Freiburg (Breisgau), Universiẗat, Diss., 2005.

Universiẗat, Diss., 2002--Bielefeld.

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2008

There are multiple mechanisms by which DNA can become damaged. Such damage must be repaired for the cell to avoid ill-health consequences. Homologous recombination (HR) is a means of repairing one specific type of damage, a double-strand break (DSB). This complex pathway includes the Rad51-DNA nucleoprotein filament as its primary machinery. Current methodology for studying HR proteins includes the use of fluorescently labeled DNA to probe for HR dynamics. This technique limits the number of proteins that can be involved in experimentation, and often only works as an end reporter. The work here aims at improving upon standard techniques by creating two fluorescent protein probes. The first probe was developed by directly attaching a fluorophore to Saccharomyces cerevisiae Rad51 with the use of click chemistry and the incorporation of unnatural amino acids. This probe could function as a primary reporter on the formation and dissociation of the Rad51-DNA filament in the presence of pro- and anti- HR mediator proteins. The second probe was created by labeling the exterior cysteine residues of Plasmodium falciparum single strand DNA binding protein (SSB) with a fluorophore via maleimide chemistry. This probe acts as a secondary reporter for HR dynamics by signaling for when free single stranded DNA (ssDNA) is available.

Der erste Teil der Dissertation behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche im Honig ausgehend von der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach Einsatz als Bienenvertreibungsmittel vorliegen kann. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass der Gehalt an Phenylalanin sowie äußere Bedingungen, denen Honige ausgesetzt sind, für die Konzentration an Phenylacetaldehyd maßgebend sind. Diese Parameter müssen mindestens bekannt sein, um entscheiden zu können, ob Phenylacetaldehyd als Rückstand im Honig vorliegt. Der zweite Teil befasst sich mit der Filtration von Honig, welche in manchen Ländern durchgeführt wird, um eine Kristallisation zu herauszuzögern. Es wurde eine Methode entwickelt, um illegale Beimischungen gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen nachzuweisen. Dazu wird das Enzym Saccharase gelchromatographisch isoliert und diese Fraktion elektrophoretisch untersucht. Die Veränderung des Proteinspektrums lässt sich mit Hilfe einer densitometrischen Auswertung quantifizieren und zeigt gefilterten Honig auch in Mischungen bis zu einem Anteil von mindestens 15 % an.

Der erste Teil der Dissertation behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche im Honig ausgehend von der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach Einsatz als Bienenvertreibungsmittel vorliegen kann. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass der Gehalt an Phenylalanin sowie äußere Bedingungen, denen Honige ausgesetzt sind, für die Konzentration an Phenylacetaldehyd maßgebend sind. Diese Parameter müssen mindestens bekannt sein, um entscheiden zu können, ob Phenylacetaldehyd als Rückstand im Honig vorliegt. Der zweite Teil befasst sich mit der Filtration von Honig, welche in manchen Ländern durchgeführt wird, um eine Kristallisation zu herauszuzögern. Es wurde eine Methode entwickelt, um illegale Beimischungen gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen nachzuweisen. Dazu wird das Enzym Saccharase gelchromatographisch isoliert und diese Fraktion elektrophoretisch untersucht. Die Veränderung des Proteinspektrums lässt sich mit Hilfe einer densitometrischen Auswertung quantifizieren und zeigt gefilterten Honig auch in Mischungen bis zu einem Anteil von mindestens 15 % an.

