Neste trabalho realizamos a análise macroscópica das estruturas do funículo umbilical e da placenta, a análise macroscópica da vascularização funicular e placentária, e a análise à microscopia de luz dos componentes funiculares da paca, procurando melhor conhecer a morfologia reprodutiva desta espécie. Para tanto, utilizamos nove pacas fêmeas, provenientes do Setor de Animais Silvestres do Departamento de Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal - UNESP, nos estágios inicial, intermediário e final de prenhez, os animais tiveram o corno uterino gestante retirado cirurgicamente. Com o útero aberto identificamos as membranas fetais e fizemos a mensuração do funículo umbilical e da distância céfalo-coccígea fetal, em seguida identificamos os vasos funiculares que foram injetados com látex do tipo Neoprene corado com pigmento específico; após injeção, esses vasos foram dissecados para a visualização da disposição das artérias e veias na placenta. Três animais foram direcionados à análise microscópica do funículo umbilical que depois de colhido foi seccionado em porções proximal, intermediária e distal que foram fixadas e sofreram processamento histológico usual com posterior colorações em hematoxilina- eosina e tricromico de Masson. Constatamos nestes animais uma placenta de formato discoidal globoso e as membranas fetais constavam de cório-alantóide e âmnio. As médias das medidas dos comprimentos dos funículos umbilicais e das distâncias cefalococcígeas foram de 7,31cm e 14,5 cm respectivamente. Macroscopicamente observamos no funículo umbilical a presença de duas artérias umbilicais, uma veia umbilical, o alantóide, vasos onfalomesentéricos; microscopicamente, observamos que as artérias e veias umbilicais eram musculares, o ducto alantóide era constituído por epitélio bi-estratificado cúbico e, essas estruturas, juntamente com os vasos onfalomesentéricos estavam englobadas pela gelatina de Wharton, também se observou a presença de vasa vasorum. A dissecação dos vasos umbilicais injetados indicou que as veias se localizavam basicamente na periferia da placenta enquanto as artérias ocupavam posição centralizada. / On this research we peform the macroscopic analysis of the umbilical cord and placenta structure, the macroscopic analysis of umbilical cord and placenta valcularization, and analysis with light microscopy of umbilical cords constituents of paca, aiming to increase the knowledge about the reproductive morphology in this species. To achieve that we used nine female pacas, which came from the Wild Animal Sector of the Zootechnology Departament at the Faculty of Agrarian and Veterenary Sciences of Jaboticabal - UNESP -, in early, entermediary and late phases of pregnancy. The animals had their pregnanty uterine horn taken out on surgery. After opening the uterus, we identified the fetal membranes and measured the umbilical cord and the cephalococcyga distance. Than we identified the umbilical cords vessels with were injected with latex (Neoprene®) dyed by specific pigment; after the injections, the vessels were dissected for visualization of the disposition of arteries and veins in the placenta. Three animals were carried out to microscopic analysis of the umbilical cord that , after the collect, was sectioned in proximal, intermediary and distal portions wich were set and than went to an usual histological processing with furthering colorations with hematoxilin-eosin and Masson tricome method. In these animals we noticed a discoid globular placenta, and the fetal membranes were constituted by chorion-alantois and amnion. The averages of the umbilical cords length and the crown-rump distance were 7,31 cm and 14,5 cm respectively. Macroscopically, we noticed the presence of two umbilical cord arteries, one umbilical cord vein, the allantois and onfalomesenteric vessels; microscopically, we noticed that the umbilical cord arteries and veins were muscly, the alantoic duct was formed by a cubic double layer epthelium and this sctructures, together with the onfalomezenteric vessels, were surrounded by the Wharton´s gelatin. The presence of vasa vasorum was also observed. The dissection of the injected umbilical cord vessels pointed that veins were basically placed that the placenta periphery and arteries presented a central position.

