Les approches de métagénomique basées sur l’utilisation des techniques de séquençage haut débit ont ouvert une nouvelle ère pour la découverte non biaisée et la caractérisation génomique des virus. Comme pour les autres virus, de telles études montrent que la diversité des virus phytopathogènes a jusqu’à tout récemment été fortement sous-estimée. Ces virus constituant une composante potentiellement importante des écosystèmes naturels ou des agrosystèmes anthropisés, il est important d’explorer la diversité des virus associés aux populations végétales et de comprendre les forces structurant cette diversité dans le temps et dans l’espace. Dans le même temps, le développement de telles études reste confronté à des questions d’ordre méthodologique concernant, par exemple, le choix des populations d’acides nucléiques à séquencer, la reproductibilité des analyses ou la disponibilité d’une stratégie permettant de comparer de façon fiable la richesse virale dans différents environnements. Dans le présent travail, le virome associé à des populations végétales échantillonnées dans différents écosystèmes, avec un focus sur les adventices et les plantes sauvages, a été caractérisé par des approches de métagénomique par séquençage haut débit. Dans ces travaux, l’analyse bioinformatique de la richesse du virome a été conduite par deux approches, l’une classique basée sur l’annotation Blast pour l’identification des familles virales présentes dans un échantillon, et l’autre, décrite et validée ici, qui permet de classifier les séquences virales métagénomiques en unités taxonomiques opérationnelles (operational taxonomic units, OTUs) utilisées comme proxy des espèces virales. Toujours dans une perspective méthodologique, les résultats obtenus avec des pools complexes de plantes représentatifs de la diversité végétale au site d’échantillonnage (approche « tondeuse à gazon ») ont permis de comparer les performances des deux techniques actuellement utilisées pour enrichir les séquences virales, la purification d’ARN bicaténaires (double-stranded RNA, dsRNA) ou d’acides nucléiques associés aux virions (virion-associated nucleic acids, VANA). Les résultats obtenus par les deux approches ont mis en évidence des viromes riches mais montrent que l’approche dsRNA devrait être préférée pour l’analyse de tels pools complexes car elle permet de façon reproductible une description plus complète du phytovirome, à l’exception des virus ADN. Les viromes caractérisés montrent, pour les populations végétales de milieux cultivés ou non gérés tempérés échantillonnées, une forte incidence virale (jusqu’à 86.5% dans 126 pools monospécifiques collectés sur une période de deux ans) et confirment la prédominance des virus dsRNA qui représentent plus de 70% des OTU identifiés. Alors qu’une proportion significative des virus ssRNA détectés sont déjà connus, plus de 90% des virus dsRNA détectés sont nouveaux et n’avaient pas été caractérisés auparavant. Un effort important en culturomique visant à comparer le phytovirome avec le mycovirome de cultures fongiques obtenues à partir des mêmes échantillons végétaux a révélé un nombre remarquablement faible d’OTUs partagés, renforçant le questionnement sur la nature, phytovirus ou mycovirus, des virus dsRNA identifiés dans les viromes des plantes. La composition en OTU des viromes analysés s’est révélée variable entre sites d’échantillonnage mais aussi très dynamique dans le temps, avec seulement une très faible fraction des OTUs ré-échantillonnés de façon stable dans la même population végétale sur une période de deux ans. Pris dans leur ensemble, ces travaux exploratoires permettent de mieux raisonner les choix méthodologiques pour l’étude des viromes associés aux plantes et étendent notre connaissance de la diversité des phytovirus, en particulier dans des espèces végétales sauvages largement négligées, apportant des points de référence importants pour de nouveaux travaux en écologie et en évolution virale. / Metagenomics based on high throughput sequencing (HTS) has opened a new era of unbiased discovery and genomic characterization of viruses. As for other viruses, such metagenomic studies indicate that the diversity of plant viruses was until recently far underestimated. As potentially important components of unmanaged and cultivated ecosystems, there is a need to explore the diversity of the viruses associated with plant populations and to understand the drivers shaping their diversity in space and time. At the same time, the development of such studies is still faced by methodological questions concerning, for example, the choice of target nucleic acids populations, the reproducibility of the analyses or the implementation of a strategy to accurately compare virus richness in different environments. In the present thesis the phytovirome associated with plant populations sampled in various ecosystems, with an emphasis on wild plant or weed species was characterized using HTS-based metagenomics. In these experiments, the