A cutia Dasyprocta leporina é um roedor pertencente à sub-ordem histricomorfa, e é encontrada em todo território nacional. Os roedores da sub-ordem histricomorfa apresentam uma placenta dotada de uma estrutura peculiar, a subplacenta. Nesta pesquisa estudou-se em 9 (nove) placentas de cutias, nas três fases de gestação (inicial, média e final). Este estudo consistiu da análise morfológica placentária, pelas microscopias de luz e eletrônica, em conjunto com as técnicas de citoquímica, imunohistoquímica, e microvascularização. A subplacenta da cutia encontra-se localizada no ápice da placenta corioalantoidiana, separada desta por um tecido mesenquimal. Insere-se na parede uterina em íntimo contato com o tecido materno. Histologicamente a subplacenta consistiu de estruturas lamelares, cujos eixos são formados por tecido mesenquimal fetal. Sobre estes apoiam-se arranjos epiteliais de cito e sinciciotrofoblasto. Na região de interface da subplacenta e da decídua, foram encontradas populações de células trofoblásticas gigantes multinucleadas, citoqueratina positivas. A vimentina apresentou intensa reação positiva junto ao revestimento endotelial dos vasos do tipo arterial, e no interior do tecido mesenquimal do eixo central das lamelas da subplacenta. A reação de PCNA apresentou reatividade positiva no citotrofoblasto das lamelas da subplacenta, e em algumas células do sincício, principalmente no terço médio de gestação. A análise ultra-estrutural da subplacenta mostrou duas populações de células trofoblásticas distintas na parede das lamelas: o cito e o sinciciotrofoblasto. A vascularização da subplacenta analisada pela perfusão de látex colorido, e por Mercox, ao microscópio eletrônico de varredura, demonstrou a ausência de vasos de origem materna, e irrigação oriunda da artéria fetal. Esta após capilarização dirigia-se para os lóbulos da placenta principal, cuja disposição lembrava uma circulação do tipo portal. / The agouti Dasyprocta leporina is a rodent belongs to the suborder hystricomorph, and may be found in all national territory. The hystricomorph has one specific structure on the placenta, the subplacenta. In this research 9 (nine) placentae of agouti were studied, in three different gestation age (early, middle and late). The study consisted of placental morphologic analysis by light and electron microscopy, associated with cytochemical, immunohystochemistry and microvascularization techniques. The subplacenta of agouti is localized on the apical part of the chorioallantoic placenta, separated by a mesenchyme and inserted on the uterus wall. Histologically the subplacenta consisted of lamear structures where the axis was formed by mesenchyme. On this structure the epithelial formation of the cytotrophoblast and syncytiotrophoblast was found. In the region between suplacenta and decidua the multinucleate giant trophoblast cells were observed, cytokeratin immunostaining. The endothelial cells on the arterial vessels showed intense positive reaction to vimentin and also the mesenchyme from axis of the lamelae. The cytotrophoblast on the lamelae and some cells of the syncytiotrophoblast showed PCNA positive reaction, principally in middle part of gestation. The ultra-structure analysis of the subplacenta showed two cells populations on the lamelae: the cytotrophoblast and syncytiotrophoblast. The vascularization analyzed by scanning electron microscopy of the Mercox and by colored latex perfusion demonstrated only fetal vessels on the subplacenta originated from fetal artery. The fetal artery, after branched in a net of capillaries, run to lobules of the principal placental, and this behavior suggest a type of portal circulation.

Os roedores da sub-ordem histricomorfa, na qual a paca está classificada, apresentam placentação hemocorial e desenvolvem uma estrutura peculiar junto a sua placenta denominada de subplacenta. Apesar dos relatos de sua presença em diversas espécies, as possíveis funções dessa estrutura permanecem no âmbito especulativo, devido às variações na forma, dimensão e localização, bem como à falta de estudos experimentais focalizando essa estrutura placentária. Foram utilizadas oito placentas de pacas obtidas nos períodos médio e final de gestação, para avaliações das organizações e constituições teciduais, relações anatômicas do órgão por meio da microscopia de luz e eletrônica, aliadas às técnicas de citoquímica, imunocitoquímica e perfusões de traçadores para a rede vascular. Os resultados demonstraram que a subplacenta da paca estava localizada no ápice da placenta corioalantoidiana, separada desta por um tecido mesenquimal e inserida na parede uterina em íntimo contato com o tecido materno. A subplacenta consistia de estruturas lamelares com um eixo de tecido mesenquimal fetal sobre o qual apoiavam-se arranjos epiteliais de citotrofoblastos e sinciciotrofoblastos. Nas áreas de interfaces dos perímetros da subplacenta em contato com o tecido materno foram encontradas ainda populações de células trofoblásticas gigantes multinucleadas. Essas células trofoblásticas gigantes e sinciciotrofoblastos citoqueratina positivas foram também encontradas distantes do perímetro da subplacenta, invadindo profundamente o endométrio, que se apresenta totalmente desestruturado, contendo vasos sangüíneos com as paredes infiltradas pelas células trofoblásticas e destituídas de revestimento endotelial, confirmada pela