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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / During RNA Polymerase II (RNAPII) transcription, a dynamic network of protein-protein interactions (PPIs) coordinates the regulation of initiation, elongation, and termination. Taking a proteomics approach to study RNAPII transcription can offer a comprehensive view of the regulatory mechanisms mediated by PPIs within the transcription complex. However, traditional affinity purification mass spectrometry (APMS) methods have struggled to quantitatively capture many of the more dynamic, less abundant interactions within the elaborate RNAPII transcription interactome. To combat this challenge, we have developed and optimized a quantitative AP-MS based method termed Disruption-Compensation (DisCo) Network Analysis that we coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling. In this application, TMT-DisCo was applied to investigate the PPIs that regulate RNAPII transcription. In the first study, TMT-DisCo network analysis was used to analyze how perturbation of subunits of four major transcription elongation regulators —Spt6, Spt5 (DSIF), Cdc73 (PAF-Complex), and Spt16 (FACT)— affect the RNAPII PPI network. TMT-DisCo was able to measure specific alterations of RNAPII PPIs that provide insight into the normal functions of Spt6/Spt5/Cdc73/Spt16 proteins within the RNAPII elongation complex. The observed changes in the RNAPII interactome also reveal the distinct mechanisms behind the phenotypes of each perturbation. Application of TMTDisCo provides in vivo, protein-level insights into synthetic genetic interaction data and in vitro structural data, aiding in the understanding of how dynamic PPIs regulate complex processes. The second study focused on the essential RNAPII CTD phosphatases, Ssu72 and Fcp1. TMT-DisCo captures how the ssu72-2 allele affects the ability of RNAPII to proceed through elongation, resulting in more arrested RNAPII that requires proteasomal degradation. Reduction of Ssu72 phosphatase activity shifts cells away from RNAPII reinitiation/ recycling and toward de novo expression and newly assembled RNAPII, aided by chaperones. RNAPII in fcp1-1 cells was observed to increase in interaction with the 26S proteasome, as well as TFIID and mRNA capping enzyme. These data support a model of the nuclear proteasome functioning as a chaperone during transcription initiation, as the fcp1-1 allele leads to inefficient formation of a pre-initiation complex with a hyperphosphorylated RNAPII CTD. / 2024-08-16

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Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies. / Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.

La malaria, endémique dans 91 pays tropicaux et sub-tropicaux, est l’une des maladies infectieuses les plus mortelles chez l’humain. Le fardeau de cette maladie porte principalement sur l’Afrique, qui compte plus de 90% des cas d’infections ainsi que des morts enregistrés, la majorité étant des enfants en bas âge. Des cinq espèces de parasites du genre Plasmodium qui peuvent causer la maladie chez l’humain, Plasmodium falciparum est de loin la plus mortelle et la plus étudiée. La résistance aux médicaments actuels et l’absence d’un vaccin préventif procurant une immunité de longue durée démontrent l’urgent besoin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Chez les cellules eucaryotes, l’identité des organites cellulaires est définie par les phosphoinositides, des composants mineurs des membranes cellulaires, et maintenue grâce aux kinases et aux phosphatases impliquées dans leur métabolisme. Les rôles de certaines phospholipides-kinases dans plusieurs étapes critiques du cycle de vie de Plasmodium ont récemment été découverts, toutefois, rien n’est connu quant aux fonctions des phosphoinositides phosphatases de cet organisme. Les travaux décrits ci-dessous présentent une première caractérisation d’une protéine homologue à la famille des phosphoinositides phosphatases SAC1. Les résultats montrent que cette protéine est exprimée durant tout le cycle érythrocytaire asexué et qu’elle se localise au réticulum endoplasmique ainsi que potentiellement à l’appareil de Golgi. L’étude de lignées conditionnelles et knockout suggèrent qu’un niveau minimal de la protéine est nécessaire pour la survie du parasite durant le cycle érythrocytaire. En somme, la combinaison des résultats obtenus laisse penser que cette protéine pourrait avoir une fonction dans le système de sécrétion du parasite P. falciparum et qu’elle pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante pour le développement de nouveaux antimalariaux. / Malaria is endemic in 91 tropical and sub-tropical countries and is one of the deadliest infectious human diseases. Africa has the highest burden with more than 90% of cases and malaria deaths registered yearly, mostly in children under 5 years-old. Despite the fact that infection in human can be caused by five Plamsodium species, infection by Plasmodium falciparum is the most severe and therefore the most studied. Resistance to antimalarials and the absence of a preventive vaccine show the urgent need of new therapeutic targets. In eukaryotic cells, organelles identity is defined by phosphoinositides, minor membranes components, and maintained by the kinases and phosphatases involved in their metabolism. The fact that certain kinases have roles in critical steps of Plasmodium life cycle has recently been acknowledged. However, the roles of the phosphatases are still unknown. My work presents a first characterization of a putative phosphoinositide phosphatase of the SAC1 family. Results provided show that the protein is expressed throughout the asexual blood stages and that it localizes to endoplasmic reticulum and potentially to the Golgi apparatus. Studies on knockdown and knockout strains suggest that a minimal amount of the protein is required during the asexual blood stages. In summary, the combination of the results presented suggests that the protein has an important function in the parasite P. falciparum secretion system and therefore, may represent an interesting potential target for drug development.

