse de la composition chimique de deux orchidées de la sous-tribu des Aeridinae, Aerides rosea Lodd. ex. Lindl. & Paxton et Acampe rigida (Buch.-Ham. ex Sm.) P. F. Hunt, a été menée en ayant recours à des techniques de couplages et grâce à une stratégie de déréplication. Dix dérivés phénanthréniques ont ainsi été identifiés dans les tiges d’A. rosea, dont deux nouvellement décrits. Quatre stilbénoïdes, trois dérivés d'acides phénoliques et quatre esters d'acide cinnamique ont été identifiés dans les tiges d’A. rigida. Nous avons également effectué des dosages de traceurs dans différents échantillons de deux représentants de la tribu des Vandeae : Vanda teres (Roxb.) Lindl. et Vanda coerulea Griff. ex. Lindl., afin de mettre en évidence d’éventuelles variations de composition en fonction des facteurs environnementaux et du stade de croissance végétative. Enfin, nous avons mis au point des conditions d’isolement préparatif par chromatographie de partage centrifuge afin de purifier des marqueurs biologiques préalablement identifiés dans les tiges de Vanda teres : trois glucospyranosyloxybenzyl - malates ainsi que leur précurseur biosynthétique. / Phytochemical analyses of the composition of two orchids Aeridinae subtribe, Aerides rosea Lod . ex . Lindl . & Paxton and Acampe rigida (Buch. -Ham . Ex Sm.) P. F. Hunt were conducted using the state-of-the-art hyphenated techniques and a developed dereplication strategy. Ten phenanthrene derivatives have been identified in the stems of A. rosea, including two newly described structures. Four stilbenoids, three phenolic acids derivatives and four cinnamic acid esters were identified in the stems of A. rigida. We also performed quantitative assays of chemical tracers in different samples of two representative species from the Vandeae tribe: Vanda teres (Roxb.) Lindl. and Vanda coerulea Griff. ex. Lindl., in the aim to highlight possible variations in their composition, depending on environmental factors and vegetative growth stage. Finally, we have developed conditions for preparative isolation using centrifugal partition chromatography to purify biomarkers previously identified in the stems of Vanda teres: three glucosyloxybenzyl malates derivatives and their biosynthetic precursor.

Magister Scientiae - MSc / Polyaromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous environmental pollutants that have been shown to be teratogenic, mutagenic and carcinogenic and pose serious threats to the health of aquatic and human life. Several methods have been developed for their determination such as immunoassay, gas chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) in combination with fluorescence or absorbance detection. However, these methods are known to manifest underlying disadvantages such as complicated pretreatment, high costs and time consuming processes. In this work, a simple, less time consuming electrochemical method in the form of an electrochemical sensor has been developed for the detection of PAHs. The sensor was fabricated by the deposition of silver-gold (1:3) alloy nanoparticles (Ag-AuNPs) on ultrathin overoxidized polypyrrole (PPyox) film which formed a PPyox/Ag-AuNPs composite on glassy carbon electrode (PPyox/Ag-AuNPs/GCE). The silver-gold alloy nanoparticles deposited to form the composite were chemically prepared by simultaneous reduction of silver nitrate (AgNO3) and chloroauric acid (HAuCl4) using sodium citrate and characterized by UV-visible spectroscopy technique which confirmed the homogeneous formation of the alloy nanoparticles. Transmission electron microscopy showed that the synthesized nanoparticles were in the range of 20-50 nm. The properties of the composite formed upon deposition of the nanoparticles on the PPyox film were investigated by electrochemical methods. The PPyox/Ag-AuNPs/GCE sensor showed strong catalytic activity towards the oxidation of anthracene, phenanthrene and pyrene, and was able to simultaneously detect anthracene and phenanthrene in a binary mixture of the two. The catalytic peak currents obtained from square wave voltammetry increased linearly with anthracene, phenanthrene and pyrene concentrations in the range of 3.0 x 10-6 to 3.56 x 10-4 M,3.3 x 10-5 to 2.83 x 10-4 M, 3.3 x 10-5 to 1.66 x 10-4 M and with detection limits of 0.169 μM, 1.59 μM and 2.70 μM, respectively. The PPyox/Ag-AuNPs/GCE sensor is simple, has antifouling properties and is less time consuming with a response time of 4 s. / South Africa