EINLEITUNG: In der Diagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) liegt ein großes Potential hinsichtlich Diagnostik und Therapie einer Vielzahl von Erkrankungen. Gerade das radioaktive Isotop 18F eignet sich aufgrund hervorragender Zerfallseigenschaften besonders gut für die Entwicklung neuer Radiotracer für den klinischen Einsatz. Dabei haben sich Aminosäure (AS)-Tracer besonders bei der Darstellung von zerebralen Tumoren bewährt. Dies ist insbesondere auf eine erhöhte AS- Transportrate sowie eine erhöhte Proteinbiosyntheserate im Tumorgewebe zurückzuführen. ZIELE DER UNTERSUCHUNGEN: Eine große Hürde in der PET-Diagnostik besteht in der Entwicklung neuer Tracer, welche sich für den klinischen Einsatz eignen. Denn auch die Qualität von PET-Untersuchungen hängt stark von der Entwicklung selektiver PET-Tracer ab. Ziel dieser Studie war es daher, die neu entwickelten Phenylalanin (Phe)-Tracer zunächst in vitro zu evaluieren, bevor die Tracer bei erfolgsversprechenden Ergebnissen in verschiedenen subkutanen sowie orthotopen Tumormodellen in vivo eingesetzt wurden. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Entwicklung neuer Tracer für die Darstellung zerebraler Glioblastome gelegt, da diese nach wie vor meist zu einem späten Erkrankungszeitpunkt diagnostiziert werden und mit einer hohen Mortalität einhergehen. TIERE, MATERIAL UND METHODEN: Insgesamt 5 Tracer – 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe sowie α-Methyl-2-,3- und 4-[18F]FPhe – wurden hinsichtlich ihrer Bildeigenschaften im PET evaluiert. Als Referenztracer wurde jeweils der bereits etablierte Tracer [18F]Fluoroethyltyrosin ([18F]FET) eingesetzt. Zunächst wurde die prinzipielle Eignung der Tracer anhand von in vitro Zellaufnahmeversuchen an verschiedenen humanen Tumorzelllinien (MCF-7, PC-3 und U87 MG) evaluiert. Erste in vivo Versuche zur Biodistribution wurden an gesunden weiblichen und männlichen Ratten (Long Evans, je n=6) durchgeführt. Im Anschluss erfolgten Untersuchungen an einem subkutanen Tumormausmodell (männliche SCID-Mäuse, n=18) sowie einem orthotopen Gehirntumormodell an der Ratte (männliche RNU-Ratten, n=24). ERGEBNISSE: Die in vitro Traceraufnahme der evaluierten Phe-Tracer war höher oder ähnlich im Vergleich zu [18F]FET. Vor allem das AS-Transportsystem L sowie ASC waren am Transport der AS-Tracer beteiligt. Eine Proteininkorporation konnte für den Tracer 3-L-[18F]FPhe nachgewiesen werden. Insgesamt zeigten alle Tracer eine hohe metabolische Stabilität in gesunden Tieren in vivo. Die höchste Gehirnaufnahme wurde für die Tracer 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe beobachtet. Im subkutanen Tumormodell wiesen alle Tracer ähnliche Tumorbildgebungseigenschaften auf. Lediglich αM-2-[18F]FPhe zeigte in den MCF-7 Tumoren signifikant niedrigere Tumorwerte im Vergleich zu [18F]FET. Auch im orthotopen Modell war zu beobachten, dass sich die neuen Phe-Tracer nur geringgradig von [18F]FET unterschieden. Hier zeigten sich in den ersten Minuten post injectionem (p.i.) signifikant höhere Traceraufnahmen für 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe im orthotopen Glioblastom. Das Tumor/Gehirn-Verhältnis zeigte jedoch keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der untersuchten Tracer. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Insgesamt wiesen alle fünf evaluierten Tracer gute Tumorbildgebungseigenschaften auf. Die Enantiomere 3-L-[18F]FPhe und 3-D-[18F]FPhe unterschieden sich erstaunlicherweise kaum in ihrem biologischen Verhalten. Insbesondere für die Tracer 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe war eine hohe Tumortraceraufnahme zu beobachten. Alle Tracer ermöglichten eine sensitive Detektion orthotoper Glioblastome in der Ratte. Die signifikant höhere Tumoraufnahme von 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe in den ersten Minuten p.i. könnte die Scanzeiten von Gehirntumorpatienten verkürzen. Eine erhöhte Proteininkorporation zeigte keinen signifikanten Vorteil für 3-L-[18F]FPhe gegenüber [18F]FET. Insgesamt war kein klarer Vorteil gegenüber dem etablierten AS-Tracer [18F]FET zu sehen.:1. EINLEITUNG 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Prinzip der Positronen-Emissions-Tomographie 2.2 Klinische Bedeutung von Phenylalanin. 2.3 Vor- und Nachteile Aminosäure-basierter PET-Tracer 2.4 Wichtige eingesetzte PET-Tracer in der zerebralen Tumorbildgebung 2.4.1 L-[methyl-11C]methionin ([11C]MET) 2.4.2 [11C]-α-Methyl-L-Tryptophan ([11C]AMT) 2.4.3 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin ([18F]FDOPA) 2.4.4 [18F]Fluorethyltyrosin ([18F]FET) 2.5 Blut-Hirn-Schranke: Aufbau und tierartliche Unterschiede 2.5.