bioinformatic analysis of the virome complexity was performed using two strategies, a classical one based on Blast-based contigs annotation for the identification of the viral families present in a sample and a novel one, described and validated here, and which allows to classify the metagenomic viral sequences into operational taxonomic units (OTUs) as a proxy to viral species. Also from the methodological perspective, the results obtained using complex plant pools such as those used in the “lawn-mower” sampling strategy allowed to compare the performance of the two currently used viral enrichment methods, double-stranded RNA (dsRNA) or Virion-associated nucleic acids (VANA) purification. The results indicate both of approaches uncovered rich viromes and suggest that the dsRNA approach should be preferred when analyzing complex plant pools since it consistently provided a more comprehensive description of the analysed phytoviromes, with the exception of the DNA viruses. The virome characterization results obtained showed, for the temperate plant populations from unmanaged and cultivated sampling sites, a high virus incidence (up to 86.5% in 126 single species pools collected over a two-year period) and confirmed the predominance of dsRNA viruses with greater than 70% of the phytovirome OTUs. While a significant proportion of detected single-stranded RNA (ssRNA) viruses are already known agents, more than 90% of the dsRNA viruses are novel and had not previously been characterized. A large scale culturomics effort to contrast the phytovirome with the mycovirome of fungal cultures obtained from the same plant samples revealed an extremely low number of shared OTUs, further deepening the debate about the phytovirus or mycovirus nature of the dsRNA viruses identified in plant viromes. The OTU composition of the analyzed phytoviromes varied significantly between sampling sites but was also shown to be highly dynamic over time, with a very low proportion of OTUs consistently re-sampled in the same plant population over a 2 years period. Taken together, these exploratory studies allow a more reasoned choice of methodology for the study of plant-associated viromes and expand our knowledge of plant virus diversity especially in neglected wild plant populations, providing important references for the further viral ecology and evolution studies.

Les champignons sont les principaux agents pathogènes des plantes. Leur étude est donc essentielle pour contrôler les maladies et maintenir un bon rendement de production agricole. La nutrition de ces pathogènes est basée sur l'absorption de nutriments, préalablement dégradés par un arsenal d'enzymes lytiques secrétées. La sécrétion des protéines est assurée par le trafic intracellulaire mettant en jeu de nombreuses vésicules. Chez les champignons filamenteux, ces vésicules ont été visualisées en microscopie électronique mais le processus mis en jeu pour leur biogénèse n'est toujours pas élucidé. L'identification de ce mécanisme est un donc un prérequis pour comprendre la sécrétion de facteurs de virulence. Dans ce but, un mutant non pathogène altéré au niveau de l'expression du gène codant la chaine lourde de la clathrine a été sélectionné parmi une banque de mutants générés chez le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea. Le gène codant pour la chaine lourde de la clathrine est essentiel chez de nombreux organismes, ainsi un mutant dominant négatif de la chaine lourde de la clathrine a été généré et confirme la perte de pathogénicité. La caractérisation du mutant par une approche de protéomique a mis en évidence un défaut de sécrétion de 82 protéines incluant des facteurs de virulence connus. Un défaut de production de vésicules intracellulaires a également été constaté. Par ailleurs, le marquage de la clathrine à la GFP a permis de préciser sa localisation dans les cellules fongiques. Enfin, de façon surprenante, aucun défaut d'endocytose n'a été constaté au sein des mutants déficients en clathrine. Cette étude met en évidence pour la première fois le rôle essentiel de la clathrine dans le processus infectieux d'un champignon pathogène ainsi que son rôle dans a sécrétion de facteurs de virulence / Fungi are the most important plant pathogens on agricultural and horticultural crops. Study of fungal pathogens remains essential to understand pathogenic process and control plant diseases. These organisms secrete high amount of degrading enzymes involved in plant decomposition and they feed by absorption of degraded nutriments. Secretory proteins were described to be transported form Endoplasmic Reticulum and Golgi apparatus to extracellular space through intracellular vesicles. In filamentous fungi, intracellular vesicles were observed using electron microscopy but their biogenesis process is still unknown. Therefore, elucidation of the process and the identification of proteins involved in secretory vesicles biogenesis remains a challenge to understand virulence factors