A produção comercial de bovinos produzidos por transferência nuclear de célula somática permitiu o desenvolvimento de novo modelo no estudo da placenta. A necessidade da cesariana para o nascimento do bezerro favorece a coleta das membranas fetais. Alterações como número total de placentônios, tamanho, formato, árvores vilosas, cordão umbilical, assim como alterações no recém nascido já foram mostradas anteriormente. Gestações produzidas por transferência de núcleo freqüentemente apresentam retenção de placenta. Durante a palpação retal após dois dias da cesariana notou-se placentônios sem diminuição no tamanho e sem alteração na consistência. A observação da ausência de regressão levaram à formulação da hipótese de placentônios provenientes de gestações produzidas por transferência de núcleo apresentam menor freqüência de apoptose quando comparados com placentônios provenientes de gestações produzidas por monta natural. Para testar essa hipótese 15 placentônios provenientes de clones e 3 placentônios provenientes de monta natural foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. A extração de RNA foi realizada mediante protocolo Trizol (Invitrogen, Brasil) e a reação de trascriptase reversa feita com Kit Impron II (Promega, Brasil), usando 1µg de RNA total. A quantificação relativa foi desenvolvida no "7500 Real Time PCR System" (Applied Biosystems, EUA), em reação de 25µL contendo 1X "Power SYBR Green PCR Master Mix" (Applied Biosystems, EUA), 1µg de cDNA e 0,6µM de cada primer (BAX, BCL2, e GAPDH). Para a quantificação dos genes ITM2B e PI3K, também se utilizou o gene GAPDH como gene endógeno e reação contendo 1x "Taqman Universal Master Mix" (Applied Biosystems, EUA), 40ng de cDNA, 0,72µM de cada primers (ITM2B, PI3K e GAPDH) e 0,2µM de cada sonda. O programa "LinRegPCR" (RAMAKERS et al., 2003) foi usado para o cálculo da eficiência individual de cada reação e para o cálculo estatístico usou-se o programa "REST2005" (PFAFFL et al., 2002). Os resultados mostraram que o gene BAX possui redução da expressão relativa no grupo transferência de núcleo (P=0,04), enquanto os genes BCL2, ITM2B e PI3K foram iguais entre grupo transferência de núcleo e monta natural. A relação BAX/BCL2 foi maior que 1 em 12 dos indivíduos analisados 12/15 (80%). Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando comparadas variáveis como sexo, sobrevivência e peso ao nascimento para todos os genes estudados. A redução da expressão do BAX no grupo transferência de núcleo sugere que a apoptose é menor neste grupo e a relação BAX/BCL2 indica que a redução na taxa de morte celular programada pode ser responsável pela redução na taxa de regressão dos placentônios. / The study of placenta from somatic cell nuclear transfer pregnancy originated a new model of study after the commercial production of bovine nuclear transfer clones, this technique requires caesarean section, that allows collection of fetal membranes. Alterations as differences in the placentomes total number, size, villous trees, umbilical cord and new born alterations were already described in NT placenta. These nuclear transfer gestations frequently have placental retention and during rectal palpation two days after caesarean section, we observed placentomes with normal characteristics as before section, suggesting an absence of recending. This information about the receding absence lead us to hypothesize that placentomes produced from nuclear transfer pregnancies show lower frequency of apoptosis thus produced from natural. For testing this hypothesis we collected 15 fragments of placentomes from nuclear transfer fetus and 3 of natural mating. The RNA extraction was performed with Trizol (Invitrogen, Brazil) protocol and the reverse transcriptase by Impon II (Promega, Brazil), using 1µg of total RNA. We performed the real time relative quantification technique in the "7500 SDS System" (Applied Biosystems, USA) to investigate the mRNA expression of BAX, BCL2 as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene, with concentrations of 1X Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), 1µg of cDNA and 0.6µM of each primer (BAX, BCL2, and GAPDH) in 25µL of total reaction. The ITM2b and PI3K as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene with concentrations of 1x Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, USA), 40ng of cDNA, 0.72µM of primers (ITM2B, PI3K and GAPDH) and 0.2µM of each probe. The "LinRegPCR" software (RAMAKERS et al., 2003) was used for individual efficiency calculation and the "REST2005" (PFAFFL et all, 2002) software for statistical analysis, using the standard efficiency. The results show that BAX gene is down regulated in the nuclear transfer group (P=0.04), while the BCL2, ITM2B and PI3K are equal in nuclear transfer and natural mating groups. The relation BAX/BCL2 was greater than 1 in 12 nuclear transfer samples 12/15 (80%). No significant difference was found when evaluated variables such as survival, calv sex, birth weight for all studied genes. The lower expression of BAX gene in nuclear transfer groups suggests that apoptosis is lower in this group and the relation BAX/BCL2 is indicative that a lower rate of apoptosis may be responsible for the lower rate of placentome receding.