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke 2.5.2 Transport über die Blut-Hirn-Schranke 2.5.3 Tierartliche Unterschiede 2.5.4 Einfluss von Krankheiten auf die Blut-Hirn-Schranke 2.6 Aminosäurentransporter: Charakterisierung und Vorkommen in verschiedenen Tumorarten 2.6.1 Aminosäurentransportsystem L 2.6.1.1 LAT1/SLC7A5-Transporter 2.6.2 Aminosäurentransportsystem ASC 2.6.2.1 ASCT2/SLC1A5-Transporter 2.6.3 Aminosäurentransportsystem A 3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Haltung der Versuchstiere 3.1.1 Haltung der Versuchsratten 3.1.2 Haltung der Versuchsmäuse 3.2 Anästhesie der Versuchstiere 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 3.4 Verwendete Agenzien 3.5 Herstellung der 18F-markierten Tracer 3.5.1 Physikalische Grundlagen 3.5.2 Herstellung des radioaktiven Isotops 18F 3.5.3 Aminosäuren-Tracer auf Phenylalanin-Basis 3.6 Verwendete Zelllinien 3.6.1 U87 MG Zelllinie (humanes Glioblastom) 3.6.2 MCF-7 Zelllinie (humanes Brustadenokarzinom) 3.6.3 PC-3 Zelllinie (humanes Prostataadenokarzinom) 3.7 Zellaufnahmeversuche in vitro 3.7.1 Zellkultivierung 3.7.2 Versuchsdurchführung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.7.3 Versuchsdurchführung der kompetitiven Inhibitionsstudien 3.7.4 Versuchsdurchführung der Proteininkorporation 3.7.5 Messung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.8 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.8.1 Versuchstiere 3.8.2 Versuchsaufbau 3.9 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.9.1 Versuchstiere 3.9.2 Verwendete Zelllinien 3.9.3 Versuchsaufbau 3.9.4 Diagnostische Verfahren 3.10 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.10.1 Versuchstiere 3.10.2 Verwendete Zelllinie 3.10.3 Versuchsaufbau 3.10.4 Diagnostische Verfahren 3.10.5 Transkardiale Perfusion und Gehirnentnahme nach Versuchsende 3.11 PET-Messungen 3.11.1 Rekonstruktion der PET-Bilder 3.11.2 Auswertung der PET-Bilder mit der Software VINCI 3.11.3 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.11.4 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.11.5 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.12 Statistische Auswertung 4. ERGEBNISSE 4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 4.1.1 Zelluläre Tracer-Aufnahme 4.1.2 Kompetitive Inhibitionsstudien 4.1.3 Proteininkorporation 4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 4.2.1 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.2 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.3 α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.4 α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.5 α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.6 Vergleichende Auswertung 4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 4.3.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.3.2 PET-Messungen MCF-7 Zelllinie 4.3.3 PET-Messungen PC-3 Zelllinie 4.3.4 Vergleichende Auswertung 4.3.5 Histologische Verfahren 4.4.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.4.2 MRT- und PET-Messungen 4.4.3 Vergleichende Auswertung 4.4.4 Immunhistochemie 5. DISKUSSION 5.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 5.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 5.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 5.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 5.5 Synopsis: Gegenüberstellung der untersuchten Tracer 5.6 Ausblick 6. ZUSAMMENFASSUNG 7. SUMMARY 8. REFERENZEN 8.1 Abbildungsverzeichnis 8.2 Tabellenverzeichnis 8.3 Formelverzeichnis 8.4 Literaturverzeichnis 9. ANHANG 9.1 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.1.1 PET-Bilder und TACs 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.2 PET-Bilder und TACs 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.3 PET-Bilder und TACs α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.4 PET-Bilder und TACs α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.5 PET-Bilder und TACs α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.6 PET-Bilder und TACs [18F]Fluorethyltyrosin 9.2 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 9.2.1 MRT-und PET-Bilder 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.2 MRT-und PET-Bilder 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.3 MRT-und PET-Bilder α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.4 MRT-und PET-Bilder [18F]Fluorethyltyrosin 9.3 Durchführung der histologischen Verfahren 9.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 9.3.2 Anti-LAT1(SLC7A5)-Färbung 9.3.3 Anti-ASCT2(SLC1A5)-Färbung 9.4 Statistische Auswertung 9.4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 9.4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 9.4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.4.