• Refine Query
  • Source
  • Publication year
  • to
  • Language
  • 82
  • 66
  • 10
  • 8
  • 7
  • 4
  • 4
  • 3
  • 3
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 1
  • 1
  • Tagged with
  • 230
  • 230
  • 53
  • 47
  • 36
  • 30
  • 29
  • 25
  • 24
  • 24
  • 20
  • 18
  • 18
  • 17
  • 16
  • About
  • The Global ETD Search service is a free service for researchers to find electronic theses and dissertations. This service is provided by the Networked Digital Library of Theses and Dissertations.
    Our metadata is collected from universities around the world. If you manage a university/consortium/country archive and want to be added, details can be found on the NDLTD website.
11

Transcription profiling of pectinase genes in Lentinula edodes and their heterologous expression in Pichia pastoris.

January 2011 (has links)
Xing, Lei. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 111-120). / Abstracts in English and Chinese. / ABSTRACT OF THESIS ENTITLED: --- p.I / 論文摘要 --- p.Ill / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.IV / ABBREVIATIONS --- p.V / CONTENTS --- p.VI / LIST OF FIGURES --- p.X / LIST OF TABLES --- p.XII / Chapter CHAPTER 1: --- LITERATURE REVIEW --- p.1 / Chapter 1.1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Pectic substances --- p.1 / Chapter 1.1.2 --- Structure and classification of pectins --- p.2 / Chapter 1.1.3 --- Classification of pectinases --- p.4 / Chapter 1.1.4 --- Application of pectinases --- p.5 / Chapter 1.1.5 --- Production of pectinases --- p.5 / Chapter 1.2 --- Lentinula edodes as a source of pectinolytic enzymes --- p.12 / Chapter 1.2.1 --- Taxonomy and Life cycle of L. edodes --- p.12 / Chapter 1.2.2 --- Pectin-degrading enzymes in L edodes --- p.13 / Chapter 1.3 --- Expression systems for fungal pectinolytic enzymes --- p.16 / Chapter 1.4 --- Gene expression analysis --- p.19 / Chapter 1.5 --- Objectives and Long-term significance --- p.20 / Chapter CHAPTER 2: P --- EGTINASES IN L. EDODES --- p.23 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.23 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.25 / Chapter 2.2.1 --- Fungal strains and growth conditions --- p.25 / Chapter 2.3.2 --- Gene models --- p.25 / Chapter 2.2.4 --- Enzyme activity assays --- p.26 / Chapter 2.3 --- Results --- p.30 / Chapter 2.3.1 --- Alignment of 24 candidate pectin-degradation gene models --- p.30 / Chapter 2.3.2 --- Conserved domains in protein sequences of 24 gene models --- p.30 / Chapter 2.3.3 --- Signal Peptide prediction of pectin-degradation gene models --- p.30 / Chapter 2.3.4 --- Pectinases activities in L. edodes --- p.31 / Chapter 2.3.5 --- Growth of mycelia of L. edodes on pectin and non-pectin media --- p.31 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.48 / Chapter 2.4.1 --- Elimination of non-pectinolytic genes --- p.48 / Chapter 2.4.2 --- Conserved domains and active sites of 6 polygalacturonases --- p.49 / Chapter 2.4.3 --- Pectinases activities in L. edodes --- p.49 / Chapter 2.4.4 --- Effect of pectin on the growth of mycelia in L. edodes --- p.50 / Chapter 2.5 --- Conclusion --- p.51 / Chapter CHAPTER 3: --- TRANSCRIPTIONAL PROFILING