Neste trabalho realizamos a análise macroscópica das estruturas do funículo umbilical e da placenta, a análise macroscópica da vascularização funicular e placentária, e a análise à microscopia de luz dos componentes funiculares da paca, procurando melhor conhecer a morfologia reprodutiva desta espécie. Para tanto, utilizamos nove pacas fêmeas, provenientes do Setor de Animais Silvestres do Departamento de Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal - UNESP, nos estágios inicial, intermediário e final de prenhez, os animais tiveram o corno uterino gestante retirado cirurgicamente. Com o útero aberto identificamos as membranas fetais e fizemos a mensuração do funículo umbilical e da distância céfalo-coccígea fetal, em seguida identificamos os vasos funiculares que foram injetados com látex do tipo Neoprene corado com pigmento específico; após injeção, esses vasos foram dissecados para a visualização da disposição das artérias e veias na placenta. Três animais foram direcionados à análise microscópica do funículo umbilical que depois de colhido foi seccionado em porções proximal, intermediária e distal que foram fixadas e sofreram processamento histológico usual com posterior colorações em hematoxilina- eosina e tricromico de Masson. Constatamos nestes animais uma placenta de formato discoidal globoso e as membranas fetais constavam de cório-alantóide e âmnio. As médias das medidas dos comprimentos dos funículos umbilicais e das distâncias cefalococcígeas foram de 7,31cm e 14,5 cm respectivamente. Macroscopicamente observamos no funículo umbilical a presença de duas artérias umbilicais, uma veia umbilical, o alantóide, vasos onfalomesentéricos; microscopicamente, observamos que as artérias e veias umbilicais eram musculares, o ducto alantóide era constituído por epitélio bi-estratificado cúbico e, essas estruturas, juntamente com os vasos onfalomesentéricos estavam englobadas pela gelatina de Wharton, também se observou a presença de vasa vasorum. A dissecação dos vasos umbilicais injetados indicou que as veias se localizavam basicamente na periferia da placenta enquanto as artérias ocupavam posição centralizada. / On this research we peform the macroscopic analysis of the umbilical cord and placenta structure, the macroscopic analysis of umbilical cord and placenta valcularization, and analysis with light microscopy of umbilical cords constituents of paca, aiming to increase the knowledge about the reproductive morphology in this species. To achieve that we used nine female pacas, which came from the Wild Animal Sector of the Zootechnology Departament at the Faculty of Agrarian and Veterenary Sciences of Jaboticabal - UNESP -, in early, entermediary and late phases of pregnancy. The animals had their pregnanty uterine horn taken out on surgery. After opening the uterus, we identified the fetal membranes and measured the umbilical cord and the cephalococcyga distance. Than we identified the umbilical cords vessels with were injected with latex (Neoprene®) dyed by specific pigment; after the injections, the vessels were dissected for visualization of the disposition of arteries and veins in the placenta. Three animals were carried out to microscopic analysis of the umbilical cord that , after the collect, was sectioned in proximal, intermediary and distal portions wich were set and than went to an usual histological processing with furthering colorations with hematoxilin-eosin and Masson tricome method. In these animals we noticed a discoid globular placenta, and the fetal membranes were constituted by chorion-alantois and amnion. The averages of the umbilical cords length and the crown-rump distance were 7,31 cm and 14,5 cm respectively. Macroscopically, we noticed the presence of two umbilical cord arteries, one umbilical cord vein, the allantois and onfalomesenteric vessels; microscopically, we noticed that the umbilical cord arteries and veins were muscly, the alantoic duct was formed by a cubic double layer epthelium and this sctructures, together with the onfalomezenteric vessels, were surrounded by the Wharton´s gelatin. The presence of vasa vasorum was also observed. The dissection of the injected umbilical cord vessels pointed that veins were basically placed that the placenta periphery and arteries presented a central position.

A gravidez humana é permeada por diversos mecanismos de adaptação para evitar a rejeição do feto, que, por se tratar de um tecido semialogênico, deveria ser rejeitado pelo sistema imunológico materno. A molécula HLA-G, presente na interface materno-fetal, apresenta uma característica imunossupressora que age proporcionando inibição contra a citotoxidade das células NK e linfócitos T citotóxicos, conferindo efeito modulador benéfico à gestação. Entretanto, devido a suas propriedades imunossupressoras, essa molécula pode estar envolvida na persistência e progressão da infecção pelo HIV-1. Nosso objetivo foi avaliar a expressão das moléculas HLA-G em tecidos placentários de mulheres infectadas ou não pelo HIV-1. Trata-se de um estudo transversal e descritivo, para o qual foram coletadas biópsias placentárias de 100 mulheres infectadas pelo HIV-1 e 100 mulheres não infectadas. Ao realizar a análise dos dados sócio-demográficos, pudemos observar que o perfil das mulheres atendidas num hospital de referência no município de Ribeirão Preto assemelha-se ao encontrado nacionalmente. A faixa etária prevalente foi de 20 a 29 anos (48%); em relação à cor da pele, a grande maioria (71%) era branca; quanto à escolaridade, a população estudada apresentou maior frequência de ensino fundamental (61%); e a maioria (68%) não desempenhava atividade remunerada. Quanto à via de parto, 56,7% das mulheres foram submetidas a cesárea eletiva e 100% fizeram uso de antirretroviral injetável no momento do parto, conforme preconização do Ministério da Saúde. A técnica laboratorial utilizada foi imunoistoquímica, cuja análise foi realizada por um patologista. Os resultados obtidos não mostraram associação entre a expressão das moléculas HLA-G e os biomarcadores da infecção pelo HIV-1, como carga viral (cópias/mL) e células CD4+ (células/mm³), nem em relação ao uso de terapia antirretroviral (TARV). Contudo, observamos que as placentas das mulheres infectadas pelo HIV-1 apresentaram redução na expressão de HLA-G em comparação com as mulheres que não apresentam a infecção (p<0,01), sugerindo que essa redução possa ser um mecanismo de escape viral, que acarreta a redução da apresentação de peptídeos virais para os linfócitos T CD8+. Para melhor compreensão do padrão de expressão das moléculas HLA-G