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 10. DANKSAGUNG / INTRODUCTION: Positron emission tomography (PET) has gained great potential for the diagnosis and treatment of a wide range of diseases. The radioactive isotope 18F is particularly well suited for the development of new radiotracers for clinical use due to its excellent decay properties. Amino acids (AA) have proven particularly useful in the imaging of cerebral tumors due to an increased protein synthesis rate and AA transport rates in tumor tissue. AIMS OF THE STUDIES: A major difficulty in PET diagnostics is the development of new tracers which are suitable for clinical use. This is because the quality of PET imaging depends heavily on the development of selective PET tracers. The aim of the study was therefore to preclinically evaluate the newly developed phenylalanine (Phe) tracers. After principle suitability was seen in in vitro cellular experiments, further experiments were performed in subcutaneous as well as orthotopic tumor models in vivo. Particular attention has been paid to the development of new tracers imaging cerebral glioblastomas, as they are mostly still diagnosed late and are associated with high mortality. ANIMALS, MATERIAL AND METHODS: A total of 5 Phe-based tracers – 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe as well as α-Methyl-2-,3- and 4-[18F]FPhe – were evaluated with regard to their imaging properties in PET. The already established tracer [18F]fluoroethyltyrosine ([18F]FET) was used as reference tracer in each case. First, the principle suitability of the tracers was evaluated by in vitro cell uptake experiments on various human tumor cell lines (MCF-7, PC-3 and U87 MG). Next, in vivo biodistribution studies were carried out on healthy female and male rats (Long Evans, n=6). Subsequently, experiments with subcutaneous tumor bearing mice (male SCID mice, n=18) and an orthotopic brain tumor model in the rat (male RNU rats, n=24) were performed. RESULTS: The in vitro cellular uptake of the evaluated Phe-tracers was higher or similar compared to [18F]FET. Significant inhibition of cellular uptake was seen in blocking the AA transport systems L and ASC. Protein incorporation could be demonstrated for 3-L-[18F]FPhe. Overall, all tracers showed high in vivo metabolic stability in healthy animals. The highest brain uptake was observed for the tracers 3-L- [18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe and αM-3-[18F]FPhe. In the subcutaneous tumor model, all tracers showed similar tumor imaging properties. Only αM-2-[18F]FPhe showed significantly lower tumor levels in the MCF-7 tumors compared to [18F]FET. It was also observed in the orthotopic model that the new Phe- based tracers differed only slightly from [18F]FET. Significantly higher tracer uptakes for 3-L-[18F]FPhe as well as αM-3-[18F]FPhe were seen in the first minutes post injection (p.i.) in the orthotopic tumor. However, the tumor-to-brain-ratio showed no significant differences. CONCLUSION: All five tracers evaluated showed good tumor imaging properties. Surprisingly, the enantiomers 3-L- [18F]FPhe and 3-D-[18F]FPhe hardly differed in their biological behaviour. In particular, a high tumour tracer uptake was observed for the tracers 3-L-[18F]FPhe as well as αM-3-[18F]FPhe. All tracers enabled sensitive detection of orthotopic glioblastomas in the rat. The significantly higher tumor uptake of 3-L-[18F]FPhe and αM-3-[18F]FPhe in the first minutes p.i. could shorten the scan times of brain tumour patients. Increased protein incorporation showed no significant advantage for 3-L- [18F]FPhe over [18F]FET. In summary, no clear advantage was seen over the established AA tracer [18F]FET.:1. EINLEITUNG 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Prinzip der Positronen-Emissions-Tomographie 2.2 Klinische Bedeutung von Phenylalanin. 2.3 Vor- und Nachteile Aminosäure-basierter PET-Tracer 2.4 Wichtige eingesetzte PET-Tracer in der zerebralen Tumorbildgebung 2.4.1 L-[methyl-11C]methionin ([11C]MET) 2.4.2 [11C]-α-Methyl-L-Tryptophan ([11C]AMT) 2.4.3 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin ([18F]FDOPA) 2.4.4 [18F]Fluorethyltyrosin ([18F]FET) 2.5 Blut-Hirn-Schranke: Aufbau und tierartliche Unterschiede 2.5.