OF PECTINASES GENES IN L. EDODES --- p.52 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.52 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.57 / Chapter 3.2.2 --- Strain cultivation --- p.57 / Chapter 3.2.3 --- RNA extraction and first strand cDNA synthesis --- p.58 / Chapter 3.2.4 --- Quantitative RT-PCR --- p.58 / Chapter 3.2.5 --- Data analysis --- p.59 / Chapter 3.3 --- Results --- p.62 / Chapter 3.3.2 --- RNA quality of various samples in L. edodes --- p.62 / Chapter 3.3.3 --- Transcription of 14 putative pectinases genes --- p.62 / Chapter 3.3.4 --- Transcription profiling of pectinases genes during the development of L. edodes --- p.62 / Chapter 3.3.5 --- Transcriptional levels of pectinases genes in mycelia of L. edodes grown in different media --- p.63 / Chapter 3.4 --- Discussions --- p.73 / Chapter 3.4.2 --- Transcription profiling of pectinases genes in L. edodes during four developmental stages --- p.73 / Chapter 3.4.3 --- Differential transcriptional levels of pectinases genes in L. edodes mycelia grown in two media --- p.73 / Chapter 3.4.4 --- Effect of pectic substrates on the pectinases genes transcription in mycelia of L. edodes --- p.74 / Chapter 3.5 --- Conclusion --- p.76 / Chapter CHAPTER 4: --- CLONING OF PECTINASES GENES AND THEIR HETEROLOGOUS EXPRESSION IN PICHIA PASTORIS --- p.77 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.77 / Chapter 4.2 --- Materials and methods --- p.79 / Chapter 4.2.2 --- Strain cultivation --- p.79 / Chapter 4.2.3 --- RNA extraction and first strand cDNA synthesis --- p.79 / Chapter 4.2.4 --- Cloning and sequencing of pectinases genes --- p.80 / Chapter 4.2.5 --- Subcloning and expression vector construction --- p.80 / Chapter 4.2.6 --- Growth of Pichia pastoris strains --- p.81 / Chapter 4.2.7 --- Transformation into P. pastoris and vivo screening of multiple inserts --- p.81 / Chapter 4.2.8 --- Expression of recombinant P. pastoris strains --- p.82 / Chapter 4.2.9 --- RNA extraction and transcription analysis of pectinases genes in recombinant Pichia strains --- p.83 / Chapter 4.2.10 --- Enzyme activity assays --- p.83 / Chapter 4.2.11 --- SDS-PAGE --- p.84 / Chapter 4.3 --- Results --- p.88 / Chapter 4.3.2 --- RT-PCR for full-length cDNA of 13 pectinases genes --- p.88 / Chapter 4.3.3 --- Cloning and sequences analysis of 4 putative pectinases genes --- p.88 / Chapter 4.3.4 --- Construction of expression vectors of pectinases genes and transformation to P. pastoris --- p.88 / Chapter 4.3.5 --- Screening of multiple inserts clones --- p.88 / Chapter 4.3.6 --- Recombination and integration of pectinases genes in P. pastoris --- p.89 / Chapter 4.3.7 --- Transcription and expression of pectinases genes in recombinant Pichia strains. --- p.89 / Chapter 4.4 --- Discussion --- p.104 / Chapter 4.4.2 --- cDNA sequences of 4 pectinases genes --- p.104 / Chapter 4.4.3 --- Heterologous expression of 2 pectinases genes in P. pastoris --- p.104 / Chapter 4.4.4 --- Characterization of the pectinases expressed by recombinant Pichia strains --- p.106 / Chapter 4.5 --- Conclusion --- p.108 / Chapter CHAPTER 5: --- CONCLUDING REMARKS --- p.109 / REFERENCES --- p.121
12