em placentas de mulheres infectadas pelo HIV-1, faz-se necessária a realização de outros estudos utilizando metodologias distintas / In order to prevent the rejection of the semiallogenic tissue of the fetus by the maternal immune system, human pregnancy presents a variety of adaptation mechanisms. The HLA-G molecule in the maternal-fetal interface, presents an immunosuppressant feature that inhibits the cytotoxicity of NK cells and T lymphocytes, with a positive modulating effect over the pregnancy. Nevertheless, due to its immunosuppressive properties, the HLA-G molecule might be related to the continuance and the progression of the HIV- 1 infection. Our objective was to analyse the expression of HLA-G in placental tissues of both HIV-1 infected and uninfected women. As a descriptive and cross-sectional study, placental biopsies were collected from 100 HIV-1 infected women and 100 from uninfected ones. When socio- demographic data were analysed, it was observed that the profile of women taken care at the referential hospital in Ribeirão Preto resembled the ones found nationwide: the most prevalent age group was the 20-29 years (48%); the vast majority was of white people (71%); there was a higher frequency of primary education in this group (61%); and most of them did not perform any paid activity (68%); 56.7% of them underwent elective cesarean; and 100 % of them made use of injectable antiretroviral at the delivery, as prescribed by the Ministry of Health. The laboratorial technique used was immunohistochemical, which was performed by a pathologist. Final results showed no association between the expression of HLA-G and the biomarkers of the HIV-1, such as viral load (copies/mL) and CD4+ cell counting (cells/mm³) or even the use of antiretroviral therapy (ART). Nevertheless, in the placenta of women infected with HIV-1, the expression of the HLA-G proved to be reduced in comparison to women who did not have the infection (p <0.01 ), suggesting that this reduction could be a mechanism for viral escape which entails the reduction of viral peptides to CD8+ T lymphocytes. To understand the full extension of the expression pattern of the HLA-G in HIV-1 infected women, it is necessary to perform further studies using different methodologies

A interação materno fetal na espécie equina depende exclusivamente da complexidade anatômica e fisiológica da placenta e este órgão endócrino provisório é a peça chave do presente estudo, onde objetivou-se avaliar a influência do número de partos sob a eficiência placentária. Buscando, por meio da morfometria das macro e microrregiões, além da expressão do VEGF, VEGFR-1/Flt-1 e VEGFR-2/FLK-1 na membrana corioalantóide a termo, dados referentes à inter-relação da pluriparidade, contato materno fetal e peso dos neonatos da raça Puro Sangue Inglês. O delineamento experimental consistiu em um estudo analítico, observacional, transversal, prospectivo. Foram acompanhados cinquenta partos de éguas divididas em três grupos de acordo com a pluriparidade: primíparas (n=18), 2 a 5 partos (n=14) e 6 a 10 partos (n=18). Foram coletados e fixados em formol fragmentos de 3 cm2 das regiões do corpo do útero (Cut), corno uterino gestante (CG) e corno uterino contralateral (CnG) da membrana corioalantóide a termo pós delivramento. Após processamento foram corados pela técnica de Hematoxilina & Eosina e Picro-Sirus-Red. Os estudos imunohistoquímico (método avidina-biotina) e esterológico foram realizados ao microscópio óptico. Foram correlacionados número de partos, altura e perímetro torácico (PT) maternos; idade, altura e PT paternos; composição volumétrica dos compartimentos placentários juntamente com as áreas de superfície de contato materno-fetal e peso, altura e escore de vitalidade neonatal. A paridade, além de diretamente relacionada ao peso do neonato, demonstrou na avaliação morfofuncional ser determinante ao ganho de eficiência placentária. As membranas corioalantóides das éguas pluríparas tenderam a apresentar maior volume total no CG, aumento na porcentagem e volume total de vilos, além de maior densidade microcotiledonária e expressão do VEGF na região do CG. Entre as muitas correlações determinadas no grupo primíparas as mais relevantes foram peso da membrana com variáveis neonatais como peso (r=0,598), PT (r=0,775), tempo para mamar (r=0,553) e tempo de gestação (r=-0,527), além do PT da mãe com o tempo para ruptura do cordão umbilical (r=0,564), reflexo de sucção (r=0,625), para levantar (r=0,756) e decúbito esternal (r=-590). Da mesma forma no grupo 2 a 5 partos, neonatos que nasceram com maior peso, altura, e PT apresentaram menor tempo para levantar (r=-0,546; r=-0,869, r=-0,892), eliminação do mecônio (r=-0,535) e ruptura do cordão umbilical (r=-0,528; r=-0,881). Assim como no grupo 6 a 10 partos, o peso do potro apresentou correlação com o peso (r=0,793), PT (r=0,716) e altura (r=0,667) materna. O volume total do CG correlacionou com volume total do parênquima (r=-0,816) e epitélio nos vilos placentários do CG (r=-0,915), tempo de gestação (r=-0,483), tempo para reflexo de sucção (r=-0,672), para mamar (r=-0,525), e para eliminação do mecônio (r=-0,525). No que diz respeito às variáveis paternas, o peso paterno correlacionou com o volume total do parênquima nos vilos placentários do CnG (r=0,393) , além do PT do garanhão com o peso (r=0,316) e PT (r=0,425) do potro e volume total do CG (r=0,319). Desta forma, acredita-se que estes resultados possam fornecer ferramentas práticas para auxiliar na escolha das fêmeas e machos mais indicados para geração de potros neonatos com desenvolvimento adequado. / Fetomaternal interaction in equine species depends exclusively on the complexity of placental anatomy and physiology. This transient endocrine organ is the key of the present study, which aimed to evaluate the influence of parity on placental efficiency. Morphometric of macro and micro regions, expression of VEGF, VEGFR-1/Flt-1 and VEGFR-2/FLK-1 in term corioallantois were performed and data regarding parity, fetomaternal contact and neonatal weight were evaluated in Thoroughbred. The experimental study consisted of an analytical, observational, cross-sectional, prospective study. Fifty deliveries were monitored in mares divided into three groups according to parity: nulliparous (n=18), 2 to 5 deliveries (n=14) and 6 to 10 deliveries (n=18). Tissue sections measuring 3 cm 2 were collected and fixed in formol saline from term chorioallantois regions: uterine body (UtB), pregnant uterine horn (PH) and contralateral uterine horn (CtH). After processing, samples were stained