delivery. A nonpathogenic mutant altered in the expression of the gene coding for clathrin heavy chain was selected in a random mutant library generated in the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea,. This gene is essential in many organisms, thus a clathrin dominant negative mutant was generated and confirming the nonpathogenic phenotype observed on several host plant. In eukaryotic cells, clathrin heavy chain is mainly described to be involved in endocytosis, but it is also essential for high density secretory vesicles formation in yeast. Characterization of the mutants using a proteomic approach revealed a secretion defect of 82 proteins including known virulence factors, as Plant Cell Wall Degrading Enzymes and elicitors. Furthermore, the clathrin mutant revealed a strong reduction of intracellular vesicles production. Clathrin was also localized in living cells using fluorescent GFP-tag protein. Endocytosis was also studied and surprisingly, any observable defect was observed for clathrin mutants. This study demonstrated for the first time the essential role of clathrin in the infectious process of a fungal pathogen and its role in virulence factors secretion

Les champignons endophytes sont des microorganismes non-pathogènes impliqués dans des associations mutualistes avec les plantes. Les endophytes foliaires, en particulier, représentent un groupe très divers, mais leurs interactions avec la plante hôte et ses micro-organismes associés sont peu connues. Des travaux préliminaires initiés par notre équipe, explorant la diversité microbienne foliaire du conifère Cephalotaxus harringtonia, ont permis d’isoler la souche fongique Paraconiothyrium variabile (Ascomycota), un antagoniste du phytopathogène Fusarium oxysporum. Au cours de leur interaction, on détecte des quantités moindres de beauvéricine, une mycotoxine synthétisée par F. oxysporum. En parallèle, on observe une augmentation de la synthèse de deux oxylipines, l’acide 13-hydroperoxyoctadécadiénoïque (13-HPODE) et l’acide 13-oxo-octadécadiénoïque (13-oxo-ODE), dans la zone de confrontation. L'objectif de ce travail était de comprendre les mécanismes conduisant à la diminution de la beauvéricine au cours de l'interaction et d'explorer le rôle des oxylipines dans la régulation de cette dernière. Dans mon travail de thèse, je montre la présence de deux gènes lox chez P. variabile (pvlox1 et pvlox2) codant tous deux pour des manganèse lipoxygénases, potentiellement à l'origine des acides 13-HPODE et 13-oxo-ODE. Pvlox2 est spécifiquement induit pendant l'interaction, et ces résultats sont corroborés par une synthèse accrue de 13-HPODE chez P. variabile. Par ailleurs, l'interaction avec l’endophyte, ainsi que l'ajout de l’oxylipine 13-HPODE, régulent positivement la voie de biosynthèse de la beauvéricine, comme l’indiquent les teneurs plus élevées en mycotoxines observées chez F. oxysporum. Enfin, nous avons montré que la beauvéricine inhibait la croissance de l’endophyte, mais que ce dernier était capable de dégrader la mycotoxine, expliquant ainsi les faibles quantités de beauvericine observées initialement dans la zone de compétition. Ce travail contribue à la compréhension du rôle des oxylipines dans la communication inter-microbienne. / Endophytic fungi are non-pathogenic microorganisms involved in mutualistic associations with their host. Foliar endophytes, in particular, represent a very diverse group but little is known about their interactions with the host and its associated micro-organisms. In preliminary work, exploring the leaf microbial diversity of the conifer Cephalotaxus harringtonia, our team isolated the fungal strain Paraconiothyrium variabile (Ascomycota), an antagonist of the phytopathogen Fusarium oxysporum. During their interaction, decreased amounts of the F. oxysporum mycotoxin beauvericin, and higher amounts of the two oxylipins, 13-hydroperoxyoctadecadienoic acid (13-HPODE) and 13-oxo-octadecadienoic acid (13-oxo-ODE), were observed in the confrontation zone. The objective of the present work was to understand the mechanisms leading to beauvericin decrease during the interaction and to explore the role of oxylipins in beauvericin regulation. In my thesis work I show the presence of two lox genes in P. variabile (pvlox1 and pvlox2) coding both for manganese lipoxygenases, potentially at the origin of 13-HPODE and 13-oxo-ODE. Pvlox2 is specifically induced during the interaction, which lead to an increased synthesis of 13-HPODE in P. variabile. The endophyte itself, as well as the oxylipin 13-HPODE, up-regulated the beauvericin biosynthesis gene beas, which was paralleled by higher mycotoxin content in the mycelium of F. oxysporum. Finally, we showed that beauvericin inhibited the endophyte’s growth, but the latter was capable to degrade the mycotoxin, which explains the lower amounts of beauvericin found in the competition zone. This work presents pioneer undertaking to elucidate the role of oxylipins in inter-microbial crosstalk.