Monitorització i control del procés de producció de proteïnes heteròlogues en el llevat metilotròfic Pichia Pastoris

Cos Busquets, Oriol 16 September 2005 (has links)
Aquest treball es centra en la investigació sobre la producció de proteïnes heteròlogues en el llevat metilotròfic Pichia Pastoris. El principal avantatge de la utilització d'aquest sistema d'expressió és l'existència del promotor d'alcohol oxidasa, un dels més eficaços i fortament regulats per la presència de metanol com a única font de carboni. El gen hoste emprat és la lipasa del fong Rhizopus oryzae, proteïna d'elevat interès industrial i biotecnològic per les seves nombroses i variades aplicacions.De quatre tipus de soques diferents, dos parelles de diferent fenotip (Mut+ i Muts) i dins el mateix fenotip amb una o vàries còpies del gen hoste, s'ha seleccionat la soca més adient, en aquest cas Muts singlecopy, per una posterior explotació en cultiu semicontinu segons criteris de productivitat i dinàmica de creixement.S'ha observat que un dels problemes que presenta aquest tipus de cultiu és la reproductibilitat i el control de la concentració de metanol que s'aconsella no superar els nivells considerats com a tòxics de 10 g·l-1. Diferents mesures com l'anàlisi de la composició dels gasos de sortida del fermentador, l'extracció automàtica de mostres i la gestió de tota la informació del cultiu des de un programari dissenyat específicament, milloren significativament el seguiment i el control del cultiu. La disponibilitat de noves mesures del cultiu permeten estimar variables d'estat com la biomassa i la velocitat específica de creixement que són molt útils per conèixer el estat fisiològic del microorganisme.Per aconseguir mantenir estable la concentració de substrat inductor s'ha proposat utilitzar un llaç de control en retroalimentació començant pels sistemes de control més clàssics basats en l'error. La dinàmica canviant del sistema i el temps mort també variable fa que controls de tipus "on-off" i Proporciona Integral no siguin adients per mantenir prou estable la concentració de substrat. Com alternativa, s'ha implementat amb èxit un controlador predictiu basat en model que s'adapta contínuament al consum canviant de substrat inductor.Utilitzant de forma conjunta totes les millores instrumentals i de control del procés s'ha observat la influència que té la concentració de metanol sobre la producció de proteïna. D'aquest estudi se'n dedueix que mantenir la concentració a 1 g·l-1 durant el cultiu pot augmentar de forma significativa la productivitat. Paral·lelament es defineix que per maximitzar la productivitat la durada del cultiu ha de ser al voltant de les 80- 90h.Es pot afirmar que la instal·lació d'instrumentació juntament amb l'estimació, modelització i control d'algunes de les variables principals del cultiu, són mesures que permeten millorar la producció extracel·lular de proteïnes heteròlogues en Pichia Pastoris. / In this work the production of heterologous proteins by the methilotrophic yeast Pichia Pastoris has been studied. The main advantage of this expression system is the existence of a strong and tightly regulated (methanol-inducible) promoter from the alcohol oxidase gene (PAOX1).Using a battery of four strains, which secrete a Rhizophus oryzae lipase (ROL), the combined effects of gene dosage and Mut phenotype on recombinant protein production by P. pastoris were observed in fed-batch cultures. This study concludes that the use of Muts ROL single copy strain is advantageous because it allows easier process control strategies with high productivity.One of the main problems of these cultures is the low reproducibility and the need of accurate control of the methanol concentration in the fermentation to maintain it below toxic limits, 10 g·l-1. The implementation of exhaust gas analyzer, an autosampler system and specific software to on-line administrate the culture information improved significantly the control of the bioprocess.With several of these on-line measures it has been implemented an estimation algorithm that allows to determine both the specific growth rate of the microorganism and biomass concentration, used as physiologic indicators.To control the methanol concentration at an optimal set-point level during the cultivation, a feedback control using different error based controllers has been implemented. The use of on-off and PI (Proportional Integral) controllers is not recommended due to the dynamics of the biological system and the large death time of the system. As alternative, a predictive control algorithm based on the on-line estimation of the methanol rate has been successfully implemented.The improvement of the instrumentation and control of the bioprocess has provided the tools for the study of the influence of the methanol concentration on protein production. It has been observed that if the methanol concentration is maintained at 1 g·l-1 productivity increase about 140% is produced. Moreover, it suggested that to maximize the productivity of the system, the duration of the fed-batch fermentation should be around 80-90 h.The implementation of new instrumentation jointly with the use of software sensors, the modeling of the bioprocess, and the control of some of the fermentation variables significantly improved the production of the extracellular heterologous Rhizopus oryzae lipase by the yeast Pichia pastoris.
13

Estratègies d'operació en el procés de producció de proteïnes heteròlogues en Pichia pastoris: aplicació de tècniques de monitorització i control

Ramon Real, Ramon 27 March 2007 (has links)
El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris. Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.Paraules clauDiscontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS / El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris. Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.Palabras ClaveDiscontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS / The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins. Key wordsFed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.
14

Millora en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris mitjançant tècniques de monitoratge i estratègies de cultiu alternatives