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke 2.5.2 Transport über die Blut-Hirn-Schranke 2.5.3 Tierartliche Unterschiede 2.5.4 Einfluss von Krankheiten auf die Blut-Hirn-Schranke 2.6 Aminosäurentransporter: Charakterisierung und Vorkommen in verschiedenen Tumorarten 2.6.1 Aminosäurentransportsystem L 2.6.1.1 LAT1/SLC7A5-Transporter 2.6.2 Aminosäurentransportsystem ASC 2.6.2.1 ASCT2/SLC1A5-Transporter 2.6.3 Aminosäurentransportsystem A 3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Haltung der Versuchstiere 3.1.1 Haltung der Versuchsratten 3.1.2 Haltung der Versuchsmäuse 3.2 Anästhesie der Versuchstiere 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 3.4 Verwendete Agenzien 3.5 Herstellung der 18F-markierten Tracer 3.5.1 Physikalische Grundlagen 3.5.2 Herstellung des radioaktiven Isotops 18F 3.5.3 Aminosäuren-Tracer auf Phenylalanin-Basis 3.6 Verwendete Zelllinien 3.6.1 U87 MG Zelllinie (humanes Glioblastom) 3.6.2 MCF-7 Zelllinie (humanes Brustadenokarzinom) 3.6.3 PC-3 Zelllinie (humanes Prostataadenokarzinom) 3.7 Zellaufnahmeversuche in vitro 3.7.1 Zellkultivierung 3.7.2 Versuchsdurchführung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.7.3 Versuchsdurchführung der kompetitiven Inhibitionsstudien 3.7.4 Versuchsdurchführung der Proteininkorporation 3.7.5 Messung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.8 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.8.1 Versuchstiere 3.8.2 Versuchsaufbau 3.9 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.9.1 Versuchstiere 3.9.2 Verwendete Zelllinien 3.9.3 Versuchsaufbau 3.9.4 Diagnostische Verfahren 3.10 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.10.1 Versuchstiere 3.10.2 Verwendete Zelllinie 3.10.3 Versuchsaufbau 3.10.4 Diagnostische Verfahren 3.10.5 Transkardiale Perfusion und Gehirnentnahme nach Versuchsende 3.11 PET-Messungen 3.11.1 Rekonstruktion der PET-Bilder 3.11.2 Auswertung der PET-Bilder mit der Software VINCI 3.11.3 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.11.4 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.11.5 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.12 Statistische Auswertung 4. ERGEBNISSE 4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 4.1.1 Zelluläre Tracer-Aufnahme 4.1.2 Kompetitive Inhibitionsstudien 4.1.3 Proteininkorporation 4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 4.2.1 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.2 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.3 α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.4 α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.5 α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.6 Vergleichende Auswertung 4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 4.3.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.3.2 PET-Messungen MCF-7 Zelllinie 4.3.3 PET-Messungen PC-3 Zelllinie 4.3.4 Vergleichende Auswertung 4.3.5 Histologische Verfahren 4.4.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.4.2 MRT- und PET-Messungen 4.4.3 Vergleichende Auswertung 4.4.4 Immunhistochemie 5. DISKUSSION 5.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 5.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 5.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 5.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 5.5 Synopsis: Gegenüberstellung der untersuchten Tracer 5.6 Ausblick 6. ZUSAMMENFASSUNG 7. SUMMARY 8. REFERENZEN 8.1 Abbildungsverzeichnis 8.2 Tabellenverzeichnis 8.3 Formelverzeichnis 8.4 Literaturverzeichnis 9. ANHANG 9.1 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.1.1 PET-Bilder und TACs 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.2 PET-Bilder und TACs 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.3 PET-Bilder und TACs α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.4 PET-Bilder und TACs α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.5 PET-Bilder und TACs α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.6 PET-Bilder und TACs [18F]Fluorethyltyrosin 9.2 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 9.2.1 MRT-und PET-Bilder 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.2 MRT-und PET-Bilder 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.3 MRT-und PET-Bilder α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.4 MRT-und PET-Bilder [18F]Fluorethyltyrosin 9.3 Durchführung der histologischen Verfahren 9.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 9.3.2 Anti-LAT1(SLC7A5)-Färbung 9.3.3 Anti-ASCT2(SLC1A5)-Färbung 9.4 Statistische Auswertung 9.4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 9.4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 9.4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.4.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 10. DANKSAGUNG