reação vimentina negativa pela imunocitoquímica. Essas localizações de células trofoblásticas apontam para a capacidade invasiva das células trofoblásticas tanto através do leito vascular materno quanto pelos interstícios do estroma endometrial. Verificou-se uma área limítrofe de tecido endometrial decidualizado junto ao miométrio que se mantinha íntegra e que aparentemente conteve a invasividade das células trofoblásticas. Nos espaços interlamelares do interior da subplacenta, em meio ao sinciciotrofoblato, foram encontrados materiais amorfos resultantes da degradação do tecido endometrial retidos durante a progressão e crescimento da placenta para o interior da parede uterina. Nesses espaços, não foram encontrados vasos sangüíneos, porém, no eixo mesenquimal da subplacenta, foram constatados vasos sangüíneos de pequeno calibre, todos vimentina positivos, sugerindo a ausência de vascularização através de sangue materno na subplacenta. Pela localização estratégica, acima da placenta principal e pelos aspectos ultra-estruturais das células citotroblasticas presentes nas lamelas, juntamente com sua intensa marcação pelo PCNA, presume-se que as células da subplacenta possam originar as demais células trofoblásticas, particularmente as sinciciais e as gigantes, ao longo do terço médio da gestação. A vascularização da subplacenta avaliada pela perfusão de látex colorido e pela técnica de corrosão e análise em microscopia eletrônica de varredura comprovou a ausência de vasos de origem materna na subplacenta e demonstrou uma irrigação oriunda da artéria fetal que, após capilarização na subplacenta, dirigia-se para os lóbulos da placenta principal. Esta disposição lembra uma circulação do tipo portal, com uma possível recapilarização dos vasos oriundos da subplacenta junto à placenta principal, onde o sangue fetal efetuaria as trocas metabólicas para retornar como sangue oxigenado antes de confluir para a veia fetal no cordão umbilical. / The rodents of suborder hystricomorph, in which is classified the Agouti paca, present hemochorial type placentation and develops an unique structure known as subplacenta. In spite of many report of its presence in several species, the possible functions of this structure related to placenta and pregnancy remains speculative, mainly due to the diversity of form, size, localization and lack of experimental studies focusing such a placental structure. In the present study were used eight placentas collected from paca at midle and end stage of gestation in the aim to evaluate their tissue components and organization, anatomical relation of the organ at light and electron microscopy level, associated with cytochemical and immunocytochemical techniques and perfusion of vascular bed. The results showed the subplacenta was localized at apical portion of chorioallantoic placenta of paca, separated from this by mesechimal tissue and inserted in the uterine wall in intimate contact with maternal tissue. The subplacenta consisted of lamellar structures with mesenchimal axis of fetal origin on which, cytotrophoblast and syncytiotrophoblasts layers were organized as epithelial sheets. The interfaces at peripheral portion of subplacenta in contact with maternal tissue were also found populations of multinucleated giant trophoblast cells. These giant cells and syncytiotrophoblast were cytokeratin positives and were found far from the limits of subplacenta, deeply invading the completely damaged endometrium, as did the maternal vessels showing presence of trophoblast cells in their walls devoid of endothelial cells attested by vimentin and cytokeratin immunostaining. These findings suggest the invasive capability of trophoblast cells either through the maternal vascular bed and interstitium of endometrial stroma. However, it was seen a well defined border line of helthy decidualized endometrium near the miometrium that seems to retain the invasive progression of trophoblast cells. In the interlamellar space of subplacenta formed by syncytiotrophoblast, it was found amorphous materials originated from degradation of endometrial tissue retained during the progression and growth of placenta into the uterine wall. In these interlamellar spaces were not found blood vessels, but in the mesenchimal axes were found vimentin positive small vessels, which suggest absence of maternal vascularization inside the subplacenta. The strategical localization of subplacenta upside of chorioallantoic placenta of paca and the ultra structure of cytotrophoblast cells and their strong reaction to PCNA (proliferating cell nuclear antigen) supports these subplacental cells could be the source of trophoblast cells, namely the giant and syncytiotrophoblast. The vascularization of subplacenta evaluated by stained latex perfusion and by microvascular casting seen at scaning electron microscopy clearly showed the absence of maternal vascularization in the subplacenta. The blood supply of subplacenta seems to be exclusively from fetal artery whieems after capilarization in the subplacenta flows to the lobules of main placenta. Such a blood flow remind the portal type circulation, being the second capilarization of venous type vessels coming from the subplacenta inside the lobulules of the main placenta, where the fetal blood could make the metabolic changes to return with enough oxygenation level before join to the fetal vein in the umbilical cord.