using Hematoxylineosin and Picro-Sirus-Red. Imunnohistochemistry (avidin-biotin method) and stereology were performed using an optic microscope. Correlations between parity, maternal height and thoracic perimeter; paternal age, height and thoracic perimeter; volume composition of placental compartments, surface area of fetomaternal contact and weight, height and neonatal vitality score were performed. Parity was directly related to weight of the neonate and demonstrated in morphofunctional evaluation to be determinant for placental efficiency. Chorioallantoic membranes from pluriparous mares tended to have greater total PH volume, higher percentage and total villi volume, and greater microcotiledonary density and VEGF expression in PH region. There were several correlations found in nulliparous group, the most relevant were membrane weight and neonatal parameters such as weight (r=0,598), thoracic perimeter (r=0,775), time to nurse (r=0,553) and gestational length (r=-0,527) and also mares thoracic perimeter with time to rupture the umbilical cord (r=0,564), suckle reflex (r=0,625), time to stand (r=0,756) and to achieve sternal recumbency (r=-590). Likewise, for the 2 to 5 deliveries group, neonates that were born heavier, taller and with greater thoracic perimeter took less time to stand (r=-0,546; r=-0,869, r=-0,892), pass meconium (r=-0,535) and rupture the umbilical cord (r=-0,528; r=-0,881). In the group of mares between 6 and 10 deliveries, foals weight was correlated to maternal weight (r=0,793), thoracic perimeter (r=0,716) and height (r=0,667). Total PH volume correlated to total parenchyma (r=-0,816) and epithelium in placental villi in PH (r=-0,915), gestational lenght (r=-0,483), time to suckle reflex (r=- 0,672), to nurse (r=-0,525), and pass meconium (r=-0,525). Regarding Paternal variables, paternal weight correlated to total parenchyma volume in placental villi of the CtH (r=0,393). Also thoracic perimeter of the stallion correlated to neonatal weight (r=0,316) thoracic perimeter (r=0,425) and total volume of the PH (r=0,319). Therefore, these data provides rationale for an adequate choice of mares and stallions to generate well-developed neonates.

O objetivo deste trabalho foi buscar genes MHC classe I em bovinos expressos durante o desenvolvimento embrionário e gestação que apresentassem similaridade ao gene Ped murino. Para tanto, embriões de PIV e placentas de fetos produzidos por monta natural ou clonados tiveram seu RNA extraído. A partir do RNA extraído foi realizada a produção de cDNA para tentar o isolamento de fragmentos com similaridade ao gene descrito em murinos. Uma vez isolados, os fragmentos foram purificados ou clonados em plasmídeo. As amostras foram seqüenciadas e as seqüências obtidas foram avaliadas, editadas e comparadas a outras seqüências pelo programa BLAST. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada em embriões (D7) e nas amostras de placenta utilizando anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC. A seqüência consenso obtida produziu alinhamentos significantes com os genes do complexo Bola que faz parte do MHC classe I bovino. O alinhamento entre a seqüência consenso e as seqüências de Q7 (Ped) e HLA-G publicados anteriormente demonstrou poucas variações de nucleotídeos entre as seqüências. As amplificações de cDNA de embriões que atingiram o quarto ciclo celular em até 48 hpi (R8) e em 48-90 hpi (L8) e de embriões que atingiram o estádio de blastocisto expandido em 7 dias de cultivo (RR) e em 9 dias de cultivo (RL) mostraram que o fragmento cuja seqüência apresenta alta similaridade ao gene Ped, está presente em embriões RR e RL, mas não em embriões no estádio de 8 células. Em placentas, o resultado da PCR mostrou a amplificação de oito fragmentos em diferentes fases da gestação. O sequenciamento dos fragmentos gerou nove seqüências consenso similares ao gene Ped e também a seqüências obtidas a partir de embriões bovinos. O alinhamento das seqüências mostrou a existência de duas isoformas contendo edição alternativa no exon 2 ou no exon 3. O resultado indicou a existência de polimorfismo ou mais de um gene com alta similaridade ao gene Q7 sendo transcritos durante o período gestacional. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada na membrana de células do trofoblasto e da MCI de embriões e na porção materno fetal de placentas, com uma maior expressão na porção fetal. Placentas oriundas de fetos clonados apresentam maior fluorescência comparada àquelas oriundas de monta natural. Este trabalho identificou, em embriões bovinos, um possível gene homólogo ao Ped murino e a expressão de proteína semelhante àquela codificada por este gene e conclui que existem vários transcritos com similaridade ao gene Q7 sendo expressos na região materno-fetal da placenta, durante a gestação em bovinos, assim como nos embriões / The aim of the present work was to identify bovine MHC class I genes similar to the murine Ped gene expressing during embryonic development and pregnancy. Bovine in vitro produced embryos and placentas obtained from natural mating or cloning-derived fetuses had their RNA extracted. cDNA was synthesized to isolate fragments showing similarity with the gene described in mice. Once isolated the fragments were purified or cloned into plasmids. The samples were sequenced and obtained sequences edited and compared to other sequences by means of the BLAST software. The expression of MHC-Ib protein was evaluated in embryos (D7) and in placentas using a FITC conjugated mouse monoclonal antibody anti-Qa-2. The consensus sequence amplified from blastocyst cDNA produced significant alignments with genes of the Bola complex, which is part of the bovine MHC class I. The alignment between the consensus sequence and the previously published Q7 and HLA-G sequences demonstrated little nucleotide variations among the sequences. The cDNA amplifications of embryos at the fourth cellular cicle in 48hpi (F8); 48-90hpi (S8) and embryos that reached blastocyst expanded stage in 7 days (FF); in 9 days (FS) showed that the Ped candidate gene is present in FF and FS but not in 8-cell embryos. In placentas, the PCR resulted in amplification of eight fragments at different pregnancy stages. Sequencing of the fragments generated nine consensus sequences, similar to the Ped gene and also to sequences obtained from bovine embryos. The alignment of the sequences showed the existence of two isoforms containing an alternative splicing on exon 2 or 3. This result indicates the existence of polymorphisms or that more than one gene with high similarity to the Q7 gene are transcribed during pregnancy. Expression of MHC-Ib protein was verified in trophoblast membrane and embryos inner cell mass cells and in the maternal-fetal portion in placentas, with a greater expression in the fetal portion. Cloned fetuses placentas presented grater fluorescence compared to natural mated. Overall this work identified in bovine embryos a possible gene homologous to the murine Ped and the expression of protein similar to that coded by this gene and concluded that there are many transcripts similar to the Q7 gene being expressed in the maternal-fetal region of the placenta during pregnancy in bovine and such as in embryos

O bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico) é um dos fatores envolvidos na organogênese placentária. O fator participa da regulação dos processos de angiogênese, de crescimento e desenvolvimento placentário e de proliferação e diferenciação das células placentárias. A homeostase tecidual requer balanço entre proliferação e morte celular. A identificação de células em atividade proliferativa pode ser feita pela detecção do antígeno Ki-67 presente no núcleo das células em proliferação. Objetivou-se estudar a distribuição espaço-temporal do bFGF e dois de seus receptores, FGFR1 e FGFR2, na placenta bubalina correlacionando-a à proliferação celular. Foram utilizadas treze placentas de fêmeas da espécie bubalina em diferentes fases da gestação, divididas em quatro grupos. Grupo 1 (n=4), placentas de 3 meses; grupo 2 (n=4), 5 meses; grupo 3 (n=1), 8 meses e grupo 4 (n=4), 9,5 meses. Para a detecção da proteína do bFGF, FGFR1 e FGFR2 bem como do antígeno Ki-67 foram realizados testes de imuno-histoquímica. Para tal, bloqueou-se a peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio PA a 1% em metanol e as reações inespecíficas com soro eqüino. A incubação com os anticorpos primários anti-Ki-67, anti-bFGF, anti-FGFR1 e anti-FGFR2 foi feita a 4°C por vinte e quatro horas e a incubação com o anticorpo secundário universal por vinte minutos em temperatura ambiente. Foi utilizado um complexo avidina-biotina para amplificar a reação e para revelação utilizou-se Nova Red&reg;. A análise dos resultados foi feita em microscópio óptico em aumento de 400 vezes através do sistema de imagens KS-400. Utilizou-se o programa Graph Prism 4 para análise estatística dos resultados. Foi detectada a expressão da proteína do bFGF e seus receptores no núcleo e citoplasma de células do estroma e epitélio maternos e fetais da placenta bubalina de maneira tempo-dependente ao longo da gestação. A atividade proliferativa apresentou perfil decrescente do início até o final da gestação. A correlação observada entre a expressão do bFGF e do Ki-67 nas células do epitélio materno e fetal e estroma materno foi positiva (r = 0,282, r = 0,313 e r = 0,469, respectivamente; p < 0.05); entre FGFR1 e Ki-67 a correlação foi mais elevada para as células do estroma e epitélio maternos e estroma fetal (r = 0,739, r = 0,511 e r = 0,358; p<0,0001) e negativa para o epitélio fetal (r = -0.211); FGFR2 e Ki-67 a correlação foi negativa para as células epitélio materno (r = -0,027) e positiva para o epitélio e estroma fetal (r = 0,384 e r = 0,268; respectivamente; p < 0.05). Pode-se concluir a partir dos resultados obtidos que existe uma correlação positiva entre a expressão da proteína do bFGF de seus receptores 1 e 2 e o antígeno Ki-67. No entanto, essa correlação é dependente do tipo celular e da fase de gestação analisadas, e aponta para um possível envolvimento do bFGF e seu receptor 2 na proliferação do trofoblasto enquanto o receptor 1 modularia a ação de outro agente proliferativo no epitélio materno e estromas materno e fetal. / The bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) is involved in the placental organogesis as a potent angiogenic molecule and is related to the growing and development of the placenta and proliferation of placental cells. Tissue homeostasis requires a balance between cell proliferation and cell death. The identification of proliferating cells can be made through the detection of Ki-67 nuclear antigen, present in these cells. The aim of this study was to evaluate the space-temporal expression of bFGF and two of its receptors, FGFR1 and FGFR2, in buffalo placenta in correlation to proliferative activity. In this study 13 buffalo placentas in different gestational phases were collected and divided into four groups. Group 1 (n=4), three moth-old placentas; group 2 (n=4), five month-old; group 3 (n=1), eight month-old and group 4 (n=4), 9.5 month-old. For the localization of bFGF, FGFR1, FGFR2 proteins and Ki-67 antigen, immunohistochemical assays were carried out. For that purpose, endogenous peroxidase activity was blocked with 1% Hydrogen Peroxide PA in methanol and non-specific binding with equine serum (1:10). Incubations with primary antibodies anti-Ki-67, anti-bFGF, anti-FGFR1 and anti-FGFR2 were made for 24 hours at 4°C. Incubation with universal secondary antibody (1:200) was made for 20 minutes in moist chamber at room temperature. Avidin/biotinylated horseradish ABC Elite Kit was used to amplify and Nova Red&reg; to develop the immunostaining. Slides were observed under a light microscope at 400 times magnification and photographed with KS-400 image program. Graph Prism 4.0 program was used for statistical analysis. Expression of the bFGF and its receptors proteins was detected in the nucleus and cytoplasm of buffalo placental cells during gestation. Placental proliferative activity was evaluated through the expression of Ki-67 antigen. The correlation observed between bFGF and Ki-67 expression in the maternal and fetal epithelium and maternal stroma cells was positive (r = 0,282, r = 0,313 e r = 0,469, respectively; p < 0.05). Between FGFR1 and Ki-67 the correlation was higher for maternal epithelial and stroma and fetal stroma cells (r = 0,739, r = 0,511 e r = 0,358, respectively; p<0,0001) and negative for fetal epithelium (r = -0.211). FGFR2 and Ki-67 correlation observed was negative for maternal epithelium cells (r = -0,027) and positive for fetal epithelium and stroma cells (r = 0,384 e r = 0,268; respectively; p < 0.05). We conclude that bFGF and its receptors 1 and 2 are positively correlated to the expression of the Ki-67 antigen, depending on cell type and gestational period. The results suggest that bFGF and its receptor 2 may be involved in the modulation of trophoblast proliferation, whereas FGFR1 may modulate proliferation in the maternal epithelium and fetal and maternal stroma, probably through the binding to another growth factor (s).

