A glândula pineal é um órgão neuroendócrino regulado pelo fotoperíodo ambiental. Sua principal inervação é constituída por fibras simpáticas provenientes do gânglio cervical superior que, liberando noradrenalina, ativa receptores b1 adrenérgicos resultando na produção noturna de melatonina, cuja biossíntese envolve a conversão da serotonina à NAS. O ATP, co-liberado com a noradrenalina, liga-se a receptores purinérgicos presentes na pineal e leva a uma potenciação da produção de NAS. Após a liberação, o ATP sofre rápida degradação enzimática, degradação esta, funcionalmente importante, uma vez que metabólitos do ATP atuam como ligantes em diferentes receptores. Os receptores purinérgicos são classificados em duas grandes famílias: receptores P1, que reconhecem adenosina e, receptores P2, que reconhecem principalmente ATP, ADP e AMP. Várias famílias de enzimas estão envolvidas na hidrólise de ATP liberado para o meio extracelular, sendo elas: as E-NTPDases, as E-NPPs e a ecto-5\'-nucleotidase. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a expressão gênica, a distribuição celular e a atividade das ecto-nucleotidases na glândula pineal de ratos a fim de aprimorar a caracterização do sistema purinérgico neste órgão. / The pineal gland is a neuroendocrine organ regulated by environmental photoperiod. Its main innervation is constitute by fibers from the sympathetic superior cervical ganglion that by releasing noradrenaline active b1 adrenergic receptors resulting in the nocturnal production of melatonin whose biosynthesis involves the conversion of serotonin to NAS. ATP, co-released with norepinephrine binds purinergic receptors present in the pineal gland and leads to an enhancement of the production of NAS. After release, ATP and other nucleotides are rapid enzymatic degradation, this degradation is functionally important since ATP metabolites act as ligands in different receivers. Purinergic receptors are classified into two large families: P1 receptors that recognize adenosine and P2 receptors that recognize mainly ATP, ADP and AMP. Several families of enzymes are involved in the hydrolysis of ATP released into the extracellular environment: the E-NTPDase, E-NPP and the ecto-5\'-nucleotidase. This study aimed to characterize the gene expression, the cellular distribution and activity of ecto-nucleotidases in the rat pineal gland in order to improve the characterization of the purinergic system in this organ.

O fator de transcrição nuclear kappa B (NFKB), central na resposta inflamatória, é constitutivamente expresso em glândulas pineais de rato. A inibição da translocação nuclear deste fator em pineais de rato por corticosterona potencia, enquanto que a inibição pela citocina fator de necrose tumoral (TNF) inibe a síntese de melatonina por inibição da transcrição da Aa-nat. Esta redução da produção noturna de melatonina está implicada em favorecer a montagem da resposta inflamatória. Embora dados da literatura sugerirem redução da produção de melatonina durante processos infecciosos, não há evidências diretas da habilidade da glândula pineal em reconhecer o lipopolissacarídeo (LPS), a endotoxina da membrana de bactérias gram-negativas. Esta dissertação investigou se a glândula pineal de ratos expressa receptores para o reconhecimento do LPS e estabeleceu possíveis mecanismos de ação desta endotoxina na glândula pineal de ratos. Nossos resultados demonstram que a glândula pineal expressa de maneira constitutiva os receptores CD14 e o TLR4. LPS induz a translocação nuclear dos dímeros p50/p50 e p50/RelA e a síntese de TNF em glândulas cultivadas. A máxima produção de TNF no meio de cultura é coincidente com a máxima expressão do receptor TNFR1 em pinealócitos. Além disso, LPS inibe a síntese de N-acetilserotonina e melatonina. Em conclusão, neste estudo, demonstramos que a pineal é alvo para o componente de bactérias gram-negativas LPS, reforçando a proposta de que esta glândula reconhece e gera respostas a moléculas que sinalizam a montagem da resposta inflamatória. / Nuclear factor-kappa B (NFKB), a pivotal player in inflammatory responses, is constitutively expressed in the pineal gland. Corticosterone inhibits pineal NFKB leading to an enhancement of melatonin production, while tumor necrosis factor (TNF) leads to inhibition of Aa-nat transcription and the production of N-acetylserotonin (NAS) in cultured glands. The reduction of nocturnal melatonin surge favors the mounting of the inflammatory response. Despite these data, there is no clear evidence of the ability of the pineal gland to recognize molecules that signal infection. This study investigated whether the rat pineal gland expresses receptors for lipopolysaccharide (LPS), the endotoxin from the membranes of gram-negative bacteria, and to establish the mechanism of action of LPS. Here we show that pineal glands possesses both CD14 and toll-like receptor 4 (TLR4), membrane proteins that bind LPS and trigger the NFKB pathway. LPS induced the nuclear translocation of p50/p50 and p50/RELA dimers and the synthesis of TNF. The maximal expression of TNF in cultured glands coincides with an increase in the expression of TNF receptor 1 (TNFR1) in isolated pinealocytes. In addition, LPS inhibited the synthesis of N-acetylserotonin and melatonin. Therefore, the pineal gland transduces gram-negative endotoxin stimulation by producing TNF and inhibiting melatonin synthesis. Here we provide evidence to reinforce the idea of an immune-pineal axis, showing that the pineal gland is a constitutive player in the innate immune response.