Os bovinos são considerados a maior fonte de proteína animal para o homem, razão pela qual se fazem imprescindíveis pesquisas em diversas áreas de produção desses animais com o intuito de minimizar problemas que possam interferir no desenvolvimento e produtividade dos rebanhos. Nesse cenário, o estudo da placenta e placentação tem por objetivo conhecer o desenvolvimento embrionário e suas interações fisiológicas entre o feto e o organismo materno, caracterizado pela íntima união entre eles. O estudo da placenta e placentação tem por objetivo conhecer o desenvolvimento embrionário e suas interações fisiológicas entre o feto e o organismo materno, caracterizado pela íntima união entre eles. Além disso, a falta de marcadores específicos para células placentárias bovinas e as alterações que essas células sofrem durante o progresso da gestação são as principais barreiras para a determinação do perfil morfológico celular presente na interface materno-fetal, razão pela qual seu monitoramento torna-se importante. Buscando melhor compreender essas mudanças, o presente trabalho estudou a dinâmica populacional de células de placenta bovina a fresco e em cultivo. Foram utilizadas 30 amostras de placentônios, divididos em três grupos, de acordo com o desenvolvimento da gestação, quais sejam: primeiro, segundo e terceiro trimestres (n:10 para cada terço). Células oriundas de placentônios foram examinadas a fresco e pós-cultivo durante dez dias, pela microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e citometria de fluxo. Os resultados deste trabalho demonstraram a presença de tipos morfológicos celulares distintos na dependência do progresso da gestação: células gigantes trofoblásticas binucleadas, células gigantes trofoblásticas trinucleadas, células gigantes trofoblásticas mononucleadas, células mononucleadas maiores, células mononucleadas menores e células que apresentam citoplasma amplo, contendo inúmeras vesículas em seu interior. Com a utilização da citometria de fluxo, foi possível identificar nas amostras a fresco três populações distintas em tamanho (FSC) e complexidade (SSC) no primeiro terço, cinco populações no segundo terço e duas populações no terceiro terço gestacional. As células placentárias bovinas apresentaram freqüências variáveis de acordo com o trimestre gestacional e seu tempo de cultivo. / There is a great diversity of cell types in the bovine placenta like mononucleate trophoblast giant cells, binucleate trophoblast giant cells, specialized leucocytes (uterine natural killer, uterine macrophages, etc.) and part of their characterization and function remains unknown or controversial. Besides that, some of these cells change as pregnancy progresses; thus their monitoring is very important. The lack of specific markers to bovine placental cells is a main barrier for the development of an efficient cell tracing. Alternative techniques are being used to study these cells, as well as morphologic observation by optical and electron microscopy methods. The study was carried out to establish a populational kinetics of fresh and cultured bovine placental cells by optical microscopy, by electron microscopy and flow cytometry. Bovine placentomas were sampled at the slaughterhouse from cows with different trimesters of pregnancy (n:10 each). Fragments from the cotiledonary/caruncular interface were collected and cells were mechanically dissociated and their viability was estimated by Trypan Blue exclusion. After that they were incubated (2,5x107 cells per 2 mL) in Dulbecco´s Modified Eagle Medium with 10% FBS. First of all, fresh bovine placental cells analyzed by flow cytometry in order to identity the profiles of populational cells. At the same time, smear of fresh cells was made, fixed by methanol, stained with Giemsa for optical microscopy morphologic analisys and differential counting. After this, cells were analised by flow cytometry and optical microscopy .This process was repeated on the first, fifth and tenth days of the culture. We found seven types of cell: mononucleate trophoblast giant cells, binucleate trophoblast giant cells, trinucleate trophoblast giant cells, large mononucleate cells and small mononucleate cells. The placental cells displayed different frequencies according to the gestation period and culture time length.

O VEGF é um fator mitogênico específico de células endoteliais que promove diferenciação celular materno-fetal placentária quando ligado a seus receptores (Flt-1 e KDR). Sua expressão é controlada por mecanismos autócrinos e parácrinos e está associada ao desenvolvimento da placenta. A placenta bovina foi utilizada como modelo de estudo por apresentar a facilidade de se avaliar os componentes do sistema VEGF em diferentes fases gestacionais. Como objetivo este estudo buscou analisar o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e seus receptores através da técnica de PCR em tempo real no início, meio e fim de gestação. Para tanto, amostras de placentomas, região interplacentomal e corpo lúteo foram coletadas em diferentes fases gestacionais. Foram utilizados placentomas de animais clonados obtidos apenas aos 270 dias de gestação e estas amostras foram comparadas aos animais não clonados na mesma fase. A expressão do VEGF no placentoma apresentou um decréscimo (p < 0.05) no final da gestação (270 dias) em relação à expressão do VEGF aos 90 dias. A expressão do Flt-1 e do KDR na região interplacentomal foi semelhante desde os 45 até 90 dias de gestação e apresentou um aumento significativo (p < 0.05) aos 150 dias. No corpo lúteo gestacional, a expressão do VEGF aos 210 dias foi maior (p ≤ 0.05) em relação a 90 e 150 dias; observou-se também baixa expressão do KDR aos 90 dias de gestação (p < 0.05) em relação aos 210 dias. Pode-se concluir que a regulação da expressão do VEGF variou em relação aos seus receptores nos três tecidos avaliados. Placentomas de bovinos clonados não apresentaram diferenças significativas em relação à expressão do sistema VEGF se comparados aos placentomas de animais não clonados sugerindo ser esta expressão equivalente em placentas de animais clonados que vieram a termo. / The VEGF is a specific endothelial mitogenic factor that promotes feto-maternal cell differentiation in placenta through binding to its receptors (Flt-1 and KDR). Their expression is controlled by autocrine and paracrine mechanisms that are associated to placenta development. The bovine placenta was used in this study as a model due to easiness of evaluation of VEGF system components in different phases of pregnancy. The objective of this study was to analyze the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors expression using the real time PCR technique in the beginning, half and end of pregnancy. Furthermore, placentome samples, interplacentomal areas and corpus luteum were collected in different gestational phases for comparative studies. Placentome of cloned animals were analyzed at 270 days of pregnancy and compared to non-cloned animals in the same phase. The expression of VEGF in the placentome presented a decrease of expression (p < 0.05) in the end of the gestation (270 days) in relation to 90 days. The expression of Flt-1 and of KDR in interplacentomal area was similar from 45 to 90 days of pregnancy with a significant increase (p <0.05) observed at 150 days. In the gestational corpus luteum, the expression of VEGF at 210 days was higher (p ≤ 0.05) in comparison to 90 and 150 days. In the same tissue KDR expression at 90 days was lower (p < 0.05) in relation to 210 days. In conclusion the regulation VEGF varied in relation to its receptors expression in all three studied tissues. Cloned placentomes showed no significant differences in VEGF system expression compared to the placentome of non-cloned animals, suggesting there is an equivalent expression in placentas from cloned animals that came to term.