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants persistants retrouvés majoritairement dans l’environnement, qui sont reconnus comme hautement toxiques pour les organismes vivants. Les nombreux travaux réalisés sur les mécanismes contrôlant l’évolution des HAP dans le sol et dans la rhizosphère ont mis en exergue le rôle majeur de la biodégradation par les microorganismes et de la sorption aux constituants du sol. Néanmoins, un manque d’informations persiste concernant le devenir de ces HAP dans le sol, et plus particulièrement leur localisation dans les compartiments du sol ainsi que la nature et le comportement des composés issus de leur dégradation. La thèse avait donc comme principaux objectifs : (a) la localisation des HAP et des produits dérivés dans les compartiments du sol (matières organiques, phases minérales, microorganismes et plante), et (b) la quantification et l’identification des composés organiques formant les résidus liés du sol. Pour cela, nous avons couplé deux approches:(i) le suivi d’un HAP modèle marqué, le 13C-phénanthrène (13C-PHE), dans un sol artificiellement contaminé planté et non planté pour notamment déterminer par IRMS et NanoSIMS la distribution du C issu du PHE dans les compartiments et pour identifier les composés dérivés du 13C-PHE par 13C-RMN et TD/pyGCMS. (ii) le suivi d’une contamination ancienne et récente en HAP dans un sol historiquement contaminé pour étudier l’influence des matières organiques et des phases minérales (séparées par un fractionnement densimétrique) dans la rétention des HAP. Plus de 40% du C issu du 13C-PHE est retenu dans le sol après 14 jours de croissance du ray-grass. L’enrichissement en 13C observé dans la plante est du même ordre que celui du sol (E13C ≈ 0.04 % at.) démontrant une incorporation homogène du 13C-PHE entre la plante et le sol. Cet enrichissement global dans la plante est confirmé par les images NanoSIMS réalisées sur les racines. Des hotspots en 13C ont également été observés dans la rhizosphère, et à partir de leur taille, leur forme et leur composition élémentaire en C, N et S ils ont été identifiés comme étant des bactéries, ce qui met en avant leur rôle dans la dynamique des HAP du sol. Dans le sol industriel, la majorité des HAP est retrouvée dans les MO non complexées aux minéraux. En revanche, les HAP fraîchement ajoutés se sont significativement liés aux associations organo-minérales composées de quartz, de feldspaths et de phyllosilicates / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are major persistent pollutants in the environment that are recognized as highly toxic to living organisms. Numerous studies were carried out on the fate of PAHs in soil and in plant rhizosphere and highlighted the major contribution of biodegradation processes and of the sorption to soil constituents. However, a lack of knowledge remains about the fate of PAHs in the soil and especially their location in soil compartments as well as the nature and the behavior of degradation products. The main objectives of the thesis were: (a) to localize PAHs and their derived products within soil compartments (organic matter, minerals, microorganisms and plant), and (b) to quantify and identify the organic compounds forming bound residues. For this purpose, we used two approaches: (i) the monitoring of a labeled PAH, the 13C-phenanthrene (13C-PHE), in a spiked soil planted or not to determine by IRMS and NanoSIMS the 13C-distribution into compartments and to identify derived compounds of 13C-PHE by 13C-RMN et TD/pyGCMS. (ii) the distribution and localization of aged and freshly spiked PAH contamination in a brownfield soil to study the impact of organic matter and minerals (using soil densimetric fractionation) in the PAH retention. More than 40% of C from 13C-PHE remained in the soil after 14 days of ryegrass growth. The 13C-enrichment in plant tissue was similarly to the soil enrichment (E13C ≈ 0.04 at.%) indicating uniform uptake of 13C-PHE between the soil and plant. NanoSIMS images acquired for roots confirmed this global enrichment in the plant. 13C-Hospots were also observed in the rhizosphere, and on the basis on their size, their shape and their elemental composition in C, N and S, they were identified as bacteria, which emphasize their contribution to the fate of PAHs in soil. In the industrial soil, most of the PAHs were found attached to the free OM. However, the freshly spiked PAHs in the soil were significantly associated with organo-mineral associations containing quartz, feldspars and phyllosilicates