O TNF atua diretamente sobre a pineal inibindo a via biossintética da melatonina. De forma semelhante o LPS, potente ativador da resposta imune inata, tem efeito inibitório sobre a produção de melatonina e seu precursor. A supressão da síntese noturna de melatonina é admitida de forma a permitir a montagem da resposta inflamatória, tanto durante o dia como à noite. Dados do grupo tem demonstrado que o NFKB é um fator constitutivamente expresso na glândula pineal e que o ritmo diário de translocação pode ser determinante para o início da síntese de melatonina. A inibição de sua ativação potencia a síntese de melatonina enquanto que fatores que classicamente promovem a sua ativação inibem esta produção. Nesta dissertação, verificamos as moléculas envolvidas no reconhecimento e na de sinalização desta citocina na pineal. Demonstramos que a pineal está apta a responder ao TNF, células gliais da pineal e as células secretoras, os pinealócitos, expressam constitutivamente o receptor TNF-R1. O TNF promove a translocação nuclear dos dímeros p50/p50 e p50/RelA do NFKB em glândulas pineais em cultura. Confirmamos a ativação desta via em pinealócitos pela análise da proteína inibitória IKB. Vimos que a ativação desse fator é essencial para expressão da iNOS e a produção de NO induzida por TNF em pinealócitos isolados. Além disso, mostramos que o TNF promove a redução da expressão do receptor TNF-R1 na membrana de pinealócitos. Em resumo, mostramos neste trabalho que a pineal está instrumentalizada a responder ao TNF, e que os pinealócitos são alvos diretos para o seu reconhecimento. Confirmamos a relevância do fator NFKB na resposta da pineal em situações de injúria, ampliando o conceito de que a pineal está apta a detectar moléculas do processo inflamatório. / TNF acts directly on the pineal gland by inhibiting the biosynthesis of melatonin. Similarly, LPS, a potent activator of the innate immune response has an inhibitory effect on the production of melatonin and its precursor. The suppression of nocturnal melatonin synthesis is admitted to allow the full mounting of the inflammatory response both during the day and night. Data from our laboratory have shown that the NFKB is constitutively expressed in the pineal gland and that the daily rate of translocation can be determinant for the onset of melatonin synthesis. Inhibition of their activation potentiates melatonin synthesis whereas factors that promote its activation classically inhibit this production. In this dissertation we find the molecules involved in recognition and signaling of this cytokine in the pineal. We demonstrated that the pineal is responsive to TNF, the pineal glial cells and secretory cells, the pinealocytes, constitutively express the TNF-R1. TNF promotes nuclear translocation of p50/RelA and p50/p50 NFKB dimers in the pineal glands in culture. We confirmed the activation of this pathway in pinealocytes by analyzing the inhibitory protein IKB. We have seen that the activation of this factor is essential for iNOS expression and NO production induced by TNF in isolated pinealocytes. Furthermore we show that TNF promotes the reduction of the expression of TNF-R1 receptor on the membrane of pinealocytes. In summary, we show here that the pineal is instrumented to respond to TNF and that the pinealocytes are direct targets for its recognition. We confirm the relevance of NFKB in the pineal response in situations of injury extending the concept that the pineal is able to detect molecules in the inflammatory process and respond accordingly.