A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.

A família dos VEGFs é a principal responsável pela angiogênese aumentando a neovascularização e a permeabilidade da interface endometrial/placentária. O estudo comparativo da distribuição temporal do sistema VEGF na placenta de cães e de bovinos, que apresentam diferenças tanto na sua estrutura como na sua função, pode contribuir para esclarecer o papel deste sistema ao longo da gestação. Amostras da cinta placentária de cadelas (nos dias 20, 40 e 60 de gestação) foram coletadas assim como amostras de placentomas bovinos (dias 90, 150, 210 e 270 da gestação). As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em -80ºC até serem homogeneizadas, ou fixadas em solução de formol tamponado e embebidas em paraplast usando os procedimentos convencionais. Foi realizado Western Blotting para a quantificação do sistema VEGF utilizando-se anticorpos específicos combinados com um sistema amplificador de quimio-luminescência: ECL®. A imuno-histoquímica para a localização do Flt-4 canino foi realizada de acordo com o método ABC, utilizando o Nova Red® como cromógeno. Na placenta bovina, o VEGF apresentou uma alta expressão no início da gestação seguida por queda que se manteve deste até o termo. O Flt-1, o KDR e o Flt-4 demonstraram uma alta expressão no início e no meio da gestação, e um declínio em sua expressão ao final da mesma. Na placenta canina, a proteína do VEGF e do Flt-1 apresentaram uma elevada expressão no início da gestação, a qual diminuiu na metade e assim se manteve até o final da gestação, enquanto o KDR demonstrou uma alta expressão no início e no meio da gestação, e um decréscimo em sua expressão próximo ao termo. A proteína do Flt-4 foi localizada nas regiões do labirinto placentário, do corion frouxo e do alantocorion e sua expressão variou nos diferentes compartimentos ao longo da gestação. A expressão similar do sistema VEGF e do Flt-4 em ambas as espécies estudadas sugere que estas proteínas apresentem funções similares tanto na placenta bovina como canina. / The VEGF family is known to be responsible for the angiogenesis increasing blood vessels number and permeability in the endometrial/placentary interface. A comparative study of VEGF system temporal distribution in canine and bovine placentas, which present very well described differences in structure and function, will contribute to better define the role of this system along pregnancy. Samples from placental belt of pregnant bitches (on days 20, 40 and 60) were collected as well as bovine placentomes samples (from days 90, 150, 210, 270 of gestation). All samples were frozen in liquid nitrogen and stored at -80º C until processed, or fixed in buffered formalin solution and embedded in paraplast using conventional procedures. Western Blotting for VEGF system quantification was carried out using specific antibodies combined to an amplification quimio-luminescence system: ECL®. Immunohistochemistry for canine Flt-4 demonstration was performed according to the ABC method using NovaRed® as chromogen. In the bovine placenta, VEGF demonstrate a higher expression in early gestation, which decreased at mid-gestation and remained so until term. Flt-1, KDR and Flt-4 demonstrated a constant expression in early and mid-gestation, and a decrease in the end of pregnancy. In the dog placenta, VEGF and Flt-1 proteins show an increased expression in early gestation, and a decreased expression at mid and late gestation; while KDR demonstrated an increased expression at early and mid-gestation, and a decreased expression near term. Flt-4 protein is localized in placental labyrinth, chorion and allantochorion. Similar expressions of these proteins in both species, that present considerable differences in placenta structure and function, suggest that VEGF system and Flt-4 play similar roles in the bovine and canine placenta.