A clonagem de animais é uma técnica em desenvolvimento e ainda requer refinamento, uma vez que as perdas embrionárias são significativas. Mesmo com animais chegando à termo, algumas deficiências verificadas ao nascimento provocam a morte destes antes do primeiro mês de vida. As alterações placentárias durante a embriogênese estão relacionadas, à formação deficiente da placenta, principalmente nas regiões de troca materno-fetal. Considerando a necessidade de estudos mais detalhados sobre a morfologia da placenta e a ausência de estudos quantitativos das estruturas placentárias em grandes mamíferos, investigamos comparativamente os vilos coriônicos da placenta de bovinos não clonados e clonados usando delineamento estereológico. Foram utilizadas placentas de quatro fêmeas de bovinos clonados e quatro de não clonados. A amostragem foi realizada de modo uniforme, sistemático e aleatório, sendo obtidas estimativas de densidade de volume, volume referência, tamanho e comprimento e número de unidades volume star. Todos os parâmetros estereológicos apresentaram valores superiores (embora não significativos) para não clonados, com exceção do número de unidades volume star. No entanto, a placenta de não clonados foi mais eficiente (p= 0.014). Apesar de não significativos, os resultados sugerem a existência de diferenças biológicas, ou seja, a placenta de bovinos não clonados apresenta vilos maiores (porém em menor número), mas distribuídos em um número maior de placentomas. Já em animais clonados, estes vilos são menores, mais numerosos e distribuídos em um número menor de placentomas. / Animal cloning is still in development it requires further improvements since embryonic losses are remarkable animals die before the first month after birth. The placental changes during embryogenesis cause a deficiency in the placenta, mostly in the maternal-fetal exchange areas. Due to the need for more detailed studies on the placenta?s morphology, especially the quantitative analysis of the placenta structures in large animals, chorionic villi were comparatively investigated in both cloned and non-cloned bovines by means of stereology designed methods. Placentas from four cloned and four non-cloned bovines were used. Specimens were collected in a random uniformand systematic procedure, and stereological designed methods were pursued to estimate volume density of villi; the volume reference of placenta (Cavilieri Principle), surface density, surface area, star volume and number of star volume units. All parameters presented larger values for non-cloned, with exception of number of star volume units, thought these results were statistically non-significant larger in non-cloned animals (p= 0.014). In conclusion, it is possible to say that there are biological differences, in the placenta of non-cloned bovines which presents larger chorionic villi, small villi number, but distributed in a larger number of placentomas. In cloned bovines, however, villi are smaller, numerous more, and they are distributed in fewer number of placentomes.

O objetivo deste estudo foi caracterizar morfologicamente o desenvolvimento inicial da gestação bovina proveniente de monta natural, com idades compreendidas entre 15 a 70 dias, e de fecundação in vitro (FIV) com 35 dias, com ênfase no desenvolvimento placentário inicial, e diferenciação das estruturas extra embrionárias. Para tanto, foram utilizados 141 conceptos, provenientes de monta natural, e sete conceptos obtidos pela técnica de FIV. Após as coletas, os conceptos foram dissecados, mensurados macroscopicamente e fotodocumentados. As membranas extra-embrionárias foram cortadas em fragmentos de 5 cm2, e, em seguida fixadas em paraformoldeído 4%, para análise por microscopia de luz, e glutaraldeído 2,5%, para utilização em microscopia eletrônica de varredura e transmissão. As membranas extra-embrionárias e fetais apresentaram graus variáveis de desenvolvimento ao longo dos períodos analisados. O aparecimento macroscópico da vascularização do alantóide, sua tentativa de se fundir com o cório e o aparecimento efetivo dos primeiros cotilédones em desenvolvimento, foram eventos observados em embriões a partir de 1,9±0,27 cm de \"Crown-Rump\" (CR) (30 a 40 dias da gestação). O CR médio, o peso do embrião, o peso do saco gestacional e os comprimentos do cório e âmnio aumentaram gradativamente com o evoluir da gestação. O epitélio alantoidiano apresentou um dimorfismo celular a partir de 0,9 cm de CR (15 a 20 dias de gestação), porém, mostrou-se imaturo até o feto atingir o comprimento de 7,2 cm de CR (60 a 70 dias da gestação). O trofoblasto apresentou células mononucleadas e células gigantes binucleadas em diferentes níveis ao longo da gestação. O saco vitelino persistiu até 70 dias de gestação, e o seu epitélio apresentou indícios de atividade funcional até 50 dias de gestação. De todos os parâmetros mensurados na análise macroscópica, somente o comprimento o CR e o saco vitelino apresentaram diferença significativa entre os conceptos de monta natural e de FIV. Nos conceptos de monta natural, o comprimento do saco vitelino foi de 5,53 cm, em média, e nos conceptos de FIV, de apenas 1,07 cm. Todavia, faz-se necessário analisar um número maior de animais submetidos a FIV para corroborar a diferença encontrada nestas medidas. Os resultados sugerem ainda a existência de uma placenta vitelínica ativa, importante para a manutenção da gestação, que se estabelece temporariamente entre a placenta coriovitelínica e alantovitelínica transitória e a placenta cório-alantóide definitiva. / The main goal of this study was to describe morphology and the early gestational development of 15 to 70 day-old bovine embryos obtained by natural mating and 35 day-old bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IFV) technique. One hundred and forty-one concepts originated by natural mating and seven by IVF technique were used. All concepts were dissected, macroscopically measured and photographed. Extraembryonic membranes were cut in 5 cm2 fragments and fixed in 4% paraformoldehyde for light and Scanning Electron Microscopy (SEM) and in 2.5% glutaraldehyde for Transmition Electron Microscopy (TEM). Ali membranes showed different stages of development during analyzed periods. The beginning of allantois macroscopic vascularization, the attempt of fusion between allantois and chorium membranes and the effective development of the first cotyledons were observed in 30-to-40 day-old embryos with 1.9± 0.24 cm of Crown-Rump (CR) length. The average CR, the embryos and gestational sac weight, the chorion and amnion length increased during gestation. The allantoic epithelia showed a cellular dimorphism with 0.9 em CR, however, the maturation has not happened until the foetal length of 7.2 em CR. The trophoblast showed different levels of mononucleate cells and binucleate giant cells. The yolk sac persisted until 70 days of gestation and the epithelium seemed functionally activated until 50 days of gestation. The CR and yolk sac size were the only measured macroscopic parameter showingdifference between natural mating and FIV concepts. Yolk sac size presented average values of 5.53 cm and 1.07 cm for natural mating and FIV concepts, respectively. Therefore, it is necessary to analyze a higher number of FIV embryos to corroborate that observed yolk sac size difference. All results obtained in this study suggest the existent of an active vitelline placenta, important to the gestational maintenance and temporarily establish between the transitory choriovitelline placenta and the permanent chorioallantoic placenta.