Linfócitos e macrófagos são os principais tipos de leucócitos envolvidos no processo de tolerância materno-fetal. Os linfócitos são divididos em sub-populações de acordo com sua função e fenótipo, apesar de serem morfologicamente semelhantes. Seus tipos incluem os linfócitos T, linfócitos B e natural killers (NK). Macrófagos são células que derivam da migração dos monócitos sangüíneos para o tecido. Na placenta, os macrófagos desempenham um papel importante na regulação da apoptose, prejudicial para o desenvolvimento do embrião, e no processo de apresentação antigênica. Pouco se sabe sobre esses leucócitos na placenta bovina, como sua quantidade e onde estão presentes. Desta maneira, este trabalho tem por objetivo principal identificar as populações de linfócitos e macrófagos presentes na placenta bovina utilizando marcadores específicos e citometria de fluxo. Neste estudo, foram utilizados amostras de placentônios e região intercaruncular de vacas nos três diferentes trimestres da gestação (cinco animais de cada trimestre). As suspensões celulares obtidas foram incubadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD8, anti-(CD14), e anti-CD335 (uNK) e avaliados pela citometria de fluxo. No placentônio, no primeiro trimestre da gestação, a porcentagem média de células marcadas CD3+ foi de 2,37%, CD8+, 2,39%, CD14+, 1,16% e CD335+, 0,78%. Para a região intercaruncular, a porcentagem de células CD3+ foi 3,43%, 4,41% CD8+, CD14+ 3,91% e CD335+ 0,56%. No segundo trimestre gestacional, o placentônio apresentou 0,63% de células positivas para CD3+, 0,62% para CD8+, 0,34% para CD14+ e 0,55% para CD335+. Na região interplacentomal a porcentagem de células marcadas com CD3+ foi 1,59%, 1,25% para CD8+, 0,38% para CD14+ e 0,39% para CD335+. No terceiro trimestre gestacional, o placentônio apresentou 0,72% de células marcadas para CD3+, 0,75% para CD8+, 1,05% para CD14+ e 0,77% para CD335+. Na região interplacentomal a porcentagem de células marcadas para CD3+ foi 1,59%, 1,50% para CD8+, 0,60% para CD14+ e 0,48% para CD335+. Com base nos resultados apresentados, podemos concluir que a população de leucócitos na 11 placenta bovina é menos numerosa quando comparada às outras espécies como camundongos e humanos, provavelmente pelo tipo de placenta sinepiteliocorial que constitui uma barreira significativa para o sistema imunológico materno, diminuindo drasticamente a exposição do concepto a ele. / Lymphocytes and macrophages are the main types of leukocytes involved in the maternal-fetal process of tolerance. Lymphocytes may be divided in subpopulations according to their function and phenotype, although being morphologically similar. Its types include the T lymphocyte, B lymphocyte and natural killers (NK). Macrophages are cells that derive from the migration of blood monocytes to the tissue. In the placenta, macrophages play an important role in the regulation of apoptosis which is deleterious to the development of the embryo and in the process of antigen presentation. There are very few references regarding the presence and quantity of leukocytes in the bovine placenta, therefore this project aims to identify lymphocytes and macrophages populations in the bovine placenta by using specific markers and flow cytometry. In this study placentomes and interplacentomal regions of cows in the three trimesters of pregnancy (five animals of each trimester) were used. Cells were incubated with the following monoclonal antibodies: anti-CD3, anti-CD8, anti-CD14,) and anti-CD335 (uNK) and evaluated by flow cytometry. In the first trimester of pregnancy, for the placentome, the average percentage of cells marked CD3+ was 2.37%, CD8+ 2.39%, , CD14+ 1.16% and CD335+ 0.78%. For the interplacentomal region the percentage of CD3+ was 3.43%, CD8+ 4.41%, CD14+ 3.91%, and CD335+ 0.56%. In second trimester of pregnancy, the placentome presented 0.63% of cells marked with CD3+, 0.62% of CD8+, 0.34% of CD14+ and 0.55% of CD335+. In the interplacentomal region the percentage of cells marked with CD3+ was of 1.59%, 1.25% of CD8+, 0.38% of CD14% and 0.39% of CD335+. In the third trimester of pregnancy, the placentomes had presented 0.72% of cells marked with CD3+, 0.75% of CD8+, 1.05% of CD14+ and 0.77% of CD335+. In the interplacentomal region the percentage of cells marked with CD3+ was of 1.59%, 1.50% of CD8+, 0.60% of CD14+ and 0.48% of CD335+. Based on the presented results, we can conclude that the leukocytes population in the bovine placenta is less 13 numerous than those described for other species like mouse and human, probably because it is a sinepithelial type placenta that constitutes a significant barrier to the maternal immunological system, diminishing drastically the conceptus antigen exposition to it.