Na inativação do cromossomo X (ICX) um dos dois cromossomos X presentes nas fêmeas de mamíferos placentários é silenciado transcricionalmente. Esse é um mecanismo de compensação de dose que assegura que a quantidade dos produtos gênicos oriundos do cromossomo X esteja em equilíbrio entre machos e fêmeas. A ICX pode ocorrer de modo aleatório, onde cada célula escolhe ao acaso qual será o cromossomo X inativado: cromossomo X paterno ou cromossomo X materno; ou de forma \"imprintada\" (termo adaptado do inglês imprinted), ou seja, dependente da origem parental do cromossomo X. Enquanto nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma \"imprintada\", sendo o X paterno inativado em todos os tecidos, nos mamíferos eutérios a ICX nos tecidos somáticos ocorre de modo aleatório. Porém alguns eutérios mantiveram o mecanismo \"imprintado\" de ICX exclusivamente nos tecidos extraembrionários, como ratos e camundongos. Em humanos, o estado controverso da ICX em tecidos extraembrionários foi reavaliado por nosso grupo utilizando uma análise mais ampla e identificou-se um padrão aleatório (Moreira de Mello et al., 2010), demonstrando a importância de se realizar uma análise global para se determinar o perfil de atividade do cromossomo X. Em bovinos o padrão de ICX em placenta não está claro. Ele foi verificado analisando-se a expressão de um único gene, e os autores concluíram que o padrão era \"imprintado\" (Xue et al., 2002). Porém a análise de um único gene pode não representar o estado epigenético de um cromossomo inteiro. Assim o padrão de ICX em tecidos extraembrionários bovinos se mostra uma questão importantíssima para ser esclarecida. No presente trabalho o cromossomo X bovino foi analisado em busca de SNPs (polimorfismos de base única) localizados em regiões codificadoras em genes expressos no tecido extraembrionário, permitindo assim através da análise da expressão alelo-específica determinar o padrão de expressão do cromossomo X. Os resultados apresentados neste trabalho mostram um padrão de expressão bialélica, indicando que em populações diferentes de células, diferentes cromossomos X estavam ativos. Portanto a ICX em tecidos extraembrionários bovinos ocorre de modo aleatório, padrão semelhantes àquele encontrado em humanos, e diferente daquele encontrado em ratos e camundongos. Este trabalho mostra a importância de uma análise global da expressão gênica no cromossomo X, permitindo assim traçar um perfil de atividade mais próximo possível da realidade. / In X chromosome inactivation (XCI), one of the two X chromosomes present in female mammals is transcriptionally silenced, resulting in a dosage compensation mechanism. The XCI can occur randomly, so that each cell chooses randomly which one will be the inactivated X chromosome: paternal (pX) or maternal (mX); or dependent on parental origin of X chromosome, ie, imprinted. While in female marsupials the inactivation occurs in an imprinted fashion, with the Xp inactivated in all tissues, both somatic and extra-embryonic, in the mammalian eutherians XCI in the somatic tissues occurs randomly. However some eutherians still retain the imprinted XCI mechanism exclusively in extra-embryonic tissues, such as rats and mice. In humans, the controversy of the XCI in placenta was re-evaluated by our group. Using a broader analysis, a random pattern was identified, in contrast to the previously published works. It demonstrated the importance of conducting a comprehensive analysis to determine the profile of X chromosome (Moreira de Mello et al., 2010). In cattle the pattern of XCI in bovine placenta is unclear. It was verified by analyzing the expression of a single gene, and the authors concluded that the pattern was imprinted (Xue et al., 2002). Because the analysis of a single gene may not represent the epigenetic state of an entire chromosome, the pattern of XCI in cattle extra-embryonic tissues is an important issue to be clarified. In the present study the cattle X chromosome was analyzed searching for SNPs (single nucleotide polymorphisms) located in coding regions of genes expressed in extra-embryonic tissue. So that, by analyzing the allele-specific expression it is possible to determine the X chromosome expression patter. The preset results show a bi-allelic expression pattern. This indicates that in different cells populations, different X chromosomes are active. Thus, the XCI in extra-embryonic tissues of bovines occurs randomly, similar to the human pattern but different to that verified in rats and mice. This work shows the importance of a global analysis of the gene expression in X chromosome, through which it can trace the closest activity profile as possible to reality.