Melampsora larici-populina est un champignon pathogène responsable de la rouille foliaire sur les peupliers, causant de graves dommages dans les plantations du monde entier. Presque toutes les résistances des peupliers déployées en France ont été contournées et l'événement majeur est survenu en 1994 avec le contournement de la résistance R7 largement déployée en populiculture. Dans le but d'identifier des gènes candidats liés à la pathogénicité, j'ai mené une étude de génomique comparative basée sur le séquençage de 15 isolats. Cette analyse a mis à jour des patrons de polymorphisme corrélés à la distribution des virulences au sein des isolats tout en révélant la nécessité d'une étude populationnelle. Pour se faire, une étude de génétique des population basée sur le génotypage de 600 isolats de M. larici-populina échantillonnés de 1992 à 2012 a été conduite. Cette analyse m'a permis de décrire l'histoire démographique des populations de M. larici-populina et de documenter l'impact majeur du contournement de la R7 sur la structure des populations. Enfin, j'ai mené une analyse de génomique des populations afin d'obtenir un scenario démographique décrivant les liens historiques entre les populations et d'identifier les régions sous sélection. Cette analyse est basée sur le séquençage en Illumina de 86 isolats répartis en quatre populations clés mises en évidence par l'analyse de la structure génétique des populations. Plus de 1 000 000 positions polymorphes ont été identifiées. Un scenario fiable a été identifié par ABC à partir duquel les enveloppes de confiance des indices de génétique des populations ont été mesurées. L'analyse du génome scan qui a été réalisée sur les 86 génomes en utilisant ces mêmes indices a révélée 20 régions génomiques contenant 14 gènes candidats potentiellement impliquées dans le contournement de la R7. / Melampsora larici-populina is a pathogenic fungus responsible of poplar leaf rust, causing severe damages in plantations worldwide. Almost all poplar resistances deployed so far in France have been overcome and a major event that occurred in 1994 with the breakdown of resistance R7 mostly used in poplar cultivation. In order to identify candidate genes linked to pathogenicity, I conducted a comparative genomics study based on the sequencing of 15 isolates. This analysis revealed polymorphism patterns correlated to the distribution of virulences among isolates while the necessity of a population genetics study. I then analyzed the genetic structure of a comprehensive collection of 600 isolates of M. larici-populina sampled from 1992 to 2012. This analysis demonstrated the major impact of the R7 breakdown on populations. Finally, I conducted a population genomics analysis to obtain a demographic scenario describing the historical links between populations and to identify genomic regions under selection. This analysis is based on the Illumina sequencing of 86 isolates in four key populations identified by the population genetic analysis. Over 1,000,000 polymorphic positions were identified. The best demographic scenario was assessed using Approximate Bayesian Computation algorithms based on coalescent simulations. Using this demographic scenario, I computed the confidence interval of several population genetic indices. This genome scan analysis was performed on the 86 genomes using this same indices and revealed 20 genomic regions containing 14 genes potentially involving in the resistance 7 breakdown

Ralstonia solanacearum est une bactérie phytopathogène à la gamme d'hôte exceptionnellement large et à la répartition mondiale. Cet organisme présente une biologie à facettes multiples et s'est adapté à quasiment tous les types de sols, à la vie planctonique, et à de nombreux hôtes et plantes réservoirs. Cette capacité d'adaptation est attestée par une très forte hétérogénéité des souches qui unifient ce complexe d'espèces, aussi bien au plan de la diversité génétique, phénotypique, que de la gamme d'hôte. Des approches phylogénétiques ont montré une structuration de la population mondiale en quatre phylotypes qui correspondent globalement à l'origine géographique des souches. Les travaux de thèse portent sur des souches du phylotype II qui ont valeur de modèle expérimental car épidémiologiquement inféodées à un hôte particulier : souches Moko pathogènes du bananier, souches ‘Brown rot’ adaptées à la pomme de terre et souches émergentes NPB, un variant du pouvoir pathogène. La question de recherche centrale porte sur la compréhension des mécanismes d'adaptation à l'hôte. Pour cela, une dizaine de génomes ont été séquencés dans une perspective (i) de revisiter la taxonomie de ce complexe d'espèce, (ii) d'en faire une analyse génomique comparative et (iii) d'analyser les paysages transcriptomiques produits lors de l'infection (in planta). L'ensemble des ces approches complémentaires permettent ainsi d'intégrer la complexité génétique et phénotypique de l'organisme de manière plus systémique. / Ralstonia solanacearum is a plant pathogenic bacterium globally distributed with a particularly broad host range. This organism is biologically diverse and is adapted to all types of soil, to planktonic lifestyle and to many plant hosts and natural reservoirs. This bacterium is a species complex and its genetic, phenotypic and host range diversity is a direct consequence of adaptation mechanisms. Phylogenetic analyses have divided this species complex into four distinct phylotypes correlating mostly with strains’ geographical origin. This thesis focuses on using phylotype II strains as an experimental model due to their adaptation to specific hosts: Moko strains pathogenic to banana, ‘Brown rot’ strains adapted to potatoes and emergent pathological variant NPB strains. Our main research topic is the understanding of host adaptation processes. In order to tackle this problematic we sequenced about ten genomes as a starting point of (i) a taxonomic revision of the species complex (ii) a comparative genomic analysis and (iii) an in planta transcriptomic analysis. Together, these complementary approaches allow a more systemic view of this organism’s genetic and phenotypic complexity.