Atualmente, grande parte do onhecimento adquirido sobre reprodução de serpentes, advém de estudos levados a efeito na América do Norte e Europa, com animais de regiões temperadas; e, na Austrália, com Elapídeos tropicais. No presente estudo foram utilizadas dez serpentes fêmeas prenhes de Crotalus durissus (Viperidae) de região neotropical, com o objetivo de descrever e correlacionar a morfologia do corpo lúteo, placenta e estágio fetal. Com isso pode-se inferir também, o tempo de prenhez. As técnicas realizadas para essa descrição e correlação foram: biometria macroscópica das fêmeas e suas estruturas; microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e microscopia eletrônica de varredura. Foram coletados no total 124 corpos lúteos e 116 placentas, onde observou-se que a cascavel possui o corpo lúteo de caráter ovulatório e a placenta do tipo corioalantóica evolvida por uma delgada membrana da casca do ovo. Concluiu-se que o tamanho padrão da superfície dos corpos lúteos para uma prenhez normal é de 18 a 34 mm2 e que há um corpo lúteo para cada ovo, independente se está fertilizado ou atrésico, porém os ovos atrésicos não possuem placenta. Pela primeira vez foi possível visualizar a disposição estrutural dos filamentos calcários em forma de trama na membrana da casca do ovo. Foi inferida uma classificação da placenta em três estágios I, II e III de acordo com a morfologia e aumento das vilosidades apresentadas entre placenta e útero; e a partir da identificação do estágio de desenvolvimento embrionário e fetal pode-se inferir o tempo de prenhez em C. durissus, classificadas em três terços, inicial, médio e final, evidenciando que existe uma correlação entre a evolução dos estágios placentários com desenvolvimento fetal, conforme a evolução gradual da prenhêz / At de present time, great part of snake reproduction knowledge results from researches realized in North America and Europe, with temperate region animals; in Australia with tropical Elapides. At this present research, ten pregnant females of the snake Crotalus durissus (Viperidae), from Neotropical Region, were utilized. The main goal is to correlate the morphology, corpus luteum, placenta and fetal development. Then, it is also easy to deduce the pregnancy time. The techniques performed for this description and correlation were females macroscopic biometry and their structures; light microscopy with hematoxiline-eosine color and electronic scanning microscopy. 124 corpora lutea and 116 placentas were collected. In those samples could be observed that rattlesnakes have an ovulatory corpus luteum and a corioalantoic placenta wrapped by a slender membrane of the eggshell. Clearly the conclusion is that the normal standard size surface corpus luteum for a normal pregnancy is from 18 to 34mm² and that there is a corpus luteum for each egg, independently if it is fertilized or atresic; but, these atresic eggs have not placenta. For the first time it was possible to visualize the structural arrangement of the calcareous filaments in shaped frame in the eggshell membrane. It was inferred a placenta classification in three stages: I, II and III according to the morphology and increased vilosiddes presented among placenta and uterus; and, from the identification of embryonic and fetal development stage we can infer the time pregnancy in C. durissus, classified in three thirds, initial, middle and final, indicating that there is a correlation between the evolution of placental stage with fetal development, as the gradual evolution of pregnancy

O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição das membranas fetais e tecidos maternos, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre o feto e a mãe e pela síntese de hormônios fundamentais para o sucesso da gestação. O crescimento placentário e a nutrição fetal requerem altas taxas de crescimento e diferenciação celular, sendo fundamental um balanço adequado entre proliferação e morte celular das células trofoblásticas placentárias. Estas células possuem propriedades particulares no que diz respeito a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas, porém a atividade proliferativa destas células em diferentes regiões da placenta bovina é desconhecida. Neste estudo, levantamos a hipótese de que as células de diferentes regiões placentárias de bovinos devem apresentar padrões distintos de atividade proliferativa e morte celular, podendo ser algumas regiões mais ou menos responsáveis pelo desenvolvimento fetal ao longo da prenhez. Para testar esta hipótese, analisamos as células de diferentes regiões da placenta e em diferentes estágios gestacionais através de citometria de fluxo e coloração com marcador histoquímico, além de observações macroscópicas e histológicas para avaliar a morfologia da placenta e suas regiões. Foram analisadas as regiões: central e marginal dos placentônios, área interplacentomal, microplacentônios (≤1,0cm) e fusões placentomais. Por meio da citometria de fluxo realizamos uma distribuição das células placentárias nas diferentes fases do ciclo celular, observando a porcentagem de células em proliferação e apoptose. Em nossos resultados, encontramos particularidades macroscópicas, histológicas e metabólicas nas células de cada região placentária. A margem do placentônio apresentou um aumento prematuro de células em apoptose, com um aumento crescente a partir de 170 dias até o final da gestação, sugerindo que nesta região se inicie a desconexão placentomal. As áreas interplacentomais e fusões