Os fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função placentária. Os efeitos destes na expressão da enzima esteroidogênica aromatase P450 (P450arom) na placenta bovina em diferentes estágios gestacionais (90 a 270 dias) foram avaliados através de imunocitoquímica. Além disso, comparou-se a influência destes entre células placentárias de bovinos clonados e não clonados aos 270 dias. A aromatase P450 foi localizada exclusivamente no citoplasma das células trofoblásticas gigantes e sua expressão foi menor aos 150 dias de gestação, em relação às demais idades (p<0,05). O VEGF (50 ng/ml) influenciou significativamente a expressão da P450arom aos 150 e 270 dias, enquanto o bFGF (10 ng/ml) foi efetivo em estimular essa expressão particularmente no final da gestação (270 dias). Os dois fatores combinados (bFGF+VEGF) inibiram a expressão da P450arom no terço inicial (90 dias), mas, por outro lado, estimularam-na aos 150 e 270 dias (p<0,05). Nos clones, a expressão da P450arom, nos grupos controle e VEGF, foi semelhante a dos animais não clonados aos 270 dias de gestação, porém, o bFGF e os dois fatores combinados inibiram-na significativamente (p<0,05). Em todos os grupos analisados, a expressão da P450arom apresentou característica ascendente em função dos dias de cultivo, atingindo concentração máxima após 96 horas de incubação. Assim, o presente estudo demonstrou efeitos distintos e estágio-específicos dos fatores de crescimento bFGF e VEGF na secreção de estrógenos na placenta bovina via modulação da expressão da aromatase P450 in vitro. Conclui-se que estes fatores de crescimento agem como potentes moduladores de enzimas esteroidogênicas e que, sob as condições de cultivo estabelecidas, as células placentárias de bovinos clonados apresentam padrão de resposta distinto quando comparadas com células de bovinos não clonados de mesma idade gestacional. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of placental development and function. Their effects on the steroidogenic enzyme aromatase P450 (P450arom) expression from bovine placenta at different gestational stages (90 - 270 days) were evaluated by immunocytochemistry. Moreover, we compared the effects of these growth factors on P450arom expression between cloned and non cloned bovine placental cells. P450arom was localized exclusively in trophoblast giant cells cytoplasm, and its expression reached lowest levels at day 150 of gestation in comparison to the remaining evaluated gestational stages. VEGF (50 ng/mL) influenced significantly P450arom expression at days 150 and 270, whereas bFGF (10 ng/mL) was effective in stimulating P450arom expression particularly during late gestation (day 270). The two factors combined (bFGF+VEGF) inhibited P450arom expression during early gestation (day 90), but, in contrast, stimulated it at days 150 and 270 of pregnancy (P<0.05). In cloned bovine placental cells, P450arom expression was similar to non-cloned cells in the control and VEGF groups, however, bFGF and both factors together inhibited it significantly (P<0.05). In all groups analyzed, P450arom expression presented rising pattern over the duration of the culture, reaching maximal values at 96 hours of incubation. Thus, the present study demonstrated distinct and stage-specific effects of these growth factors on bovine placenta P450arom expression in vitro. We concluded that these growth factors act as potent steroidogenic enzymes regulators, and, under the established culture conditions, placental cells from cloned bovines presented distinct answer pattern compared to non cloned placental cells at the same gestational stage.

As serpentes pitvipers Crotalus durissus e Bothrops jararaca apresentam um ciclo reprodutivo sazonal com um estágio de desenvolvimento folicular ativo (vitelogênese Tipo II) no final do verão e início de outono. A cópula ocorre no outono (março até maio) e a gestação na primavera até o início do verão quando os nascimentos acontecem (Dezembro até Março). Depois do parto as serpentes permanecem em estado de quiescência folicular, o que as impede de reproduzir na próxima estação do mesmo ano. Assim, cada fêmea madura da população reproduz-se a cada dois anos caracterizando um ciclo reprodutivo bienal. A morfologia do trato reprodutivo em ambas as espécies mostra ovários e ovidutos assimétricos. Cada oviduto é dividido em três regiões distintas, a saber o infundíbulo, o útero (posterior e anterior) e a vagina. A assincronia entre a vitelogênese e a fertilização promove uma estocagem de esperma obrigatória. Esse processo ocorre na porção posterior do útero, por meio de uma contração muscular. Estudos morfofisiológicos do oviduto da jararaca e da cascavel combinados, com o uso de microscopias de luz, transmissão e varredura nunca foram conduzidos antes. A anatomia macroscópica do útero depois da cópula é caracterizada por uma torção e uma contração da musculatura uterina lisa longitudinal, a qual forma uma espiral. O útero permanece visivelmente contraído até a ovulação em setembro (início de primavera). O desenvolvimento embrionário ocorre no útero. Cada ovo ou embrião é isolado por uma constrição que funciona como uma implantação. A íntima aposição epitélio corioalantóico com o epitélio uterino indica que a placenta é do tipo epiteliocorial. As especializações da alantoplacenta em ambas as espécies caracteriza a placenta como (Tipo II). Em ambas as serpentes o oviduto parece ser um órgão capaz de exercer funções diferentes como a retenção e estocagem de esperma, manutenção e transporte dos ovos, fertilização e manutenção do embrião (gestação e placentação uterina). Machos de Bothrops e Crotalus mostram dois testículos alongados que se comunicam bilateralmente na cloaca por meio dos ductos deferentes convolutos. O diâmetro mais largo do ducto deferente, na porção distal foi observado no verão e outono, devido a espermiogênese, que ocorre um pouco antes da cópula. Em ambas as espécies observam-se um aumento dos testículos na primavera e verão provavelmente relacionada a espermatogênese, a qual também não é sincronizada com a cópula (outono) e a fertilização (setembro/outubro). Todas estas estratégias fisiológicas e morfológicas, tanto em machos quanto em fêmeas das duas espécies de serpentes promovem a liberação simultânea dos gametas no início da primavera (setembro), de modo a tornar harmônico o ciclo reprodutivo dos machos e das fêmeas. / The neotropical pitvipers Crotalus durissus and Bothrops jararaca show a sazonal