Les champignons phytopathogènes sont des parasites majeurs des espèces végétales, autant naturelles que domestiquées. Botrytis cinerea, l’agent de la pourriture grise, en infecte plus de 1400 et est ainsi considéré comme un pathogène généraliste. Pourtant, des données récentes ont mis en évidence une structure des populations liée à leur hôte d’origine. Cette observation soulève l’hypothèse d’une spécialisation à l’hôte, à l’œuvre chez une espèce généraliste. Ce modèle d’étude pourrait permettre de faire avancer la connaissance des mécanismes évolutifs en jeu dans la divergence précoce des populations et la formation de nouvelles espèces fongiques. Cette thèse de doctorat a pour objectifs : (i) de démontrer formellement la spécialisation à l’hôte dans les populations de B. cinerea et d’en déterminer la magnitude et (ii) d’identifier les déterminants génomiques de cette spécialisation. Ainsi j’ai étudié la structure des populations par l’analyse de microsatellites d’un échantillon de 683 isolats, que nous avons corrélé à des tests de pathogénicité croisés sur différents hôtes. Ces travaux ont permis de mettre en évidence la spécialisation de B. cinerea aux hôtes tomate et vigne. En complément de ces lignées sélectionnées, l’espère Botrytis cinerea est constituée d’individus généralistes capables de coloniser les autres hôtes. Des méthodes d’inférence de structure et de généalogies sur des données de polymorphisme issues du séquençage de 32 individus nous ont permis de mieux définir la structure des populations ainsi que d’identifier une lignée spécialisée à la tomate. Enfin, des tests de McDonald-Kreitman et des méthodes de scans génomiques pour détecter des balayages sélectifs ont permis de mettre en évidence des gènes soumis à la sélection divergente entre les populations spécialisées, révélant de possibles déterminants de cette spécialisation. Ces travaux sont ainsi une base pour la validation de plusieurs gènes impliqués dans la pathogénicité hôte-spécifique de B. cinerea, et ouvrent la voie à des améliorations de la gestion du réservoir d’hôtes et des pratiques culturales contre la pourriture grise. / Phytopathogenic fungi are major parasites to wild or domesticated plant species. The grey mold fungus, Botrytis cinerea, infects more than 1400 plant species and thus is considered a broad generalist. However, recent data have revealed population structure correlated to the host of origin of isolates. This observation raises the hypothesis of ongoing host specialization in a generalist species. Studying this question could greatly deepen our theoretical knowledge of the evolutionary mechanisms involved in the early stages of population divergence and subsequent speciation. This thesis aims (i) to formally demonstrate the host specialization in B. cinerea’s populations and determine its magnitude, and (ii) to identify the genomic determinants of this specialization. Thus, I studied population structure based on 683 isolates characterized using microsatellite markers. We compared the inferred genetic structure with variations in aggressiveness measured through cross-pathogenicity tests on multiple hosts. These experiments and analyses confirmed the specialization of B. cinerea to tomato and grapevine hosts. Besides these specialized lineages, the species B. cinerea is composed of generalist individuals capable of infecting multiple hosts. I sequenced the whole genome of 32 individuals and characterized nucleotide polymorphism. Structure inference and genomic genealogy methods allowed us to more accurately define the population structure and identify a lineage specialized on tomato. Lastly, McDonald-Kreitman tests and genomic scans methods allowed the identification of genes under divergent natural selection between populations, revealing possible genomic determinants of specialization. This work can serve as foundation for the validation of multiple genes involved in host-specific pathogenicity of B. cinerea, and pave the way for the implementation of efficient strategies for managing pathogen reservoirs and new agricultural practices for controlling grey mold.