PEF1, une phosphatase Ser/Thr dotée d'un domaine EF-hand permettant la liaison au calcium, était jusqu'ici inexploré dans les spermatozoïdes humains, des cellules qui dépendent de la régulation post-traductionnelle des protéines pour accomplir des fonctions essentielles comme la motilité, la capacitation et la réaction de l'acrosome. Ces processus sont largement influencés par le calcium (Ca$\mathsf{^{2+}}$) et la calmoduline (CaM). Cette étude visait à élucider le rôle de PPEF1 dans ces fonctions, en se basant sur l'hypothèse que PPEF1, en tant qu'interacteur de la CaM, pourrait moduler les processus spermatiques par son interaction avec le calcium. Les résultats ont démontré que PPEF1 est activée en présence de calcium et que son activité est modulée négativement par la calmoduline, suggérant des mécanismes de régulation uniques par rapport aux autres phosphatases. De plus, PPEF1 interagit avec des protéines clés comme HSPA2 et GNPDA1, connues pour leur rôle dans les interactions spermatozoïde/ovule, renforçant l'idée qu'elle pourrait réguler la fonction des spermatozoïdes. L'étude a également révélé que PPEF1 se redistribue vers l'acrosome pendant la capacitation, une étape cruciale pour la fécondation, et que son activité phosphatase diminue significativement au cours de ce processus, suggérant une régulation fine de son rôle dans la préparation des spermatozoïdes pour la fécondation. En conclusion, cette étude est la première à explorer et caractériser le rôle de PPEF1 dans la biologie des spermatozoïdes humains. Les résultats montrent que PPEF1 joue un rôle potentiel dans la régulation des processus spermatiques essentiels, tels que la capacitation, la réaction acrosomale et probablement la fécondation, via son interaction avec le calcium et la calmoduline. Ces découvertes ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre les mécanismes de la fertilité masculine et pourraient contribuer à développer des approches thérapeutiques pour les troubles de la fertilité.

L'objectif de cette thèse est de mieux comprendre la régulation de la phase M du cycle cellulaire. Nos expériences ont été effectuées dans des extraits acellulaires d’embryons de Xenopus laevis. Tout d'abord, nous montrons que le moment de l'entrée en phase M est précisément déterminé par un équilibre entre l'activité de la protéine kinase CDK1 et l’activité d’une protéine phosphatase sensible à l'acide okadaïque, PP2A. Nous montrons également le rôle de la protéine CDC6 dans la régulation de l'entrée dans la première phase M embryonnaire. En effet, CDC6 inhibe CDK1 et à travers cette action régule la dynamique de cette kinase lors de l'entrée et de la progression en phase M. Ces résultats mettent en évidence un nouveau contrôle qui précise le moment du clivage embryonnaire. Ce contrôle joue un rôle clé dans la coordination entre les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et le programme de développement de l'embryon. / The aim of this thesis is to understand better the regulation of the M-phase of the cell cycle. Experiments were done in cell-free extracts of Xenopus laevis one-cell embryos. Firstly, we show that the timing of the M-phase entry is precisely determined by a balance between the activity of CDK1 kinase and okadaic acid sensitive phosphatase, mainly PP2A. Secondly, we show the role of CDC6 protein in regulation of the entry into the first embryonic M-phase. CDC6 inhibits CDK1 and through this action regulates the dynamic of this kinase upon M-phase entry and during M-phase progression. This mechanism discovered during my PhD allows controlling precisely the timing of embryonic cleavage. This control plays a key role in coordinating the cell cycle regulating machinery and the development program of the embryo.