reproductive cycle with an active stage of follicular development (vitellogenesis Type II) in late austral autumn and winter. Mating occurs in early to middle autumn (March to May) and gestation occurs in spring up to early summer when birth takes place (December up to March). After parturition snakes show a follicular quiescence which prevents them to reproduce in the following season of the same year. Therefore they skip one reproductive season characterizing a biennial reproductive cycle. Morphology of the reproductive tracts in both species showed the presence of unpaired ovaries and oviducts. Each oviduct is divided in four distinct regions, namely infundibulum, posterior and anterior uterus, and vagina. The lack of synchrony between vitellogenesis and fertlization, makes female store sperm obligatory. Sperm storage in both snakes occurs in the posterior portion of the uterus by means of a uterine muscle contraction and convolution. Morphological studies of the oviduct of jararaca and rattlesnakes combining the use of LM, TEM and SEM has never been carried out before. Macroscopical anatomy of the uterus after mating is characterized by convolution and contraction of the longitudinal smooth musculature which formed a spiral. The uterus remains visibly convoluted until ovulation occurs in September (early spring). Embryo development occurs in the uterus; each egg or embryo is isolated by a uterine short constricted segment that probably works as an implantation chamber like a placenta. The intimate apposition of the uterine lining with the chorioallantois indicates that the placenta is epitheliochorial type. The allantoplacenta, in both species develop folds in uterine and embryonic epithelia characterizing the second category of placenta (Type II). In both the species the oviduct has demonstrated to be an organ capable of some different functions such as sperm retaining and storage, egg uptake and transport, fertilization, maintenance of the embryo (uterine gestation and placentation) and parturition. Males of Bothrops and Crotalus show two elongated testes which communicate bilaterally with the cloaca through the coiled deferent ducts. The largest diameter of deferent ducto, was observed in summer and autumn, due to intense spermiogenesis, just before the mating season. In both species an increase in size of the testes was observed in spring and summer probably related with seasonal spermatogenesis, which is asynchronous in relation to mating (autumn). All these physiological and morphological strategies both in male and female B. jararaca and C. Durissus promote simultaneous liberation of gamets in early spring (september), in such a way to make reproductive cycle harmonic in these crotaline pitvipers.

A função da eritrofagocitose observada após o extravasamento de sangue na interface materno-fetal é indefinida em várias espécies, incluindo o búfalo. Na ovelha, este processo foi muito estudado, e ocorre na zona arcada do placentônio (topos dos septos maternos e base dos vilos fetais), região onde o processo é realizado pelo trofoblasto. É possível que o ferro seja transferido para o feto mediante a eritrofagocitose trofoblástica nesta área hemófaga da placenta e nas glândulas endometriais. Para este estudo foram utilizadas placentas de búfalas entre 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 e 10 meses de prenhez, fixadas por perfusão com solução aquosa de formaldeído a 10% e paraformaldeído a 4%, para microscopia de luz, e glutaraldeído a 2,5%, para microscopia eletrônica de transmissão, processadas e coradas para microscopia de luz (HE, azul de Toluidina, tricromo de Gomori, Hematoxilina-floxina, Azul de metileno - fucsina básica), histoquímica (reação de Perls, PAS e fosfatase ácida) além de microscopia eletrônica de transmissão. A metodologia utilizada permitiu-nos observar que as áreas hemófagas estavam presentes em determinadas regiões do placentônio, nas quais se identificavam áreas hemorrágicas entre o epitélio uterino e o trofoblástico, nas placentas de 4 a 10 meses de prenhez. Eritrócitos foram encontrados nas células trofoblásticas, elucidando, deste modo, a eritrofagocitose. A reação de PAS foi positiva, marcando substância mucóide, principalmente na base dos vilos fetais, células trofoblásticas binucleadas e nas glândulas endometriais da região interplacentomal. A reação de Perls foi negativa nos placentônios e positiva nas glândulas endometriais. A reação de fosfatase ácida foi positiva tanto nos placentônios, quanto na região interplacentomal. A ultraestrutura da região das áreas hemófagas revelou eritrócitos ingeridos dentro das células trofoblásticas epiteliais em diferentes fases de digestão e eletrondensidades, várias vesículas endocíticas, cavéola, muitas gotículas lipídicas, retículo endoplasmático rugoso bem desenvolvido e a presença de grande quantidade de mitocôndrias. O epitélio das glândulas endometriais da região interplacentomal é do tipo colunar com a presença de microvilos em seu ápice, e núcleos basais. / The function of erytrophagocytosis observed after blood extravasation in the maternal-fetal interface is indefinite various species, including the water buffalo. In ewe, this process had been hardly studied and it occurs in the placentome arcade zone (top of maternal septa), region where the process is performed by the trophoblast. It is possible that iron is being transferred to the fetus through the trophoblastic erytrophagocytosis in the hemophagous areas of the placenta and in the endometrial glands. In our research we have been using placentomes of buffaloes between 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 and 10 months of pregnancy, fixed by perfusion with 10% formaldehyde aqueous solution, 4% paraformoldehyde for light microscopy and 2,5% glutaraldehyde for transmission electron microscopy, processed and stained for light microscopy (HE, Toluidine blue, Gomori trichrome, hematoxilin - floxin, methilen blue ? basic fucsin), histochemistry (Perls, PAS and acid phosfatase reaction) and transmission electron microscopy. The methodology used allowed us to observe that the haemophagous areas were present in determined regions of the placentome, in which there were showing haemorragic areas between the trophoblastic and uterine epithelium, in 4-10 months pregnant placentae. Erythrocytes had been found inside trophoblastic cells, thus contributing to explain the erytrophagocytosis. The PAS reaction was positive, staining mucoid substance, mainly in the basis of the fetal villi, trophoblastic binucleate cells and in an endometrial glands in the interplacentomal region. The Perls reaction was negative in the placenton as well as in the endometrial glands. The acid phosphatase reaction was positive in placenton as well as in the interplacentomal region. The ultrastructure of the haemophagous areas revealed ingested erythrocytes inside the epithelial cells of trophoblast in different phases of digestion and electrondensities, various endocitic vesicles, caveolae, many lipid droplets, well-developed rough endoplasmic reticulum and large number of mitochondrias. The endometrial glands epithelium of interplacentomal region is columnar type with microvilli and basal nuclei.