de placentônios apresentaram um equilíbrio na atividade proliferativa ao longo da gestação, sugerindo que a proliferação celular possua uma menor importância para a homeostase tecidual nestas regiões. Os microplacentônios apresentaram uma atividade proliferativa mais lenta, porém crescente ao longo da gestação, sugerindo pouca contribuição destas estruturas para a liberação placentária. Estes achados estão de acordo com nossa hipótese de que cada região placentária contribui de forma distinta para o crescimento da placenta bovina, cada uma delas participando de maneira particular no processo de maturação e desconexão placentária e no crescimento e nutrição fetal ao longo da gestação. O entendimento das taxas proliferativas e apoptóticas é importante para a compreensão da patogênese das perdas embrionárias e anormalidades no desenvolvimento placentário. A descrição dos processos de proliferação e morte celular em diferentes regiões da placenta de gestações bovinas poderá ajudar a elucidar processos fisiológicos desconhecidos relacionados ao desenvolvimento do concepto e a falhas gestacionais. Espera-se que este estudo forneça elementos essenciais à melhor compreensão do desenvolvimento placentário, estabelecendo padrões de normalidade para cada região da placenta bovina e auxiliando na compreensão dos mecanismos de falhas gestacionais que levam a anormalidades fetais e placentárias, muito comuns em técnicas avançadas de manipulação embrionárias, como a fertilização in vitro, a produção de animais transgênicos e a clonagem animal. / The mammalian placenta is a transitory organ consisting of maternal-fetal tissues union, responsible for nutrient exchange and synthesis of many hormones which are essential for success of the gestation. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and a balance between proliferation and apoptosis in the trophoblastic cells are essential to the placental development. The trophoblastic cells, that form the fetal portion of placenta, has unique properties and a wide range of metabolic, endocrine and angiogenic functions, but the proliferative profile of those cells. In this study we hypothesed that cells from different placental regions on bovine placenta must reveal distinct patterns of proliferative activity and apoptosis, and some regions may be potentially responsible to distinct modulation patterns in fetal growth and nutrition throughout pregnancy. We analyzed cells form different regions of normal bovine placenta, namely the central region of the placentome, the placentomes edges, interplacentomal areas, placentomal fusion, and microplacentomes (≤1.0cm). The cells of those regions were analyzed by flow cytometry and with a histochemical marker, as well as macroscopical and histological analysis. Using flow cytometry we performed the percentage of cells in each cell cycle phase, including apoptosis. Our findings indicated macroscopical, histological and metabolic particularities in different placental region. The edges of the placentome revealed a premature increase in apoptotic cells, with a significantly higher number of apoptotic cells from 170 days of gestation. That suggests this region to be the point of initiation of placentomal detachment in cattle. Interplacentomal areas and placentomal fusions showed no significant variations during pregnancy, suggesting that proliferation is minor importance for tissue homeostasis in those regions. Microplacentomes revealed a lower but an ascending proliferative activity, that suggests the relatively small role of those structures, with microplacentomes not contributing significantly to normal of placental functions and conceptus development during pregnancy. Taken together, the complete understanding of placental apoptotic and proliferative profiles at distinct placental tissue regions during gestation will shed light to unknown physiological processes related to conceptus development, as some regions may be potentially responsible, at different degrees of influence, to distinct modulation patterns in fetal growth and nutrition throughout pregnancy. In that regard, results from the present study using non-manipulated bovine gestations indicated that proliferation and apoptosis exhibit patterns that are specific for the individual placental areas during gestation and at term in normal, non-manipulated pregnancies in cattle. Variations involving proliferation and apoptotic rates may influence placental maturation and detachment, compromising placental functions and leading to fetal stress, abnormalities in development and abortion, as frequently seen in bovine pregnancies from in vitro fertilization and cloning procedures. Our findings describing the pattern of cell proliferation and apoptosis in normal bovine pregnancies may be useful for unraveling some of the developmental deviations frequently seen in nature and after in vitro embryo manipulations.