A sinalização purinérgica tem sido demonstrada como um um importante modulador dediversos processos fisiológicos e fisiopatológicos. Dentre os receptores purinérgicos, o receptor P2X7 distingui-se por requerir altas concentrações de ATP em sua ativação. As demonstrações prévias de que a glândula pineal responde a diferentes estímulos purinérgicose a altas concentrações de ATP sugere um papel para os receptores P2X7 nesta glândula, embora sua expressão e função não estivesse estabelecida. O objetivo deste trabalho, portanto, foi caracterizar funcionalmente o receptor P2X7 na glândula pineal de ratos. Os resultados obtidos demonstram, pela primeira vez, a expressão gênica e proteica do receptor P2X7 na glândula pineal. Os efeitos da ativação destes receptores levam a uma inibição nos níveis de melatonina induzida por isoprenalina por um mecanismo independente da via do fator de transcrição NF-kB e da fosfolipase C. Além disso, a estimulação destes receptores inibiu a síntese de TNF induzida por LPS, resultado este semelhante ao observado na presença do pré-tratamento com antagonistas do receptor P2X7. Estes dados confirmam a presença de receptores P2X7 na glândula pineal e reiteram o relevante papel da estimulação purinérgica a sobre a síntese de melatonina e sobre a capacidade da pineal em responder a PAMPs, como o LPS / Purinergic signalling has been demonstrated as an important modulator ofseveral physiological and pathophysiological processes. Among the purinergic receptors, the activation of P2X7 receptor requireshigh concentrations of ATP. The previous demonstration that the pineal gland is responsive to different purinergic stimulus and to high concentrations of ATPsuggests a role for P2X7, although its expression and function remained unclear. The aim of this study was to functionally characterize the P2X7 receptor in the rat pineal gland.The data showedthe P2X7 receptor mRNA and protein expression in the pineal gland. The effect of its activation leads toan inhibition of melatonin content induced by isoprenaline through an independent NF-kB and PLC pathways. Furthermore, the P2X7 receptor activation inhibits the LPS-induced TNF synthesis, a similar result observed in the presence of the pre-treatment with P2X7 receptors antagonists. These data demonstrate the presence of P2X7 receptors in the rat pineal gland and confirm the relevant role of the purinergic stimulation to the pineal melatonin synthesis and responsiveness to PAMPs such as LPS

Melatonina é um hormônio produzido principalmente pela pineal, possui caráter temporizador do meio interno, ação antioxidante, neuroprotetora e neurotrófica. Outro fator que age nos processos de neuroplasticidade é o exercício físico. Este é responsável por alterar parâmetros metabólicos nos animais, e trabalhos do nosso grupo demonstraram que tais adaptações metabólicas em ratos dependem da melatonina pineal. Diante disso investigamos se as adaptações neuroplásticas em ratos submetidos ao treinamento físico também estariam relacionadas à presença deste neuro-hormônio. Nossos resultados demonstram que a melatonina não influenciou a expressão gênica e quantificação proteica de indicadores da neurogênese, somente a realização do treinamento físico alterou alguns dos parâmetros avaliados. Os níveis de corticosterona se mostraram alterados nos animais pinealectomizados. A avaliação da expressão gênica circadiana com oito pontos ao longo das 24 horas revelou o comportamento variável do mRNA de algumas proteínas atreladas ao processo de plasticidade hipocampal / Melatonin is a hormone produced mainly by pineal gland, has timer character of the internal medium, antioxidant action, neuroprotective and neurotrophic. Another factor that acts in the processes of neuroplasticity is physical exercise. This is liable to change metabolic parameters in animals, and work by our group have shown that such metabolic adaptations in rats depend on pineal melatonin. Thus we investigated whether the neuroplastic adaptations in rats submitted to physical training also would be related to the presence of this neurohormone. Our results demonstrate that the melatonin did not influence the gene expression and protein quantification of indicators of neurogenesis, only the execution of the physical training has changed some of the parameters evaluated. The levels of corticosterone were changed in pinealectomized animals. The assessment of gene expression circadian with eight points along the 24 hours showed the variable behavior of the mRNA of some proteins linked to the process of hippocampal plasticity.