Surribas i Casalprim, Anna 30 January 2009 (has links)
En aquest treball s'exposen dues línies de recerca centrades en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) en Pichia pastoris: la utilització de diferents tècniques de monitoratge i l'aplicació d'estratègies de cultiu que permetin millorar la producció de la ROL en una soca Mut+ d'aquest sistema d'expressió. En els cultius discontinus alimentats amb P. pastoris cal disposar d'una mesura en línia i en temps real de la concentració de substrat, el metanol. Per això es va desenvolupar un analitzador d'injecció seqüencial. Es va comprovar que aquest té una freqüència d'anàlisi òptima per a cultius amb la soca Muts però baixa per a la soca Mut+. Amb aquesta última soca, es van utilitzar i comparar dos mesuradors comercials en fase gas. Es va avaluar també la fluorimetria com a tècnica de monitoratge per a la determinació de tres variables clau: la biomassa, el substrat (glicerol/metanol) i la proteïna recombinant.Inicialment es va fer un seguiment de l'evolució de la biomassa a partir del senyal de fluorescència off-line del triptòfan. Es pot predir la biomassa correctament però es van evidenciar diferents desavantatges: la necessitat de dilució de les mostres i d'un sistema de presa de mostra específic. Per això es va decidir aplicar i avaluar la fluorimetria multivariable in situ. Amb la utilització d'una sonda fluorimètrica in situ, combinada amb mètodes quimiomètrics de tractament de dades multivariables, es va aconseguir predir la biomassa i el substrat a partir de la determinació del senyal de diversos fluoròfors. No es va aconseguir una bona predicció de la producció de ROL. Per millorar el seguiment de la proteïna, es va fusionar a la GFP. Es van detectar dos inconvenients: els nivells de producció disminuïen respecte a la producció de ROL únicament i la riboflavina, que Pichia excreta al medi, interferia amb el senyal de fluorescència del mutant de GFP escollit. Tant amb la filtració de la mostra abans de la determinació del senyal de GFP com si s'hagués escollit un mutant de GFP amb emissió més allunyada de la riboflavina es podria haver evitat aquest inconvenient i fer un seguiment de la ROL excretada. Es pot seguir la ROL intracel·lular.Quant a la producció de la ROL, es va estudiar l'efecte del nivell de metanol residual en cultius discontinus alimentats amb la soca Mut+. Existeix una concentració òptima entorn els 2.5 g·l-1 de metanol al medi. A concentracions superiors es va apreciar inhibició per substrat. Es va observar un fenomen de limitació per transferència d'oxigen al final del cultiu i una important disminució de la viabilitat cel·lular.Per això, es van avaluar estratègies de cultiu alternatives. Primer es va aplicar una estratègia de metanol limitant (MLFB) per evitar la limitació d'oxigen al final d'un cultiu a 2.5 g·l-1 de metanol residual (MNLFB). Es va millorar la productivitat un 40%. En segon lloc, es va aplicar una estratègia de temperatura limitant per avaluar el seu efecte sobre la producció. No es van millorar els resultats. Finalment, es va aplicar una estratègia MNLFB a 2.5 g·l-1 de metanol però amb un medi amb una menor osmolaritat i una fase final amb limitació de temperatura per evitar la limitació d'oxigen. Es va aconseguir reduir la mortalitat cel·lular però la productivitat disminuïa respecte el cultiu on s'aplica una fase de MLFB al final de la inducció. Tot i això, es va obtenir un producte final un 30% més pur en quant a activitat lipolítica respecte la proteïna total. Posteriorment es va procedir a escalar la producció en planta pilot. Es va observar limitació en la transferència d'oxigen en fases inicials de la inducció. Això va originar l'aparició d'un subproducte, associat a una reducció en la producció de ROL extracel·lular. En millorar la transferència d'oxigen es va minimitzar aquesta limitació i va millorar la producció. No es van aconseguir els mateixos nivells de productivitat que a escala laboratori però es continua treballant en la millora de la transferència de matèria per assolir-los. / In this work two research lines, applied to the production of a Rhizopus oryzae lipase (ROL) in Pichia pastoris, are shown: the application of different monitoring and cultivation techniques to improve ROL production in a P. pastoris Mut+ strain.During P. pastoris fed-batch cultures, methanol needs to be on line measured and monitored in real time. For this purpose, a sequential injection analyzer was developed. Although it presented a suitable analysis frequency for a Muts strain it was too low for a Mut+ strain. When the later was used, two different methanol commercial sensors in the outlet gas steams were utilized and compared. Fluorometry was also evaluated as a monitoring technique for three key variables: biomass, substrate (glycerol/methanol) and recombinant protein. Initially, biomass was followed by the off-line determination of tryptophan's fluorescence. Biomass was correctly predicted with this system but different disadvantages appeared: the need of a sample dilution procedure and a specific sampling device. Therefore, multivariable in situ fluorometry was subsequently evaluated. By means of an in situ multivariable fluorimetric probe, combined with chemometric methods to data processing, biomass and substrate prediction was properly achieved. ROL production could not be satisfactorily estimated.To improve ROL monitoring, it was fusioned to the green fluorescent protein (GFP). Two main disadvantages were found: production levels were lower when compared to solely ROL expression and riboflavin, naturally excreted by the yeast, interfered to GFP's signal. This problem could be solved with sample filtration prior to GFP's measurement and also if a different GFP mutant had been chosen with emission signal further to riboflavin's.With respect to ROL production, the effect of methanol concentration was studied in Mut+ fed-batch cultures. There is an optimal methanol concentration about 2.5 g·l-1. Substrate inhibition was observed at higher methanol levels. Oxygen transfer limitation at the end of the induction phase and an important cell viability decrease were also found. Therefore, alternative culture techniques were evaluated. First a methanol limited fed-batch phase (MLFB) was applied when oxygen limitations appeared at the end of a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch phase (MNLFB). Productivity increased up to 40% with this strategy. Secondly, a temperature limited fed-batch was applied. No better results were obtained compared to the reference MNLFB culture. Finally, a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch was applied with a lower salt content medium and a final temperature limited phase when oxygen limitation appeared. Cell death was reduced but productivity decreased with respect to the reference MNLFB culture. However, a 30% purer lipase was obtained in terms of lipase activity to total protein.Thereafter, the scaling of the production process in a pilot plant was evaluated. Oxygen limitation was found in the early induction phase. This caused a byproduct secretion associated to a ROL production decrease. When oxygen transfer was enhanced, byproduct secretion was reduced and ROL production improved. Similar laboratory scale productivities were not achieved but oxygen mass transfer is being further enhanced to reach the objective levels.
15