Matrizes extracelulares descelularizadas (dMEC) têm sido utilizadas com sucesso como biomateriais biológicos para regeneração tecidual, já que apresentam vantagens como semelhança estrutural com os tecidos naturais, biocompatibilidade , biodegradabilidade, capacidade de sinalização e homeostase tecidual. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de quatro protocolos para descelularização de músculo esquelético murino, objetivando a produção de matrizes extracelulares (MEC) acelulares para potenciais aplicações na engenharia de tecidos. Músculos tibiais foram coletados e congelados a -20°C ou armazenados a temperatura ambiente, seguido por descelularização em soluções contendo reagentes químicos EDTA + Tris, SDS e Triton X-100, os quais foram aplicados em diferentes sequências e analisados de acordo com modificações macroscópicas causadas nos tecidos, remoção de conteúdo celular e genético das matrizes e na capacidade de preservar a composição protéica e estrutura tridimensional da MEC. Observou-se a otimização da remoção de conteúdo celular, além da preservação da ultraestrutura e composição da MEC nos protocolos com congelação prévia a -20°C e descelularização inicial com a solução SDS, quando comparado àqueles que iniciaram com EDTA + Tris. O segundo objetivo deste trabalho foi comparar a biocompatibilidade da dMEC de músculo murino e placenta canina em modelo murino de injúria muscular. As dMEC foram produzidas a partir da placenta canina (1% SDS, 5 mM EDTA + 0,05% Tripsina, 1% Triton X-100) e do músculo esquelético tibial de ratos Wistar (Congelação a -20°C, 1% SDS, 5 mM EDTA + 50mM Tris, 1% Triton X-100). A lesão muscular foi realizada a partir de uma incisão de 1cm e divulsão na região média do músculo tibial; então, as dMEC foram implantadas. Um grupo cirúrgico, sem o implante, foi usado como um controle. Os animais foram eutanasiados depois de 3, 15 e 45 dias. Análise histológica e imunohistoquímica foram realizadas para avaliar a morfologia tecidual e a presença de infiltrado inflamatório e células em proliferação (CD163 e PCNA). No 3° dia após a implantação, uma intensa reação inflamatória (CD163+) e proliferação celular (PCNA+) foram observadas, adjacentes ao biomaterial, em ambas as matrizes. No 15° dia, o biomaterial de MEC placentária ainda preservou o infiltrado celular (CD163+ e PCNA+) e iniciou o processo de absorção do biomaterial, enquanto que a dMEC do músculo já estava completamente absorvida. Finalmente, depois dos 45 dias, ambos os biomateriais foram absorvidos e o músculo estava completamente cicatrizado, sem fibrose. Conclui-se que congelar as amostras a -20°C anteriormente ao processamento e submeter à incubação inicial em solução de 1% SDS (Protocolo 2B) favoreceu a descelularização de músculo esquelético murino. Além disso, dMEC xenogênicas e alogênicas foram reabsorvidas e apresentaram processos de integração distintos em modelo não-crítico de lesão muscular esquelética, sugerindo que eventuais alterações sistêmicas, observadas a longo prazo, sejam avaliadas, bem como, a validação da utilização destas matrizes em modelos de perda muscular volumétrica. / Decelularized extracellular matrices (dECM) have been successfully used as biological biomaterials for tissue engineering, since they present advantages such as structural similarity with natural tissues, biocompatibility, biodegradability, signaling capacity and tissue homeostasis. The first aim of this study was to evaluate the efficacy of four protocols for the decellularization of murine skeletal muscle for the production of acellular extracellular matrices (ECM) for potential applications in tissue engineering. Tibial muscle was frozen at -20°C or stored at room temperature, followed by decellularization in solutions containing EDTA + Tris, SDS and Triton X- 100 chemical reagents, which were applied in different sequences and analyzed according to macroscopic modifications , removal of cellular and genetic content and the ability to preserve the ECM composition and three-dimensional structure. Thus, the optimization of cellular removal was observed, as well as the preservation of the ECM ultrastructure and composition in the protocols with freezing at -20°C and initial decellularization with the SDS solution, when compared to those starting with EDTA + Tris. The second aim of this study was to compare the biocompatibility of the dECM of murine muscle and canine placenta in murine model of muscle injury. Decellularized ECM were produced from the canine placenta (1% SDS, 5 mM EDTA + 0.05% Trypsin, 1% Triton X-100) and the tibial muscle of Wistar rats (freezing at - 20°C, 1% SDS , 5 mM EDTA + 50 mM Tris, 1% Triton X-100). The muscle injury was performed followed a 1 cm incision and divulsion in the middle region of the tibial muscle, where the dECM were implanted. A surgical group, without the implant, was used as a control. The animals were euthanized after 3, 15 and 45 days. Histological and immunohistochemistry analyses were performed to evaluate the tissue morphology and the presence of inflammatory infiltrate and cells in proliferation (CD163 and PCNA). On the 3rd day after implantation, an intense inflammatory reaction (CD163+) and cell proliferation (PCNA+) were observed, adjacent to the biomaterial, in both matrices. On 15th day, the placenta biomaterial still preserved the cellular infiltrate (CD163+ and PCNA+) and started the biomaterial absorption process, while the muscle biomaterial was already fully absorbed. Finally, after 45th day, both biomaterials were absorbed and the muscle was completely healed, without fibrosis. It was concluded that freezing samples at -20°C prior to processing and subjecting to the initial incubation in 1% SDS solution (Protocol 2B) favored the decellularization of murine skeletal muscle. In addition, xenogeneic and allogeneic dECM were resorbed and presented a distinct integration process in a non-critical model of skeletal muscle, suggesting that potential systemic changes, observed in the long term evaluation, as well as the validation of the use of these matrices in volumetric muscle loss models must be tested.