Eine Vielzahl an Studien konnte Veränderungen dopaminerger Signale in verschiedenen Stadien von Übergewicht zeigen. Diese Veränderungen wurden mit fehlangepassten Verhaltensweisen wie zum Beispiel maladaptiven Veränderungen im Kontext von Dopamin-abhängigem Verstärkungslernen in Verbindung gebracht. Solche Verhaltensänderungen wiederum können die Entstehung und Aufrechterhaltung von Übergewicht fördern. Tierstudien lieferten erste Hinweise, dass nicht nur Übergewicht an sich, sondern auch eine Ernährung reich an gesättigten Fetten und freien Zuckern – eine der wichtigsten Triebkräfte der aktuellen Adipositas-Pandemie – unabhängig von Übergewicht zu solchen maladaptiven Veränderungen in Dopamin-abhängigem Verhalten beitragen könnte. Belastbare Erkenntnisse aus Studien am Menschen stehen hierzu noch aus. Hier setzt diese Promotionsarbeit an, die den Einfluss einer diätetischen Dopamin-Vorläufer Manipulation – der akuten diätetischen Phenylalanin/ Tyrosin Depletion (APTD) – auf das Verstärkungslernen von zwei Gruppen gesunder Frauen untersucht, die sich in der habituellen Aufnahme von gesättigten Fettsäuren und freien Zuckern unterscheiden. Ausgehend von der Annahme, dass eine Ernährung reich an gesättigten Fetten und freien Zuckern zu veränderten dopaminergen Signalen führen könnte, erwartete ich, dass Dopamin-abhängiges Verstärkungslernen in den beiden Ernährungsgruppen unterschiedlich von der APTD beeinflusst werden würde. Dazu habe ich zunächst mithilfe des Dietary Fat and Free Sugar Kurzfragebogens (DFS) die habituelle Aufnahme von gesättigten Fettsäuren und freien Zuckern von gesunden Probandinnen erhoben. Auf Basis der erreichten Punktzahl im DFS wurden die Probandinnen entweder der Gruppe mit hoher oder der Gruppe mit niedriger Fett- und Zuckeraufnahme zugeteilt. Um einen möglichen Einfluss veränderter dopaminerger Signale zu bestimmen, habe ich dann eine diätetische Phenylalanin und Tyrosin Depletion durchgeführt. Diese Methode hat eine diätetische Manipulation der Dopamin-Synthese mittels Depletion von Dopamin-Vorläufern zum Ziel. Konkret wurde in früheren Studien bereits gezeigt, dass die APTD die peripheren Konzentrationen der Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin senkt, Dopaminvorstufen welche enzymatisch in Dopamin umgewandelt werden. Demzufolge senkt die APTD potenziell zentrales Dopamin in beiden Ernährungsgruppen. Verstärkungslernen habe ich schließlich mithilfe der Probabilistischen Auswahlaufgabe (PST), gemessen. Im Ergebnis konnte ich keine direkten Anhaltspunkte für einen Einfluss der Dopamin-Manipulation in Interaktion mit Ernährungsgruppen finden. Dennoch liefert diese Promotionsarbeit wichtige Ansatzpunkte für zukünftige Studien: In einer explorativen Analyse konnte ich vorläufige Hinweise für einen Zusammenhang zwischen Variationen in Dopamin-Vorstufen und einer habituellen fett- und zuckerreichen Ernährung aufzeigen. / Many studies have found alterations in dopaminergic signaling in different stages of obesity. Such alterations have been linked to maladaptive behaviors such as maladaptive alterations in the context of dopamine-dependent reinforcement learning. These behavioral changes are likely to foster the further emergence and maintenance of obesity. Animal studies have delivered first indications, that not only obesity itself, but also a diet high in saturated fat and free sugars – one of the main drivers of the current obesity epidemic – could independently contribute to such maladaptive alterations in dopamine-dependent behaviors. However, profound evidence in human studies is pending. Addressing this issue, this thesis investigates the influence of a dietary dopamine precursor manipulation – the acute phenylalanine/tyrosine depletion (APTD) – on reinforcement learning in two groups of healthy females that differ in their habitual intake of saturated fat and free sugars. Assuming, that a diet high in saturated fat and free sugars might lead to changes in dopaminergic signaling, I expected a differential influence of APTD on dopamine-dependent reinforcement learning in the diet groups. To test this hypothesis, I firstly assessed the habitual intake of saturated fat and free sugars in healthy female participants using the Dietary Fat and Free Sugar – Short Questionnaire (DFS). According to their score, participants were assigned either to the group with a high or the group with a low habitual intake of fat and sugar. To determine the impact of possible dopaminergic alterations, I secondly administered an acute phenylalanine/tyrosine depletion. This method aims at a dietary manipulation of dopamine synthesis via manipulation of its precursors. Concretely, the APTD has been shown to significantly reduce the peripheral concentration of the amino acids phenylalanine and tyrosine, dopamine precursors that are converted to dopamine enzymatically. Thus, the APTD is likely to lower central dopamine signaling in both diet groups. Thirdly, I measured reinforcement learning with the Probabilistic Selection Task (PST). As a result, I could not find direct evidence for an influence of APTD on reinforcement learning in interaction with diet groups. Nevertheless, this thesis supplies important starting points for further investigation: In an exploratory analysis, I could reveal preliminary evidence for a positive association between variations in dopamine precursors and habitual high-fat high-sugar diet.