Un défi important en Biologie est de comprendre comment les organismes s’adaptent à des environnements fluctuants et de déterminer l’importance relative de la plasticité phénotypique et des mutations dans cette adaptation. Nous avons examiné la réponse d’un pathogène du blé (Zymoseptoria tritici) aux fluctuations de température grâce à des approches de transcriptomique, de phénotypage (fitness relative et pathogénie) et de génomique. Pour cela, une évolution expérimentale a été menée in vitro à partir de deux clones ayant évolué dans trois régimes thermiques : à 17°C, à 23°C et en température fluctuante. Le niveau d’expression de 11% du génome a évolué de manière distincte entre les deux génotypes fondateurs en conditions de fluctuations. Nous avons également observé une plus forte densité de gènes différentiellement exprimés dans des régions connues pour être riches en éléments transposables. L’évolution en conditions fluctuantes a favorisé la robustesse du transcriptome. La fitness relative estimée dans les conditions d’évolution a augmenté uniquement pour les lignées fluctuantes issues d’un des deux génotypes fondateurs. La différence de croissance entre les deux ancêtres en conditions de fluctuations et leur différent niveau de plasticité d’expression pourraient expliquer ces résultats différents. Enfin, nous avons observé : i). des pertes de pathogénie in planta suite à l’évolution à 17°C et en fluctuations, ii). aucune perte de chromosomes accessoires, iii). de nombreuses mutations dans le génome, dont des mutations codantes dans des effecteurs. Ces travaux apportent de nombreux éléments de compréhension des mécanismes évolutifs et moléculaires sous-jacents à l’évolution de Z. tritici dans des environnements variables. / An important challenge in Biology is to understand how organisms adapt to fluctuating environments and to determine the relative significance of phenotypic plasticity and mutations in this adaptation. We examined the response of a wheat pathogen (Zymoseptoria tritici) to temperature fluctuations using transcriptomics, phenotyping (relative fitness and disease level) and genomics. With this goal, we conducted an in vitro experimental evolution from two Z. tritici clones that evolved in three thermal conditions: at 17°C, at 23°C and under temperature fluctuations. Expression level of 11% of the genome evolved in a different way between the two founder genotypes that evolved under fluctuating conditions. We also observed a higher density of differentially expressed genes in regions known to be enriched in transposable elements. Evolution under fluctuating selection promoted robustness of the transcriptome. The relative fitness estimated in the same conditions as for the experimental evolution did increase for fluctuating lineages only for one of the founder genotypes. The difference of growth between the two ancestors in fluctuating conditions and their distinct level of expression plasticity could explain these opposite results. Finally we observed: i). in planta pathogenicity losses for lineages evolved at 17°C or under fluctuations ii). no accessory chromosome loss, iii). many de novo mutations, including coding mutations in effector genes. This work contributes to shade light on the evolutionary and molecular mechanisms underlying the evolution of Z. tritici in variable environments.

Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 possèdent une structure mosaïque avec de nombreuses régions conservées. Des dérivés du plasmide pSci2 ont été produits par délétions successives et leur capacité de réplication a été évaluée. Le plus petit réplicon obtenu ne contient plus qu’une CDS (pE) et ses régions flanquantes. L’inactivation dans un vecteur navette du gène pE est suffisante pour abolir la réplication de ce plasmide dans S. citri. Des dérivés des pSci ont été introduits efficacement dans S. kunkelii et S. phoeniceum, deux spiroplasmes phytopathogènes pour lesquels aucun outil génétique n’était disponible jusqu’à présent. La stabilité des dérivés des pSci a également été évaluée par leur capacité à persister en l’absence de pression de sélection. L’instabilité ségrégationnelle des plasmides dans lesquels soj a été délété ou inactivé indique que la protéine de partition Soj/ParA est essentielle au maintien des plasmides pSci. L’incompatibilité sélective entre un plasmide pSci et ses dérivés a été exploitée pour produire une collection de souches possédant des profils plasmidiques différents. L’analyse des phénotypes d’acquisition et de transmission de plusieurs de ces mutants suggère que la CDS traG portée par le pSci6 est essentielle à la transmission de S. citri GII3. En revanche, les plasmides pSci1-5, codant les protéines adhésine-like ScARPs, ne sont indispensables ni à l’acquisition ni à la transmission. Dans le cadre de ce travail, plusieurs outils génétiques ont été adaptés aux mollicutes. Le promoteur Pxyl/tetO2 a été utilisé pour contrôler l’expression du gène de la spiraline chez S. citri et M. agalactiae. Enfin, un système de linéarisation de plasmide in vivo basé sur l’expression de l’endonucléase I-SceI a été utilisé pour l’élimination de plasmides pSci chez S. citri. / Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 