La prééclampsie est une maladie fréquente de la grossesse, caractérisée par l’apparition de novo d’une hypertension et d’une protéinurie à partir de la 20ème semaine d’aménorrhée. Ces symptômes s’aggravent au long de la grossesse, conduisant éventuellement à la mort maternelle en l’absence de prise en charge médicalisée. La thérapeutique définitive l’extraction du placenta, et donc du fœtus, ce qui induit une importante prématurité iatrogène. Les causes restent mal définies, mais il est bien admis que des anomalies au niveau de la mise en place du placenta sont au cœur de sa physiopathologie. Un défaut d’invasion trophoblastique des artères spiralées utérines semble être une constante de la maladie. Des données épidémiologiques démontrent qu’il existe une forte composante génétique dans la prééclampsie, et en 2005, un clonage positionnel dans des familles hollandaises, aboutit à l’identification de STOX1 comme le premier gène lié à cette maladie. STOX1 code un facteur de transcription intervenant dans le contrôle de la prolifération et de l’invasion des trophoblastes. Dans notre laboratoire, l’étude de STOX1 a été initiée par surexpression dans des cellules de choriocarcinome humain (modèle de trophoblastes) suivie d’une analyse transcriptomique. Celle-ci a révélé que les altérations d’expression génique observées suite à la surexpression de STOX1 étaient significativement corrélées à celles trouvées dans des placentas prééclamptiques. La création de souris transgéniques exprimant la version humaine de STOX1 sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire a alors été entreprise. Mes travaux de thèse ont principalement consisté à caractériser le phénotype de ces souris. Nous avons décidé de croiser des mâles transgéniques avec des souris sauvages afin de limiter l’expression du transgène à l’unité fœto-placentaire. Ces souris sauvages développent au cours de leur gestation une hypertension sévère, et une protéinurie. Elles constituent donc un nouveau modèle de prééclampsie. De plus, nous avons observé des anomalies que l’on trouve également chez les patientes : une fibrose rénale, une élévation des taux sériques de facteurs pro-angiogéniques (le récepteur soluble du VEGF et l’endogline soluble). Ces souris ont également des marqueurs d’hypertrophie cardiaque, attestant de l’impact sévère de l’hypertension. Pour mieux comprendre comment STOX1 peut induire ce syndrome, nous avons étudié son impact dans le modèle cellulaire surexprimant STOX1 et nous avons pu montré une altération de la gestion du stress oxydatif et de la fonction mitochondriale. En conclusion, nous avons obtenu et caractérisé un modèle de prééclampsie sévère, le seul existant montrant un phénotype hypertensif très marqué et très précoce. Ce modèle est un outil puissant pour découvrir de nouvelles voies impliquées dans la physiopathologie de la prééclampsie, pour rechercher de potentiels marqueurs diagnostiques précoces, tester des approches thérapeutiques innovantes et explorer les mécanismes responsables des conséquences à long terme de la prééclampsie. / Preeclampsia is a common disease of pregnancy characterized by de novo appearance of hypertension and proteinuria from the 20th week of gestation. These symptoms worsen during pregnancy, possibly leading to maternal death in the absence of medical management. The only final treatment is the extraction of placenta and so fetus, which is responsible to a significant iatrogenic prematurity. The causes remain unclear, but it is well accepted that abnormalities in the development of the placenta are at the heart of its pathophysiology. A lack of trophoblastic invasion of the uterine spiral arteries seems to be a constant of the disease. Epidemiological data show that there is a strong genetic component in preeclampsia, and in 2005, a positional cloning in Dutch families led to the identification of STOX1 as the first gene linked to the disease. STOX1 encode a transcription factor involved in the control of proliferation and invasion of trophoblasts. In our laboratory, the study of STOX1 was initiated by its overexpression in human choriocarcinoma cells (trophoblast model) followed by transcriptome analysis. This revealed that the gene expression changes observed after STOX1 overexpression were significantly correlated with those found in preeclamptic placentas. The creation of transgenic mice expressing the human version of STOX1 under the control of a ubiquitous promoter was then initiated. My work during this thesis consisted primarily to characterize the phenotype of these mice. We decided to cross transgenic males with wild-type mice to limit transgene expression in fetal-placental unit. These wild mice develop during gestation severe hypertension and proteinuria. They therefore constitute a new model of preeclampsia. In addition, we observed anomalies that are also found in patients: renal fibrosis, elevated serum levels of pro-angiogenic factors (soluble VEGF receptor and soluble endoglin). These mice also have markers of cardiac hypertrophy, attesting for the severe impact of hypertension. To better understand how STOX1 can induce the syndrome, we studied its impact on the cell model overexpressing STOX1 and we showed a change in the management of oxidative stress and mitochondrial function. In conclusion, we have obtained and characterized a model of severe preeclampsia, the only existing one showing a very strong and very early hypertensive phenotype. This model is a powerful tool for discovering new pathways involved in the pathophysiology of preeclampsia, for searching potential early diagnostic markers, for testing innovative therapeutic approaches and for exploring the mechanisms responsible for the long-term consequences of preeclampsia.