Pang, Weng I. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2008. / Includes bibliographical references (leaves 116-148). / Abstracts in English and Chinese. / ABSTRACT --- p.i / 摘要 --- p.iv / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.vi / PUBLICATIONS --- p.vii / TABLE OF CONTENTS --- p.viii / LIST OF TABLES --- p.xiii / LIST OF FIGURES --- p.xv / LIST OF ABBREVIATIONS --- p.xvi / Chapter SECTION I: --- BACKGROUND --- p.1 / Chapter CHAPTER 1: --- CIRCULATING NUCLEIC ACIDS IN PRENATAL DIAGNOSIS --- p.2 / Chapter 1.1 --- Prenatal diagnosis --- p.2 / Chapter 1.2 --- Circulating fetal DNA in maternal plasma --- p.2 / Chapter 1.2.1 --- Biology of circulating fetal DNA --- p.2 / Chapter 1.2.2 --- Clinical applications of circulating fetal DNA --- p.3 / Chapter 1.2.2.1 --- Qualitative fetal-specific sequence detection --- p.4 / Chapter 1.2.2.2 --- Quantitative aberration detection --- p.4 / Chapter 1.2.3 --- Circulating fetal epigenetic markers --- p.5 / Chapter 1.3 --- Circulating fetal RNA in maternal plasma --- p.6 / Chapter 1.3.1 --- Biology of circulating fetal RNA --- p.6 / Chapter 1.3.2 --- Clinical applications of circulating fetal RNA --- p.8 / Chapter 1.3.2.1 --- Quantitative aberration detection --- p.8 / Chapter 1.3.2.2 --- Chromosomal aneuploidy detection --- p.9 / Chapter 1.3.3 --- Enrichment of fetal RNA --- p.10 / Chapter 1.4 --- Circulating microRNA in maternal plasma --- p.10 / Chapter CHAPTER 2: --- FETAL GROWTH AND WELL-BEING --- p.12 / Chapter 2.1 --- Normal fetal growth --- p.12 / Chapter 2.1.1 --- Role of the mother --- p.12 / Chapter 2.1.2 --- Role of the placenta --- p.12 / Chapter 2.1.3 --- Role of the fetus --- p.13 / Chapter 2.1.4 --- Role of the somatotrophic axis --- p.15 / Chapter 2.2 --- Abnormal fetal growth --- p.15 / Chapter 2.2.1 --- Intrauterine growth restriction --- p.16 / Chapter 2.1.2 --- Definition of IUGR --- p.16 / Chapter 2.2.3 --- Risk factors of IUGR --- p.17 / Chapter 2.2.4 --- Diagnosis of IUGR --- p.20 / Chapter 2.2.4.1 --- Biometric tests --- p.20 / Chapter 2.2.4.2 --- Biophysical tests --- p.21 / Chapter 2.2.4.3 --- Biochemical tests --- p.22 / Chapter 2.2.4.4 --- Others --- p.22 / Chapter 2.3 --- Limitations of current modalities in fetal growth assessment --- p.23 / Chapter 2.4 --- Aims of this thesis --- p.24 / Chapter SECTION II: --- MATERIALS AND METHODS --- p.26 / Chapter CHAPTER 3: --- QUANTITATIVE ANALYSIS OF CIRCULATING RNA --- p.27 / Chapter 3.1 --- Sample collection and processing --- p.27 / Chapter 3.1.1 --- Preparation of plasm a --- p.27 / Chapter 3.1.2 --- Preparation of blood cells --- p.27 / Chapter 3.1.3 --- Preparation of placental tissues --- p.27 / Chapter 3.2 --- Total RNA extraction --- p.28 / Chapter 3.2.1 --- Plasma and blood cells --- p.28 / Chapter 3.2.2 --- Placental tissues --- p.32 / Chapter 3.3 --- Quantitative measurements of nucleic acids --- p.32 / Chapter 3.3.1 --- Principles of real-time quantitative PCR --- p.33 / Chapter 3.3.2 --- One-step QR T-PCR assays for placental mRNA quantification --- p.3 7 / Chapter 3.3.3 --- QPCR assays for checking genomic DNA contamination --- p.43 / Chapter 3.4 --- Statistical analysis --- p.45 / Chapter SECTION III: --- EVALUATION OF PLACENTA-DERIVED MRNA AS POSSIBLE MARKERS FOR FETAL GROWTH ASSESSMENT --- p.46 / Chapter CHAPTER 4: --- SELECTION OF POTENTIAL FETAL GROWTH MRNA MARKERS FOR MATERNAL PLASMA DETECTION --- p.47 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.47 / Chapter 4.2 --- Materials and methods --- p.49 / Chapter 4.2.1 --- Sample collection and processing --- p.49 / Chapter 4.2.2 --- Experimental design --- p.49 / Chapter 4.2.3 --- RNA extraction and quantification --- p.51 / Chapter 4.2.4 --- Statistical analysis --- p.51 / Chapter 4.3 --- Results --- p.52 / Chapter 4.3.1 --- Identification of potential fetal growth mRNA markers in maternal plasma --- p.52 / Chapter 4.3.2 --- Development of real-time QR T-PCR assays --- p.56 / Chapter 4.3.3 --- Validation of maternal plasma detectability and pregnancy-specificity --- p.58 / Chapter 4.3.4 --- Assessment of the gestational trend in maternal plasma --- p.64 / Chapter 4.4 --- Discussion --- p.68 / Chapter CHAPTER 5: --- RELATIONSHIP BETWEEN CIRCULATING PLACENTAL MRNA AND FETAL GROWTH --- p.72 / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.72 / Chapter 5.2 --- Materials and methods --- p.73 / Chapter 5.2.1 --- Sample collection and processing --- p.73 / Chapter 5.2.2 --- "Ultrasound measurement, placental weight and birth weight.…" --- p.74 / Chapter 5.2.3 --- Experimental design --- p.74 / Chapter 5.2.4 --- RNA extraction and quantification --- p.75 / Chapter 5.2.5 --- Statistical analysis --- p.75 / Chapter 5.3 --- Results --- p.75 / Chapter 5.3.1 --- Expression of potential growth markers in placental tissues --- p.76 / Chapter 5.3.2 --- Relationship between circulating placental mRNA and birth measurements --- p.76 / Chapter 5.3.3 --- Relationship between circulating placental mRNA and fetal biometric measurements --- p.77 / Chapter 5.4 --- Discussion --- p.85 / Chapter SECTION IV: --- CLINICAL APPLICATION OF POTENTIAL FETAL GROWTH MARKERS IN THE ASSESSMENT OF IUGR --- p.93 / Chapter CHAPTER 6: --- QUANTITATIVE ANALYSIS OF PLACENTAL MRNA IN IUGR WITH OR WITHOUT PET --- p.94 / Chapter 6.1 --- Introduction --- p.94 / Chapter 6.2 --- Materials and methods --- p.95 / Chapter 6.2.1 --- Sample collection and processing --- p.95 / Chapter 6.2.2 --- Experimental design --- p.96 / Chapter 6.2.3 --- RNA extraction and quantification --- p.96 / Chapter 6.2.4 --- Statistical analysis --- p.97 / Chapter 6.3 --- Results --- p.97 / Chapter 6.3.1 --- Cross-sectional comparison of placental mRNA concentrations --- p.97 / Chapter 6.3.2 --- Longitudinal comparison of placental mRNA concentrations --- p.102 / Chapter 6.4 --- Discussion --- p.103 / Chapter SECTION V: --- CONCLUDING REMARKS --- p.107 / Chapter CHAPTER 7: --- CONCLUSION AND FUTURE PERSPECTIVES --- p.108 / Chapter 7.1 --- A strategy for identifying circulating placental MRNA markers for fetal growth assessment --- p.108 / Chapter 7.2 --- Implications of mRNA marker development strategy --- p.111 / Chapter 7.3 --- Prospects for future work --- p.112 / REFERENCES --- p.116