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des composés ubiquitaires issus de la combustion incomplète de matières organiques. Ils sont à l'origine de pollutions de l'environnement, surtout liées à l'exploitation des produits pétroliers, car ce sont des composés toxiques pour les êtres vivants et pour l'homme en particulier. De nombreuses bactéries capables de dégrader les HAP ont été isolées et étudiées, mais celles qui les dégradent in situ sont mal connues, car moins de 5% des bactéries du sol sont cultivables en laboratoire. Le premier objectif de cette étude était d'identifier les bactéries qui dégradent les HAP dans le sol par des méthodes moléculaires indépendantes de la culture. A cette fin, une stratégie de marquage isotopique in situ a été mise en œuvre qui repose sur l'utilisation du phénanthrène, un HAP à trois cycles, dans lequel l'isotope naturel du carbone a été remplacé par le 13C. Cette molécule a été introduite comme traceur dans des microcosmes contenant du sol provenant d'un bassin de rétention des eaux de ruissellement d'autoroute. Les bactéries ayant incorporé le 13C ont ensuite été identifiées par séquençage des gènes d'ARNr 16S amplifiés à partir de l'ADN marqué extrait du sol. Les résultats montrent que des Betaprotéobactéries peu étudiées à ce jour, appartenant aux genres Acidovorax, Rhodoferax, Hydrogenophaga et Thiobacillus, ainsi que des Rhodocyclaceae, étaient les principaux acteurs de la dégradation du phénanthrène. La prépondérance des Betaprotéobactéries a été établie par des mesures de PCR quantitative. Une analyse dynamique de la diversité bactérienne a montré que celle-ci changeait en fonction de la biodisponibilité du phénanthrène. En outre, la diversité d'arène-dioxygénases impliquées dans la dégradation des HAP a été explorée sur le plan phylogénétique et fonctionnel. Nous avons ainsi détecté des séquences nouvelles, pour la plupart apparentées à des dioxygénases de Sphingomonadales et de Burkholderiales. Grâce à la construction et l'expression d'enzymes hybrides, il a été possible, pour la première fois, d'associer une activité catalytique d'oxydation des HAP à des séquences partielles de gènes, amplifiées à partir de l'ADN du sol. Les résultats obtenus et les outils mis au point dans cette étude pourront servir à développer des méthodes de diagnostic et de suivi de biodégradation de polluants, par exemple dans le cadre d'opérations de bioremédiation de sites pollués par les HAP. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous compounds produced by incomplete combustion of organic matter. They are a source of environmental pollution, especially associated to oil product exploitation, and represent a threat for living organisms including human beings because of their toxicity. Many bacteria capable of degrading PAHs have been isolated and studied. However, since less than 5% of soil bacteria can be cultivated in the laboratory, bacterial species able to degrade PAHs in situ have been poorly studied. The first goal of this study was to identify bacteria that degrade PAHs in soil using culture-independent molecular methods. To this end, a strategy known a stable isotope probing has been implemented based on the use of phenanthrene, a three rings PAH, in which the natural isotope of carbon was replaced by 13C. This molecule has been introduced as a tracer in microcosms containing soil from a constructed wetlands collecting contaminated water from highway runoff. Bacteria having incorporated the 13C were then identified by 16S rRNA gene sequence analysis after PCR amplification from labeled genomic DNA extracted from soil. The results show that so far little studied Betaproteobacteria, belonging to the genera Acidovorax, Rhodoferax, Hydrogenophaga and Thiobacillus, as well as Rhodocyclaceae, were the key players in phenanthrene degradation. Predominance of Betaprotéobactéries was established thanks to quantitative PCR measurements. A dynamic analysis of bacterial diversity also showed that the community structure of degraders depended on phenanthrene bioavailability. In addition, the phylogenetic diversity of ring-hydroxylating dioxygenases, enzymes involved in the first step of PAH degradation, has been explored. We detected new sequences, mostly related to dioxygenases from Sphingomonadales and Burkholderiales. For the first time, we were able to associate a catalytic activity for oxidation of PAHs to partial gene sequences amplified from soil DNA, by constructing hybrid enzymes and assaying their activity The results obtained and the tools implemented in this study may be used to develop methods for the diagnostic and monitoring of pollutant biodegradation in processes such as bioremediation of PAHs contaminated sites.