A glândula pineal produz melatonina, estimulada pela liberação noturna de noradrenalina na pineal. O exercício físico aumenta a atividade dos neurônios simpáticos periféricos e a noradrenalina, o que modularia a síntese de melatonina. Porém há controvérsias, pois viu-se o aumento, a diminuição e a não alteração da síntese de melatonina induzida pelo exercício. Ademais, o diabetes induzido e o envelhecimento reduzem a síntese de melatonina pineal em ratos. Dessa maneira avaliou-se os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a síntese desse hormônio sob várias condições: animais adultos, diabéticos não tratados e idosos, sendo eles sedentários ou treinados. Nos adultos treinados não houve diferença na produção de melatonina, nos diabéticos não foi vista alteração na atividade da enzima AANAT e nos idosos treinados houve aumento na atividade da AANAT e na expressão gênica do receptor β adrenérgico no ZT18. Em suma, o treinamento físico não alterou a síntese de melatonina nos animais adultos e nos diabéticos, mas foi capaz de modulá-la nos animais idosos treinados. / The pineal gland produces melatonin stimulated by the nocturnal release of norepinephrine. Physical exercise increases the activity of peripheral sympathetic neurons and norepinephrine release, which may modulate melatonin synthesis. Melatonin synthesis modulation by exercise remains controversial. On the other hand, induced diabetes and aging reduce the pineal melatonin synthesis. In this way, we assessed the effects of aerobic exercise training on the synthesis of this hormone under various conditions: adult, untreated diabetic and aged animals, either sedentary or trained. Physical exercise did not alter melatonin production in adult rats and diabetic ones showed no AANAT enzyme activity change. Trained aged animals presented no increase in AANAT activity and β-adrenergic receptor gene expression at ZT18. In conclusion, physical training did not alter melatonin synthesis in adult animals and in diabetic ones but was able to modulate it in trained aged animals.

O tecido adiposo, através da leptina, desempenha um papel permissivo sobre a maturação sexual do indivíduo. Apesar da importância do tecido adiposo para a puberdade, pouco se sabe a respeito do processo de formação deste tecido neste período da vida. Estudos em humanos têm descrito a presença de resistência à insulina puberal. Assim, frente à importância do tecido adiposo para a puberdade, o objetivo do trabalho foi investigar a resposta do tecido adiposo à insulina no período puberal. Foram utilizados os coxins adiposos subcutâneo e periepididimal. Na puberdade, paralelamente à intolerância à glicose transitória que ocorreu nas semanas iniciais, e, portanto, prejuízo da utilização da glicose pelos tecidos insulino-dependentes, o tecido adiposo (SC e PE) teve sua responsividade normal à insulina e uma melhor capacidade de incorporação de glicose em lipídeos o que leva a crer que há um desvio da utilização deste substrato energético, a glicose, para a formação do tecido adiposo. / The adipose tissue is critical to puberty. Leptin exerts a permissive role to hypothalamic-hypophysial-gonadal maturation and, thereby, adipose tissue is necessary to pubertal development. Despite its importance to puberty, little is known about the process of adipose tissue formation during this period of life. Researches have described insulin resistance at pubertal period in humans. The adipose tissue importance to puberty added to pubertal insulin resistance described in humans lead us to investigate how the adipose tissue responds to insulin at this period since it is essential at this time. We assessed two distinct fat pads: the subcutaneous fat pad and the epididymal one. At the puberty, despite the temporary glucose intolerance and the constraint for glucose utilization by insulin-dependent tissues, the adipose tissue had normal insulin responsiveness plus an improved capacity to synthesize lipids from glucose which led us to hypothesize that glucose could have been deviated towards the adipose tissue.

A glândula pineal de mamíferos não é uma estrutura oscilatória autônoma, exigindo a liberação de noradrenalina (Nor) na fase escura para que a melatonina seja circadianamente produzida. Na cultura padrão de glândula pineal, o órgão não expressa ritmicidade funcional e para mimetizar o padrão fisiológico de liberação de Nor, desenvolvemos a cultura temporizada com Nor. Logo, o objetivo desse trabalho foi investigar a manutenção do ritmo de expressão dos genes relógio pela cultura temporizada, e qual a via noradrenérgica envolvida. Para os estudos in vitro, realizaram-se culturas dos grupos: controle (sem Nor), agudo (cultura padrão) e temporizado (12h com Nor/12h sem Nor). Além disso, à cultura temporizada se adicionou Prasozin e/ou Propranolol. Analisou-se expressão dos genes relógio, atividade da enzima AANAT e conteúdo de melatonina no meio de cultura. No grupo temporizado, observou-se a manutenção da ritmicidade dos genes analisados, diferente do observado nos grupos controle, agudo e temporizado tratado com bloqueadores, além do aumento da atividade enzimática da AANAT e aumento do conteúdo de melatonina. Em suma, a cultura temporizada com Nor se mostra importante para evitar a arritmicidade encontrada na cultura padrão de glândula pineal. / The mammals pineal gland is not an autonomous oscillator, the circadian melatonin synthesis requires the release of norepinephrine (NE) on the dark phase. In standard pineal gland culture, the glands do not express any functional rhythmicity. To mimic the physiological pattern of NE release in the pineal gland culture, we developed a synchronized culture with NE. We aimed to investigate the maintenance of circadian clock genes expression within rat pineal gland under acute and synchronized culture and the noradrenergic pathway involved. In in vitro experiments, culture glands were under: control (without NE), acute (standard culture) and synchronized (12h with NE/12h without NE) conditions. Furthermore, in the synchronized group were added Prasozin and/or Propranolol. We investigated clock genes expression, AANAT activity and melatonin content. The synchronized culture was able to maintain the rhythmic clock genes expression, which didn´t occur in control, acute and synchronized treated with blockers groups, and was able to improve AANAT activity and melatonin synthesis. In conclusion, synchronized culture method showed as a useful approach to avoid disruption of rhythmic variations found in the standard culture.