Für die makroskopischen Eigenschaften und Funktionen biologisch relevanter Materie spielen schwache, intra- und intermolekulare Wechselwirkungen dispersiver und elektrostatischer Natur auf molekularem Niveau eine große Rolle. Um diese schwachen Wechselwirkungen zu untersuchen, können Modellsysteme, isoliert in der Gasphase, herangezogen werden. Benzoldimer, ein schwach gebundener Van der Waals Komplex, kann beispielsweise als Modellsystem für dispersive Wechselwirkungen dienen. In der vorliegenden Arbeit werden die strukturellen Eigenschaften und die (interne) Dynamik des Benzoldimers mit Hilfe spektroskopischer Methoden in den Energiebereichen der Rotationen, Vibrationen und elektronischen Übergänge untersucht und im Kontext der Symmetrie diskutiert. Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente tragen zu einem tieferen Verständnis des Benzoldimers bei, jedoch zeigt das Experiment zur internen Dynamik auch, dass eine ausreichende theoretische Beschreibung des Benzoldimers nach wie vor eine Herausforderung darstellt. Schwingungsübergänge hochsymmetrischer Moleküle sind oft optisch inaktiv, können jedoch mit der hier vorgestellten Methode der Symmetrieerniedrigung durch Komplexierung zugänglich gemacht werden, wie am Beispiel des Benzols demonstriert wird. Außerdem wird ein Mechanismus vorgstellt, der kollisionsinduzierte Konformationsänderungen in einem Molekularstrahl beschreibt. Dieses Modell kann generell für Molekularstrahlexperimente an flexiblen Molekülen hilfreich sein, einerseits um die beobachtete Konformationsverteilung zu verstehen, andererseits um die experimentellen Parameter gezielt zu verändern und somit Konformerpopulationen zu manipulieren. Die in dieser Dissertation vorgestellten spektroskopischen Experimente liefern einerseits molekülspezifische Informationen und ermöglichen andererseits, Modelle, die von allgemeiner Bedeutung sind, zu entwickeln. / The macroscopically observable properties and functionalities of biological matter are often determined by weak intra- and intermolecular interactions on the microscopic level. Such weak interactions are for example hydrogen bonding and van der Waals interactions and can be investigated best on isolated model systems in the gas phase. The benzene dimer, for example, is a prototype system to investgate dispersive interactions. The spectroscopic experiments, covering the energy ranges of rotations, vibrations and electronic transitions, presented in this thesis, contribute to a deeper understanding of the benzene dimer. However, from the experiments investigating the internal dynamics it becomes clear that an appropriate theoretical description of the benzene dimer is still a challenge. Vibrational transitions of highly symmetric molecules, as for example of the benzene, are often optically inactive. Here, a method is presented, which exploits symmetry reduction upon complexation and thus allows one to access such modes. Furthermore, a model is proposed describing collision induced conformational interconversion in a molecular beam. This model can be helpful for molecular beam experiments of flexible molecules to understand the observed relative conformational population and to adapt the experimental conditions allowing for the manipulation of the relative conformer abundances. In this thesis, results are presented that allow one on the one hand to deduce molecular specific information and that on the other hand also give a broader insight into phenomena of general importance.