Cloning and Expression of Arabidopsis endo-1,4-£]-glucanase in Pichia pastoris

Chao, Shih-hsien 05 February 2010 (has links)
In recent years. as industrialized society developed. people have made a lot of environment pollution problems owing to overusing fossil fuel, moreover. fossil fuel is going to deplete. As the result. the study of the substitute energy is promoted. Ligonocellulose (lignin, cellulose and hemicelluloses are included) are the most plentiful renewable resources in the nature, and it have high economic values which extensively use on food, paper and energy. Recent years, it is a hot issue that decomposing cellulose into the minimum unit called glucose, and further, fermenting into alcohol to generate biomass energy. This research goal is cloning Arabidopsis endo-1,4-£]-glucanase and transfer to Escherichia coli(DH5£\). Selection pPICZ£\A the success transferr DNA Fragment. Then to sequence and because of cell in pPICZ£\A have expression in Pichia. pastoris. AOX1 promoter have Mass productions Arabidopsis endo-1,4-£]-glucanase gene in Pichia pastoris. Carries on the extracellular expression by the methyl alcohol induction way. Can obtain recombinant DNA protein. However the Western blotting analysis demonstration has this enzyme active protein At4g11050 pellet Molecular weight about 89 KDa. Again by way of congo red and Dye-CMC assay activeness of the examination enzyme protein. The result discovers At4g11050 in the pellet cell activity compares with negative control has the obvious activity.
16

Characterization of Arabidopsis Glycoside Hydrolases Family 9 Genes

Li, Ya-ru 26 January 2010 (has links)
Generation of alcohol for biofuels from fermentation of sugar or starch has several economic disadvantages such as high cost of sugar processing and land usage competing with staple food. The solution may reside in hydrolysis of cellulose from crop waste such as stalks of rice and corn or non-crop plants such as weeds or wood. Our goal is to identify cellulases that can degrade cellulosic biomass more efficiently. Studies of microbial Family 9 glycoside hydrolase (GH9) proteins, including both endo-glucanases (EC 3.2.1.4) and cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91), have shown that they function through an inverting mechanism to cleave the 1, 4-£]-glucosidic bond between two unsubstituted Glc units. The main function of plant glycoside hydrolases are involved in polysaccharide metabolism of cell wall during cell growth. Twelve Arabidopsis thaliana (Columbia) endo-1,4-£]-glucanases that belong to the GH9, were cloned and expressed in Pichia pastoris in order to produce cellulases to facilitate efficient bio-alcohol production. The recombinant proteins do not show in vitro endo-1, 4-£]-glucanase activity, but we can detect the recombinant proteins expression in supernatant or in pellet. The lack of enzymatic activity from recombinant proteins is probably due to improper folding or glycosylation, or fast degradation resulted from the above reasons. Other bioreactor will be tested in the future. Genetic engineering to modify Arabidopsis thaliana (Columbia) endo-£]-1, 4-glucanases is another approach to produce functional cellulases with economic efficiency that can be adapted to industrial scale for alcohol generation. On the other hand, we use semi-quantitative PCR method to study the Arabidopsis GH9 genes expression level in different tissue. At4g39000 and At3g43860 were found only in flowers and inflorescence, and At1g65610 expression in roots and shoots of the amount of more. Other genes in different tissues, was no found significant difference.
17