Introduction: Gestational Hypertensive Syndromes (SHG) continue to be a major cause of direct morbidity and mortality in Brazil, with a high proportion in the North. Even with several health policies created to try to curb maternal morbidity and mortality, scientific data indicate that there is still a need for scientific studies, especially histopathological ones. Objective: To evaluate the histopathological changes in human placentas and umbilical cords, of parturients with SHG. Methodology: The research was carried out at the High-risk Maternity Our Lady of Lourdes, Aracaju-SE. The sample consisted of 28 pregnant women with SHG, distributed in 4 groups: Normotensive Pregnant Women, Gestational Hypertension, Chronic Hypertension and the group with Pre-eclampsia, totaling 7 pregnant women per group. The data were analyzed by the statistical program Grad pad prism, with significant data (<0.05), using the one-way Anova and Tukey's multiple comparison test. The placentas and umbilical cords were submitted to 4 different methodologies, beginning with the histological processing - light microscopy, then histopathological analyzes of placentas by Hematoxylin and Eosin - HE, histopathological analyzes of the placentas following the staining technique with Masson and histopathological analyzes of the placentas. placentas following the Coloring Technique - PAS. Results: After analyzing the histological images, it was possible to identify in the placentas of normotensive pregnant women the mature and flat decidua with eosinophilic tissue and presence of fibrin, with dense epithelium and intact villi. The chorionic villi presented quite vascularization, with knots and scions. The umbilical cord presented an artery with an intimate and muscular layer of usual thickness. As for the placentas of patients with gestational hypertension, the smooth muscle thickening of the placental vessels, microcalcifications and vessel hyalinization were observed, in addition it was observed aged areas and areas with hyaline degeneration in the villi. In the placentas of pregnant women with chronic hypertension, hyalinization and aging of the villi were found, with microcalcification and hemorrhagic foci. The umbilical cord of pregnant women with chronic hypertension presented thick muscle wall, vessel hyalinization and cell degeneration. In the placentas of pregnant women with mild preeclampsia it was possible to observe intense groupings of degenerated and hyalinized villi. The umbilical cord presented thickening of the muscular layer. The placentas of pregnant women with severe pre-eclampsia were able to observe hyalinization of the villi, severe groupings with focus of calcification and hemorrhagic areas. Finally, it was identified that pregnant women in adulthood acquired SHG; the newborns of pregnant women with chronic hypertension were those that suffered the greatest impact of the syndrome, presenting slight decrease in weight, height, thoracic perimeter and cephalic perimeter. The placentas and umbilical cords of pregnant women with SHG presented structural changes and involvement of the tissue structures when compared to the normotensive pregnant women group. Conclusion: In this sense, it is concluded that the gestational annexes with SHG have structural and cellular changes at the placental and umbilical cord level, chronic hypertension is called attention, the data are conclusive, in addition, the placenta and umbilical cord of pregnant women with SGH, are an inexhaustible source of important scientific production on gestational development, and may contribute actively to the clinical findings of pregnant women and the newborn. / Introdução: As Síndromes Hipertensivas Gestacionais (SHG) continuam sendo uma das principais causas de morbimortalidade direta no Brasil, apresentando proporção elevada nas regiões Norte. Mesmo com diversas políticas de saúde criadas para tentar frear a morbimortalidade materna, os dados científicos apontam que ainda há necessidade de estudos científicos, em especial os histopatológicos. Objetivo: Avaliar as alterações histopatológicas em placentas humanas e cordões umbilicais, de parturientes com SHG. Metodologia: A pesquisa foi realizada na Maternidade de alto risco Nossa Senhora de Lourdes, Aracaju-SE. A amostra foi constituída por 28 gestantes com SHG, distribuídas em 4 grupos dentre eles: Gestantes Normotensas, Hipertensa Gestacional, Hipertensa Crônica e o grupo com Pré-eclâmpsia, totalizando 7 gestantes por grupo. Os dados foram analisados pelo programa estatístico Grad pad prism, com dados significativos (<0,05), utilizando o one-way Anova e teste de comparação múltipla de Tukey. As placentas e cordões umbilicais foram submetidos a 4 metodologias distintas, tendo como início o processamento Histológico - microscopia de luz, depois análises histopatológicas das Placentas por Hematoxilina e Eosina - HE, análises histopatológicas das placentas seguindo a técnica de coloração com Masson e análises histopatológica das placentas seguindo a Técnica de coloração - PAS. Resultado: Após análise das imagens histológicas foi possível identificar nas placentas de gestantes normotensas, a decídua madura e plana com tecido eosinófilo e presença de fibrina, com epitélio denso e vilosidades íntegras. As vilosidades coriônicas apresentaram bastante vascularizadas, com nós e brotos sinciciais. O cordão umbilical apresentou artéria com camada intima e muscular de espessuras habituais. Quanto às placentas de pacientes que cursaram com hipertensão gestacional, notou-se o espessamento da camada muscular lisa dos vasos placentários, microcalcificações e hialinização dos vasos, além disso foi observado áreas envelhecidas e áreas com degeneração hialina nas vilosidades. Já nas placentas de gestantes com hipertensão crônica foram encontradas hialinização e envelhecimento das vilosidades, com microcalcificação e focos hemorrágicos. O cordão umbilical de gestante com hipertensão crônica, apresentou a parede muscular espessa, hialinização do vaso e degeneração celular. Já nas placentas de gestantes com pré-eclâmpsia leve foi possível observar agrupamentos intensos de vilosidades degeneradas e hialinizadas. O cordão umbilical apresentou espessamento da camada muscular. As placentas de gestantes com pré-eclâmpsia grave foram possíveis observar hialinização das vilosidades, agrupamentos