display a mosaic gene organization with highly conserved regions. Through successive deletions, various pSci2 derivatives were constructed and assessed for their ability to replicate. The smallest functional replicon consists of one single CDS (pE) and its flanking, intergenic regions. Furthermore, shuttle (S. citri/E. coli) plasmids, in which the pE gene was disrupted, failed to replicate in S. citri, suggesting that PE is the replication protein. S. citri plasmids were efficiently introduced into S. kunkelii and S. phoeniceum, two plant pathogenic spiroplasmas, the transformation of which had never been described before. Studying stability of various pSci-derived plasmids in the absence of selection pressure strongly suggests the occurrence of an active partition system involving the soj-like gene. Selective incompatibility between a given pSci plasmid and its derivatives was used to remove plasmids from the wild-type strain. As a result, a collection of S. citri GII3 mutants differing in their plasmid contents was produced. Experimental transmission of these mutants through injection to or ingestion by the leafhopper vector will provide new insights into the role of plasmid encoded determinants in the biology of S. citri. First data indicated that pSci6 traG is required for insect transmission of S. citri GII3. In contrast, pSci1-5, encoding adhesin-like proteins, are not essential for both transmission and acquisition. In the frame of this work, new genetic tools have been adapted for use in mollicutes. The tetracycline inducible promoter, Pxyl/tetO2, was used to control spiraline gene in S. citri and M. agalactiae. Also, an in vivo linearization system based on the expression of the I-SceI-endonuclease was used to remove pSci plasmids from S. citri.

Pour lutter contre les agents phytopathogènes, la sélection de plantes résistantes est la stratégie la plus rentable et la plus écologique. Les résistances quantitatives, basées sur des mécanismes de résistances complexes, sont connues pour être sujettes à l’érosion, en cas d’évolution de l’agressivité des agents pathogènes. L’objectif de ce travail basé sur le pathosystème peuplier – rouille du peuplier (Melampsora larici-populina) est d’évaluer le potentiel évolutif des caractères d’agressivité et morphologiques du parasite par des approches de génétique quantitative et d'identifier les bases génétiques par génétique d'association. Pour estimer la plasticité, l’héritabilité et les compromis évolutifs d’un ensemble de caractères quantitatifs, nous avons précisément mesuré leurs variations dans quatre populations contrastées du champignon. Nous avons montré que le volume des spores est un caractère héritable qui évolue rapidement. La quantité de mycélium in planta est aussi héritable mais très conservée car sous sélection stabilisante dans les populations étudiées. Le temps de latence, la taille des lésions et le taux de sporulation présentent une héritabilité faible, ce qui explique l’absence d’évolution observées au cours du temps pour ces trois caractères. Les caractères liés à la fonction de sporulation semblent être les plus plastiques le long d’un gradient de maturité foliaire. Cependant, l’absence de mise en évidence de compromis évolutifs ne nous a pas permis d’identifier des caractères d’agressivité qui seraient les meilleures cibles pour les résistances quantitatives chez le peuplier. Si aucune base génétique de ces caractères quantitatifs n’a été mise en évidence, nous avons localisé un locus d’avirulence potentiel (Avr7) sur lequel une caractérisation fonctionnelle est envisagée / To control plant pathogens, breeding resistant plants is the most cost-effective and ecological strategy. Quantitative resistances, which are based on complex plant mechanisms, are known to be exposed to erosion through an increase of pathogens aggressiveness. Through the study the poplar – poplar rust (Melampsora larici-populina) pathosystem, this work aims to estimate the evolutionary potential of aggressiveness and morphological traits using quantitative genetic approaches and to identify molecular bases through genome-wide association study. To estimate plasticity, heritability, and trade-offs for a set of quantitative traits, we precisely measured their variation in four contrasted pathogen populations. It appeared that spore volume is highly heritable and evolved rapidly. In planta mycelium quantity is also heritable but constant because of stabilizing selection occurring in the studied populations. Latent period, lesion size and sporulation rate exhibit low heritability, which explains the absence of evolution during the studied time period. Traits involved in the sporulating function seem to be the most plastic ones along a leaf maturity gradient. However, the lack of evidence of trade-offs did not allow us to identify aggressiveness traits that would be the best targets for the construction of durable resistance in poplar. No genetic underpinning has been found for quantitative traits, but we have identified a potential avirulence locus (Avr7), opening the way for its functional characterization