A glândula pineal sintetiza o hormônio melatonina no período escuro. No rato, a ativação dos receptores a e b-adrenérgicos aumenta os níveis de AMPc, levando à síntese e ativação da enzima arilalquilamina-N-acetiltransferase (AANAT). A glândula recebe também inervação parassimpática, sendo inibitório o efeito da acetilcolina. A metilecgonidina (AEME) é o produto da pirólise da cocaína, quando esta é usada sob a forma de \"crack\". Neste trabalho estudamos os efeitos e os mecanismos de ação da AEME sobre a síntese da melatonina. Foram investigados a atividade da AANAT, o Ca2+, o AMPc e a viabilidade celular e a fragmentação do DNA. A AEME reduziu a síntese da melatonina in vivo e in vitro, sendo este efeito revertido pela atropina. A AEME induziu um aumento do Ca2+, não alterando o AMPc e a atividade da AANAT. A viabilidade celular e fragmentação do DNA não foram modificadas pela AEME. Em conclusão, a AEME reduz a síntese da melatonina, in vitro e in vivo, e a sua ação se dá por interferir com o sistema colinérgico muscarínico. / The pineal gland synthesizes the hormone melatonin in the dark. In rats, the activation of a and b-adrenergic receptors increases cAMP levels and the synthesis and activity of arylalkylamine-N-acetyltransferase enzyme (AANAT). The pineal gland is also innervated by parasympathetic fibers, being inhibitory the effect of acetylcholine. Methylecgonidine (AEME) is the pyrolysis product of cocaine when it is used as \"crack.\" In this work we studied the effects of AEME on the melatonin synthesis, in vitro and in vivo. We investigated AANAT activity, iCa2+, cAMP, cell viability and DNA fragmentation. AEME reduced melatonin synthesis in vivo and in vitro, and this effect was reversed by atropine. There was an increase in Ca2+, but not in cAMP or AANAT activity induced by AEME. Cell viability and DNA fragmentation were not affected by AEME. In conclusion, AEME reduced melatonin synthesis in vitro and in vivo, being this effect mediated by the muscarinic cholinergic system.

A glândula pineal, via melatonina (MEL), desempenha uma importante função regulatória no metabolismo de carboidratos e parece ser de fundamental importância nas adaptações metabólicas dos tecidos adiposo e muscular. Evidências mostram que animais pinealectomizados são incapazes de se adaptarem a condições estressantes e não conseguem desenvolver as alterações adaptativas ao exercício. Sabendo que o animal idoso apresenta considerável redução da produção de MEL, o objetivo deste estudo foi investigar a adaptação metabólica ao treinamento físico no animal idoso com e sem reposição de MEL. Para tanto, foram utilizados ratos Wistars, com 12 meses de vida, que foram divididos em 4 grupos: controles sedentários; controles treinados; suplementados com MEL sedentários; suplementados com MEL treinados. A suplementação com MEL teve a duração de 16 semanas, enquanto o treinamento físico teve a duração de 8. Os resultados mostraram que a suplementação com MEL em animais idosos tem grande importância nas adaptações induzidas pelo treinamento físico aeróbio / The pineal gland, melatonin (MEL), plays an important physiological and regulatory function in carbohydrate metabolism and seems to be of fundamental importance in determining the metabolic adaptations of adipose and muscle tissues. Evidence shows that pinealectomized animals are unable to adapt to stressful conditions, thus fail to develop adaptive metabolic changes to aerobic exercise and therefore do not exhibit the same performance as control trained animals. Knowing that the elderly animal presents a considerable reduction in MEL production, the objective of this study was to investigate the metabolic adaptation to exercise training in aged animals with and without replacement of MEL. The animals, Male-Wistar, were divided into four groups: sedentary control, trained control, sedentary treated with MEL, trained treated with MEL. The Supplementation with MEL lasted 16 weeks, while physical training lasted 8 weeks. The results demonstrated that MEL supplementation in elderly animals is of great importance in adaptations induced by aerobic exercise.