Sec16 is a key determinant of transitional ER organization /

Connerly, Pamela L. January 2003 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, December 2003. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.
18

Žmogaus virusų paviršiaus glikoproteinų ekspresijos tyrimas mielėse Pichia pastoris / Expression of human virus surface glycoproteins in yeast pichia pastoris

Čiplys, Evaldas 25 November 2010 (has links)
Vienas pagrindinių biomedicininės paskirties baltymų gamybos iššūkių yra pigių ir saugių ekspresijos sistemų, tinkamų glikoproteinų sintezei, paieška bei esamų sistemų tobulinimas. Vaistai, sukurti baltymų pagrindu, sudaro apie ketvirtadalį naujai patvirtinamų vaistų rinkos, o apie 60% jų sudaryti iš glikoproteinų. Dabar glikoproteinų sintezei naudojamos žinduolių kultūros turi keletą trūkumų. Jose gaunamų rekombinantinių baltymų kaina yra didelė, ribotas tūrinis našumas, ląstelės lėtai dauginasi ir auga, būna užkrėstos retrovirusais, gaunamas heterogeniškas produktas ir užima daug laiko sukurti stabilią ląstelių liniją. Itin intensyviai vykstantis tinkamų ekspresijos sistemų kūrimas kol kas nedavė norimų rezultatų. Mielių, kaip ir augalų bei vabzdžių, ekspresijos sistemos, dėl keletos priežasčių yra įvardijamos kaip vienos pagrindinių kandidatų užimti šią vietą. Visų pirma, mielės yra pripažintos kaip saugus organzimas, jų gentika, biochemija ir fiziologija yra gerai ištirta, be to, sėkmingai pradėti kurti rekombinantiniai mielių kamienai su sudėtingu žinduolių tipo N-glikozilinimu. Vis tik mielėse susintetintų glikoproteinų, tinkamų farmacijos pramonei, skaičius yra labai nedidelis, dažniausiai glikoproteinai nebūna tinkamai suvynioti ir modifikuoti, o esmininės priežastys, paaiškinančios mielių trūkumus sintetinant tokio tipo baltymus, nėra išaiškintos. Eukariotų genų inžinerijos laboratorijoje jau yra sukaupta nemaža patirties sintetinant mielėse virusinius glikoproteinus... [toliau žr. visą tekstą] / Growing market of the glycoprotein based drugs increases demands of safe, cheap and effective expression systems for production of glycoproteins. Mammalian cell cultures, which are being used for this purpose, are very expensive and ineffective. Yeasts are rising as one of the best alternatives. Well known genetics, biochemistry and physiology are only few advantages. Yeasts are also considered to be safe and easy to manipulate organism. Still, despite introducing humanized glycosylation pathways, yeast based expression systems are not able to produce glycoproteins for pharmaceutics, with a very few exceptions. So, further researches in adapting yeast for glycoproteins synthesis must be made. This work is directed for this purpose. In this work mumps, measles and influenza virus surface glycoproteins were expressed in yeast Pichia pastoris. Results show, that mumps virus hemagliutinin-neuraminidase is not synthesized in P.pastoris. Synthesis of measles virus (MeV) hemagliutinin (H) glycoprotein was not effective, with recombinant protein not possessing characteristics of native analogue. MeV-H was found in two forms: unglycosylated polypeptide precursor and glycosylated form, both aggregated and insoluble in non-ionic detergent. Increase in MeV-H expression level resulted in extensive accumulation of unglycosylated MeV-H protein precursors in the cytoplasm of yeast cells. Addition of S.cerevisiae α-factor secretion signal sequence to globular part of MeV-H made... [to full text]
19

Development of Pichia pastoris as a production system for HPV16 L1 virus-like particles as component to a subunit vaccine /

Kotzé, Lara. January 2007 (has links)
Thesis (MScIng)--University of Stellenbosch, 2007. / Bibliography. Also available via the Internet.
20

Die humane Acetylcholinesterase: Design und Synthese eines optimierten Gens und die Expression in Pichia pastoris

Vorlová, Sandra. January 2002 (has links)
Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Page generated in 0.0868 seconds