La protéine kinase AMPc-dépendante (PKA) joue un rôle crucial dans la régulation neurohormonale de la fonction cardiaque. L’activation aiguë de la PKA est bénéfique car elle conduit à une augmentation de la contraction cardiaque en phosphorylant les acteurs clés du couplage excitation-contraction. En revanche, son activation chronique est délétère et ces effets semblent faire intervenir la régulation de protéines nucléaires pouvant conduire au remodelage hypertrophique et à l'insuffisance cardiaque. La localisation subcellulaire de la PKA, assurée par des protéines d’ancrage (AKAPs), est importante pour la rapidité et la spécificité d’action des hormones mettant en jeu la voie de l’AMPc. Les niveaux d’AMPc sont régulés par l’activité des adénylate cyclases et des phosphodiestérases (PDEs), et l’état de phosphorylation des protéines cibles de la PKA dépend de l’activité des Ser/Thr phosphatases (PPs). Dans le cœur, les PDEs les plus importantes dégradant l’AMPc sont les PDE3 et les PDE4. Les principales PPs cardiaques sont PP1, PP2A et PP2B. Dans une première partie de mon travail, j’ai mis au point, dans les cardiomyocytes de rats adultes, une mesure de l’activité de la PKA en temps réel dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires. J’ai utilisé pour cela des sondes de type AKAR (A-kinase activity reporters) basées sur le transfert d’énergie de fluorescence (FRET) et localisées spécifiquement dans le noyau ou dans le cytoplasme par des séquences d’adressage ou d’exclusion nucléaires. J’ai ainsi pu montrer qu’une stimulation maintenue des récepteurs β-adrénergiques active la PKA de façon plus importante dans le cytoplasme que dans le noyau, et que cette activation se développe lentement au niveau nucléaire que dans le cytoplasme. De ce fait, une stimulation brève des récepteurs β-adrénergiques active maximalement la PKA dans le cytoplasme, mais de façon marginale dans le noyau. Dans une seconde partie de l’étude, je me suis intéressée au rôle des PDE3 et PDE4 ainsi qu’à celui de PP1, PP2A et PP2B dans la régulation de l’activité PKA cytoplasmique et nucléaire, en réponse à une stimulation β-adrénergique. J’ai montré que la PDE4, mais pas la PDE3, régule l’activité de la PKA cytoplasmique et nucléaire. L’utilisation de souris invalidées pour les gènes Pde4b et Pde4d a révélé que l’isoforme PDE4B est prédominante pour la modulation de l’activité PKA cytoplasmique, alors que les deux isoformes PDE4B et PDE4D contribuent à la régulation de l’activité PKA nucléaire. Finalement, j’ai montré que la PP1 et la PP2A, mais pas la PP2B, participent à la terminaison des réponses β-adrénergiques dans le cytoplasme, alors qu’au niveau nucléaire, la PP1 semble jouer un rôle majeur. En conclusion, ce travail a mis en évidence le rôle des phosphodiestérases et des phosphatases dans l’intégration différentielle des réponses PKA à une stimulation β-adrénergique dans le cytoplasme et le noyau de cardiomyocytes adultes. / The cAMP-dependent protein kinase (PKA) exerts short term beneficial effects on cardiac function by phosphorylating several key excitation-contraction coupling (ECC) proteins. However, its chronic activation is deleterious on the long term, and this may involve regulation of nuclear effectors ultimately leading to hypertrophic remodelling and heart failure. The subcellular localization of PKA, mediated by anchoring proteins (AKAPs), is important for the speed and specificity of hormones that activate the cAMP pathway. The levels of cAMP are regulated by adenylyl cyclase and phosphodiesterases (PDEs), and PKA activity is counterbalanced by Ser/Thr phosphatases (PPs). In heart, the most important PDEs that degrade cAMP belong to the PDE3 and PDE4 famillies, whereas the major cardiac PPs are PP1, PP2A and PP2B. In a first part, I developed, in adult rat cardiomyocytes, a technique to measure PKA activity in real time specifically in the cytoplasm and the nucleus. For this I used genetically-encoded fluorescence resonance energy transfer (FRET) sensors called AKAR (A-kinase activity reporters) that can be targeted specifically to the nucleus or the cytoplasm by nuclear localization or exclusion sequences, respectively. Using this approach, I showed that maintained β-adrenergic stimulation activates PKA more efficiently and more potently in the cytoplasm than in the nucleus, and that the kinetics of PKA activation was much slower in the nucleus than in the cytoplasm. Accordingly, a short β-adrenergic stimulation maximally activated PKA in the cytoplasm but marginally activated PKA in the nucleus. In a second part, I characterized the respective contribution of PDE3, PDE4, and PP1, PP2A and PP2B families in the regulation of cytoplasmic and nuclear PKA activity in response to β-adrenergic stimulation. PDE4, but not PDE3, regulates PKA activity in the cytoplasm and in the nucleus. The use of knock out mice for Pde4b and Pde4d genes revealed that PDE4B plays a predominant role to modulate β-AR stimulation of cytoplasmic PKA, whereas in the nucleus both PDE4B and PDE4D isoforms contribute. Finally, I showed that both PP1 and PP2A, but not PP2B, participate to the termination of β-adrenergic PKA responses in the cytoplasm, whereas PP1 appears to play a major role in the nuclei. In conclusion, this work highlights the role of phosphodiesterases and phosphatases in the differential integration of PKA responses to β-adrenergic stimulation in the cytoplasm and the nucleus of adult cardiomyocytes.