severos com foco de calcificação e áreas hemorrágicas. Por fim, identificou-se que as gestantes em idade adulta adquiriram SHG; os recém-nascidos de gestantes com hipertensão arterial crônica foram os que sofreram o impacto maior da síndrome, apresentando leve diminuição do peso, estatura, perímetro torácico e perímetro cefálico. As placentas e cordões umbilicais de gestantes com SHG apresentaram mudanças estruturais e acometimento das estruturas teciduais quando comparados ao grupo das gestantes normotensas. Conclusão: Neste sentido, conclui-se que os anexos gestacionais com SHG possuem alterações estruturais e celulares a nível placentário e de cordão umbilical, chama-se atenção a hipertensão crônica, os dados são conclusivos, além disso, a placenta e cordão umbilical de gestantes com SGH, são fonte inesgotável de produção científica importantes sobre o desenvolvimento gestacional, podendo contribuir de forma ativa para os achados clínicos das gestantes e do recém-nascido. / Aracaju

As regiões organizadoras de nucléolos (Nucleolar Organizer Regions - NORs) são regiões de cromatina levemente corada em volta da qual, no final da telófase, o nucléolo é novamente formado após a mitose. Um grupo peculiar de proteínas ácidas que têm alta afinidade por prata são localizadas nos mesmos locais que as NORs, o que confere as mesmas a propriedade de serem clara e rapidamente visualizadas por colorações que utilizam nitrato de prata. As NORs, quando coradas por prata são chamadas de AgNORs. O número de AgNORs está estritamente relacionado com a atividade transcricional do RNAr e com a agilidade e rapidez da proliferação celular. A homeostase celular utiliza-se de mecanismos através dos quais os tecidos de um organismo mantêm-se ou renovam-se, e para que isso ocorra, as células dispõe de dois programas genéticos principais: o ciclo celular e a apoptose. Considerando o crescimento da placenta e consequentemente das células trofoblásticas mono e binucleadas, esse trabalho teve dois principais objetivos: 1. determinar a relação quantitativa entre a proliferação celular e o estágio da gestação através da quantificação das AgNORs utilizadas como marcadores em placentas bovinas, evidenciando a intensa atividade proliferativa e metabólica das células binucleadas e estabelecendo o padrão de normalidade para gestações bovinas; e 2. determinar a ploidia das células do placentônio bovino e, através da análise dos estágios do ciclo celular, estabelecer a cinética celular envolvida na formação e diferenciação das células trofoblásticas binucleadas. Houve um aumento da quantidade de AgNORs nas células trofoblásticas mononucleadas a medida em que a gestação avançou, principalmente no terceiro trimestre de gestação. Isso indica um aumento na atividade proliferativa e/ou metabólica dessas células. O número de AgNORs expresso pela células binucleadas apenas aumentou do primeiro para o segundo trimestre, permanecendo, após esse estágio, praticamente constante. Isso nos leva a crer que a atividade das células binucleadas atinge seu ponto máximo no segundo trimestre e permanece com o seu metabolismo alto até o final da gestação. Além disso, esse número foi extremamente maior do que o observado nas células trofoblásticas mononucleadas, evidenciando a intensa atividade metabólica dessa célula. Na análise do ciclo celular, dois tipos celulares diferiam quanto ao seu tamanho (área) e quanto a sua granulosidade no placentônio, caracterizando diferenças quanto sua ploidia, sendo uma população diplóide e a outra tetraplóide. Para a fase G0-G1, a porcentagem obtida para o primeiro trimestre foi significativamente maior quanto comparada com o segundo e com o terceiro trimestre. Para a fase G2-M, encontramos um padrão inverso ao observado na fase G0-G1. Assim, podemos concluir que no primeiro trimestre de gestação as células tetraplóides estão formadas, mas não diferenciadas. A medida em que a gestação avança e a demanda metabólica fetal aumenta, essas células entram em processo de diferenciação para sua completa transformação em células capazes de produzir diversas substâncias e suprir as necessidades gestacionais maternas e fetais. / Nucleolar Organizer Regions (NORs) are weakly stained chromatin regions around which nucleoli reform after mitosis. A group of highly argyrophilic proteins are localized at the same sites as NORs, allowing NORs to be very clearly and rapidly visualized by silver nitrate staining procedures. They are called AgNORs. The number of AgNORs is strictly related to rRNA transcriptional activity and to the rapidity of cell proliferation. Cellular homeostasis uses two mechanisms to maintain or renew all tissues in organisms: the cell cycle and apoptosis. To comprehend the growth and the maturation of several tissues it is important to understand proliferation cellular kinetics and the cell cycle. The aim of this study was to evaluate the functional activity relation between the proliferative and metabolic capacity of trophoblastic mononucleate and binucleate cells from bovine placentomes at different stages of pregnancy. In addition, this study determined the ploidy and established the cellular kinetics involved in cell formation and differentiation through cell cycle analysis. The results demonstrated that: 1. The AgNOR number of mononucleate trophoblastic cells is related to their proliferative activity and stage of pregnancy; 2. The AgNOR number of binucleate trophoblastic cells is related to their level of metabolic activity and stage of pregnancy; 3. The AgNOR number of binucleate cell was just derived metabolic activity, and not proliferative activity, differing to mononucleate cells; 4. The AgNOR number was much greater in binucleate cells than in mononucleate cells, evidencing that the metabolism of binucleate cells was much higher than that of mononucleate cells; 5. Two cell populations form the bovine placentome: one is diploid cells and the other tetraploid; and 6. In the first trimester, the majority of tetraploid cells are not differentiated; with the progress of pregnancy and the increase in metabolic demands of fetus, the tetraploid cells begin a differentiation process and become cells that are able to supply maternal and fetal needs. These parameters could be applied to investigations about placental abnormalities due to pathologies or gestations derived from manipulated embryos.