Les bactéries pathogènes coordonnent de manière très stricte l’expression de leurs facteurs de virulence en fonction de leur état métabolique, des conditions externes et de l’état de l’hôte. La topologie du chromosome bactérien est également modulée par les conditions environnementales et l’état métabolique des cellules. Le surenroulement de l’ADN, est considéré désormais comme un élément clé de la régulation de l’expression génique. L’objectif de cette thèse est d’identifier les acteurs essentiels de la réponse aux conditions rencontrées durant l’infection chez la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii, responsable de la pourriture molle d’une large gamme d’hôtes. Les symptômes de pourriture molle sont principalement associés à la synthèse d'enzymes extracellulaires, en particulier les pectinases qui vont dégrader la paroi des cellules végétales. Cependant une colonisation efficace de la plante requiert de nombreux facteurs additionnels. L’analyse du transcriptome de D. dadantii dans 32 conditions de culture proches de celles rencontrées lors du cycle infectieux a révélé qu’en moyenne 63% des gènes sont exprimés dans chacune des conditions testées alors que 82% des gènes sont exprimés dans au moins une des conditions analysées. Deux facteurs modifient profondément l’expression génique: la phase de croissance et la nature des stress appliqués. L’analyse des gènes différentiellement exprimés a permis d’établir des signatures transcriptionnelles et fonctionnelles spécifiques de chaque stress et d’identifier de nouveaux régulateurs potentiellement impliqués dans la survie aux stress. L’adaptation au stress acide étant peu connue chez les pathogènes de plante, la régulation de quelques gènes spécifiquement induits en stress acide a été approfondie. Ces études ont révélé que le régulateur OmpR est un élèment clé de la réponse au stress acide chez Dickeya. Afin d’établir un lien entre réponse aux stress et impact de la topologie de l’ADN et des NAPs, les profils transcriptionnels obtenus lors des stress ont été comparés à ceux obtenus dans des conditions de relaxation artificielle de l’ADN et chez des mutants fis ou hns. La distribution chromosomique des GDE a révélé des profils cohérents de gènes activés ou réprimés lors des variations de conditions environnementales quelque soit le milieu de culture utilisé et l’existence de patchs d’expression qui illustre l’organisation en domaines du chromosome bactérien.L’expression des gènes au sein des domaines est dépendante de leur propriété thermodynamique, de leur préférence vis à vis du surenroulement, et de leur réponse aux NAPs. Ainsi, Dickeya tire partie des variations topologiques de l’ADN au cours de l’infection pour coordonner son programme de virulence. Ces résultats illustrent la complexité des processus utilisés par D. dadantii pour s’adapter aux conditions de l’infection et coloniser ses hôtes. / Pathogenic bacteria strictly coordinate the expression of their virulence factors according to their metabolic states, external conditions and the host environment. The topology of the bacterial chromosome is also modulated by environmental conditions and the metabolic state of the cells. The DNA supercoiling is now considered as a key factor in the regulation of gene expression. The objective of this thesis is to provide a comprehensive picture of the Dickeya infection process by integrated analyses of gene expression patterns obtained under various stress conditions encountered by this pathogen in the course of infection. Dickeya dadantii is a plant pathogenic bacterium that causes soft-rot disease in a wide range of plant species. Soft rot symptoms are mainly associated with the synthesis of extracellular enzymes, particularly pectinases which degrade the plant cell wall. However, an effective colonization of the plant requires a number of additional factors. The transcriptome analysis of D. dadantii, grown in a suite of thirty-two different growth conditions similar to those conditions encountered during the infection cycle revealed that an average of 63% of genes was expressed in each individual condition, while 82% of genes are expressed in at least one of the analyzed conditions. Two factors profoundly alter gene expression: the growth phase and the nature of applied stress. Analysis of differentially expressed genes in this work has established specific transcriptional and functional signatures of each stress and proposed new regulators potentially involved in survival under stress conditions. In this way, we obtained the apparent « temporal map » of the bacterial responses to sequential stress conditions encountered during the infection. The chromosomal distribution of DEG revealed coherent patches of genes activated or repressed during changes in environmental conditions and highlighted a rational organization of the DEG in the chromosomal space. Gene expression within the chromosomal domains is dependent on primary sequence organisation, DNA thermodynamic stability, supercoil dynamics, and binding effects of two abundant nucleoid associated proteins, FIS and H-NS. Therefore, Dickeya takes advantage of DNA topological variations during the infection to coordinate its virulence program. These results illustrate the complexity of mechanisms used by D. dadantii to adapt to stress conditions and colonize its hosts.