Le choriocarcinome est une tumeur trophoblastique hautement maligne qui se développe souvent suite à des grossesses molaires dénommées moles hydatiformes (MH). La progression d’une MH vers un choriocarcinome reste à ce jour non caractérisée. L’implication de facteurs angiogéniques dans ce processus a été proposée. Nous avons étudié le rôle d'un nouveau facteur angiogénique spécifique du placenta, l’EG-VEGF (Endocrine Gland-Derived Endothelial Growth Factor) dans la pathogenèse du choriocarcinome. EG-VEGF agit via deux récepteurs (RCPG), PROKR-1 et PROKR-2. Trois approches ont été utilisées pour vérifier cette hypothèse. Une approche clinique, utilisant des échantillons placentaires et des sera collectés chez des patientes MH (n = 38) et avec choriocarcinome (n = 3) et chez des femmes normales (n = 18), tous prélevés au cours du premier trimestre de la grossesse. Une approche in vitro, utilisant les cellules JEG3, lignée humaine de cellules de choriocarcinome et des cellules trophoblastiques normales du premier trimestre (CTN). Une approche in vivo qui a visé à développer un modèle animal du choriocarcinome qui a servi à l’étude de la progression du choriocarcinome. Les niveaux circulants d’EG-VEGF étaient significativement plus élevés dans les MH et le choriocarcinome comparés aux niveaux chez les patientes normales. Au niveau placentaire, à la fois les niveaux d’expression de l’EG-VEGF et ses récepteurs ont été augmentés. Dans les cellules JEG3, EG-VEGF augmente i) l'expression de PROKR-1 et PROKR-2, ii). La migration, l'invasion, la prolifération et la formation de sphéroïdes dans des systèmes de culture 2 et 3D. Ces effets étaient significativement diminués en présence des antagonistes des deux récepteurs, iii) la phosphorylation de diverses protéines impliquées dans la progression tumorale, ainsi que la sécrétion de MMP-2 et MMP-9. Le modèle de choriocarcinome a été développé par injection de cellules JEG3 en orthotopie dans le placenta de la souris SCID (brevet en cours). En 12 jours, les souris gestantes injectées ont développés un choriocarcinome qui a métastasé dans différents organes. L'injection des antagonistes des récepteurs de l’EG-VEGF réduit significativement le développement et la progression de la tumeur. Par ailleurs, nous avons caractérisé le mécanisme par lequel EG-VEGF contribuerait à la progression tumorale. Ce mécanisme implique le clivage de la protéine de la jonction endothéliale, la VE-Cadhérine, suite à sa phosphorylation sur tyrosine 685 par l’EG-VEGF. Au total, mon projet de thèse i) démontre l’implication directe de l’EG-VEGF dans le développement et la progression du choriocarcinome ii) élucide le mécanisme de cette progression et iii) propose une piste thérapeutique via l’antagonisation de ses récepteurs. / Choriocarcinoma is a highly malignant trophoblastic tumor that often develop from molar pregnancies also called hydatidiform mole (HM). Nevertheless, HM progression towards choriocarcinoma remains uncharacterized. Involvement of angiogenic factors in this process is proposed. Here, we investigated the role of a new placental angiogenic factor, EG-VEGF (Endocrine Gland-Derived Endothelial Growth Factor) in choricarcinoma pathogenesis. EG-VEGF acts via two GPCR receptors PROKR-1 and PROKR-2. Three approaches were used to verify this hypothesis. A clinical approach using sera and placental samples collected from HM (n=38) and Choriocarcinoma patients (n=3) and from normal pregnant women (n=18); all collected during the first trimester of pregnancy. An In vitro approach using JEG3 cells, a human choriocarcinoma cell line and normal first trimester trophoblast cells (NTC). An in vivo approach that aimed at developing an animal model of choriocarcinoma in which therapeutic agents have been tested. Circulating EG-VEGF levels were significantly higher in HM and choriocarcinoma compared to normal patients. Placental EG-VEGF, PROKR1 and PROKR2 expression exhibited the same pattern. In JEG3 cells, EG-VEGF increased i) the expression of PROKR-1 and PROKR-2, ii). Their migration, proliferation invasion and spheroid formation using both 2 and 3D culture systems. These effects were abolished using PROKR1 and PROKR2 antagonists, iii) phosphorylation of different proteins involved in tumor progression as well as secretion of MMP-2 and MMP-9. Choriocarcinoma model has been developed by injection of JEG3 cells orthotopically within the placenta of SCID mice (Patent in progress). Within 12 days, injected gravid mice developed a choricarcinoma that metastasis in multiple organs. Importantly, injection of EG-VEGF receptors antagonists significantly reduced tumor development and its progression. Also, we have characterized the mechanism by which EG-VEGF contributes to tumor progression. This mechanism involves the cleavage of the key junctional protein, the VE-cadherin, following its phosphorylation at the tyrosine 685, by EG-VEGF. In total my thesis project i) demonstrated the direct involvement of the EG-VEGF in the development and progression of choriocarcinoma ii) elucidated the mechanism of this progression and iii) proposes a potential therapeutic for choriocarcinoma through the antagonisation of its receptors.

Orientadores: Mônica Barbosa de Melo, Maria Laura Costa do Nascimento / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:42:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_LeticiadeCarvalho_M.pdf: 2876494 bytes, checksum: 12f04350633f850a09c5a6d41173d849 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As doenças falciformes (DF) constituem um grupo de patologias genéticas que têm como característica comum a presença da hemoglobina S, uma proteína mutante que sofre polimerização sob baixas tensões de oxigênio, gerando vaso-oclusão. A obstrução e a lesão do endotélio vascular e dos tecidos causam uma resposta inflamatória que, por sua vez, resulta em um estado inflamatório crônico nos pacientes. A gravidez de mulheres portadoras de DF é acompanhada por uma incidência aumentada de episódios de dor, infecções, pielonefrite, complicações pulmonares, eventos tromboembólicos, pré-eclâmpsia e hemorragia anteparto. No entanto, os mecanismos responsáveis pelo desencadeamento destas complicações e a fisiopatologia envolvida ainda são pouco explorados. A circulação placentária materna é suscetível à vaso-oclusão, o que pode contribuir para as áreas de fibrose, necrose das vilosidades e infarto na placenta. O objetivo central da pesquisa foi avaliar a expressão gênica da resposta inflamatória de 84 genes em placentas de mulheres portadoras de DF através do PCR Array. Portanto, propomos um estudo prospectivo, do tipo caso-controle, com avaliação de três grupos: grupo 1 gestantes com anemia falciforme (N=5), grupo 2 gestantes com doença da hemoglobina SC (N=6) e grupo 3 gestantes sem DF (N=10). Os resultados apresentaram alterações significativas no perfil de expressão dos genes FASLG (no grupo 1) e BCL6 (no grupo 2). A diminuição e o aumento da expressão destes genes, respectivamente, indicam que pode estar ocorrendo falha na invasão dos trofoblastos, prejudicando o fornecimento de oxigênio e nutrientes para o feto. A invasão deficiente dos trofoblastos pode estar associada a algumas complicações maternal e fetal que ocorrem com mais frequência nas gestações de mulheres com DF quando comparadas com o grupo controle, como pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intra-uterino. Este é o primeiro estudo que avaliou a expressão gênica da resposta inflamatória em placentas de mulheres portadoras de DF. Nossos resultados fornecem novas perspectivas para que mais pesquisas sejam realizadas nesta área, a fim de se compreender como a DF afeta a fisiologia da placenta e oferece maiores riscos nestas gestantes / Abstract: Sickle cell disease (SCD) is a group of genetic diseases that have in common the presence of hemoglobin S, a mutant protein that undergoes polymerization under low oxygen tensions, generating vaso-occlusion. The obstruction and the lesion of the vascular endothelium and tissue cause an inflammatory response that in turn results in a chronic inflammatory state in patients. Pregnancy in SCD is accompanied by an increased incidence of pain episodes, infection, pyelonephritis, pulmonar and thromboembolic events, preeclampsia and antepartum haemorrhage. However, the mechanisms responsible for the onset of these complications and the pathophysiology involved are still poorly explored. The maternal placental circulation is susceptible to vaso-occlusion, which may contribute to generate areas of fibrosis, villi necrosis and infarction of the placenta. The main objective of this research was to evaluate the gene expression of the inflammatory response of 84 genes in placentas from women with SCD by PCR Array. Therefore, we have proposed a case-control prospective study, with the evaluation of three groups: Group 1, pregnant women with SCD (N = 5); group 2, pregnant women with hemoglobin SC disease (N = 6) and group 3, pregnant women without SCD (N = 10). The results showed significant changes in the expression profile of BCL6 and FASLG genes. The decrease and increase in the expression of these genes, respectively, indicate that a failure in the invasion of trophoblasts may be occurring, damaging the delivery of oxygen and nutrients to the fetus. The poor invasion of trophoblasts may be associated with some maternal and fetal complications that occur more often in pregnancies of women with SCD when compared with the control group, such as preeclampsia and intrauterine growth restriction. This is the first study to assess the gene expression of the inflammatory response in placentas of women with SCD. Our results provide new perspectives for further research to be performed in this area in order to understand how SCD affects the physiology of the placenta and causes greater risks in pregnant women / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestra em Genética e Biologia Molecular