Made available in DSpace on 2018-08-01T21:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10064_Dissertação_Flávia Medina da Silva.pdf: 788299 bytes, checksum: 07d6e8dd8df2ccf77b7aa3426d87206a (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / A doença cardíaca é considerada maior causa de morte no mundo e muitos pacientes tem como única forma de tratamento o transplantes do órgão. A bioengenharia tecidual veio como forma de auxiliar no problema de escassez de órgãos para doação, utilizando de técnicas que consistem em retirar as células do órgão mantendo os componentes da Matriz Extracelular (MEC) e recelularizar com células do próprio paciente, portanto reduzindo a concentração de moléculas imunologicamente ativas. Todos os agentes usados em descelularização alteram a composição e causam algum dano a ultraestrutura. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de arcabouço cardíaco derivado de matriz extracelular (MEC) descelularizada com uso de dois agentes e com tempo de exposição reduzidos. Como modelo experimental foram utilizados 14 ratos Wistar, machos, com idade de dois meses pesando em média 330g. Após anestesia (Ketamina/Xilazina 90mg/Kg/10 mg/Kg), os animais tiverem seu tórax aberto e retirado o coração. O órgão foi canulado e perfundido através da aorta ascendente inicialmente com PBS, seguidos por perfusão com detergentes SDS 1% e Triton X-100 1%. Foram utilizadas técnicas de microscopia óptica onde as mostras após processadas foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E), Picrosírius e marcadas com anticorpos para laminina e fibronectina. Para microscopia eletrônica de transmissão e microscopia eletrônica de varredura as amostras após processadas foram obtidas imagens em seus respectivos microscópios. A quantificação de DNA foi feita através de kit DNeasy e as amostras entre os grupos foram consideradas significativas quando p<0,05, utilizando teste t de Student. Foi encontrada ausência de células nos arcabouços descelularizados, observada por microscopia óptica e a manutenção da estrutura do arcabouço da MEC foi visualizada macroscopicamente e microscopicamente onde foi revelada alteração na microestrutura. Os principais componentes da MEC se mantiveram no arcabouço descelularizado e a concentração de DNA teve uma redução de 87,04% comparando os grupos controle e descelularizado. Com uso de apenas dois agentes e a redução do tempo de exposição o processo se manteve eficaz na retirada de células, melhor preservação dos componentes da MEC, podendo utilizar os arcabouços para recelularização.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-08T12:30:02Z No. of bitstreams: 1 Magda Lorena Batista Freitas.pdf: 622059 bytes, checksum: 9031f13784fdf2af59f63bc6edb28403 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-08T12:30:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Magda Lorena Batista Freitas.pdf: 622059 bytes, checksum: 9031f13784fdf2af59f63bc6edb28403 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study aimed to assess the feasibility of the decellularization process in canine skin tissue using a simple method (dehydration glycerin) and conjugate (supersaturated sugar solution followed by dehydration of glycerin). After the preparation of supersaturated solution of sugar 300%, and departed a rate for physico - chemical and microbiological. Divided a skin fragment canine in 54 samples, distributed into 2 groups: 27 samples in group A (supersaturated sugar solution) and 27 samples in the group G (glycerin). Before the split, the fragment was subjected to microbiological evaluation. The storage temperature was 4 ° C. Subdivided into 6 study groups, each of 9 fragments. Subgroups A (A1, A2, A3) and subgroups G (G1, G2, G3). After 48 hours of immersion, each sample group were removed from the medium and subjected to microbiological evaluation new. The A1 group was immediately subjected to histological analysis. The other groups (A2 and A3) were transferred to glycerin and remained immersed for 13 days (A2) and 28 days (A3). Samples of the group G were taken from among the following chronology: G1 48 hours, G2 and G3 15 days with 30 days for histological evaluation. Changes in the morphology of collagen fibers and presence of cellular components in the epidermis and dermis ranked the treatments effective, effective with changes in collagen fibers and not effective. The physicochemical analysis of the supersaturated solution obtained pH 8.05, 25% moisture content and water activity 0.8487. With regard to microbiological evaluation of the solution, it was found absence of any microbial growth, as the skin was positive for Staphylococcus aureus. Only one (3.73%) The skin remained contaminated groups. A (11.11%) of the skin fragments group A1 was considered effective in decellularizing process change in the morphology of the collagen fibers. 88.88% of group A2 fragments presented decellularization the superficial and deep dermis with mild and moderate presence of cells. A (11.11%) of group A2 fragments decellularization was moderate in the epidermis. The group A3 was obtained the same results of the A2 group. With respect to the classification of groups G, the results were similar to group A at the same timing. It follows that the supersaturated sugar solution has antimicrobial action 48 hours of immersion and that both the supersaturated sugar solution as glycerin is not feasible to promote complete decellularization in canine cutaneous tissue. / Objetivou-se avaliar a viabilidade do processamento de descelularização em tecido cutâneo canino utilizando um método simples (desidratação em glicerina) e conjugado (solução supersaturada de açúcar seguido de desidratação em glicerina). Após a confecção da solução supersaturada de açúcar a 300 %, retirou- se uma alíquota para avaliação físico - química e microbiológica. Dividiu-se um fragmento cutâneo canino em 54 amostras, distribuídos em 2 grupos: 27 amostras no grupo A (solução supersaturada de açúcar) e o 27 amostras no grupo G (glicerina). Antes da divisão, o fragmento foi submetido a avaliação microbiológica. A temperatura de armazenamento foi 4°C. Subdividiu-se em 6 grupos de estudos, com 9 fragmentos cada. Subgrupos A (A1, A2, A3) e subgrupos G (G1, G2, G3). Após 48 horas de imersão, cada amostra do grupo A foram retiradas do meio e submetidas a nova avaliação microbiológica. O grupo A1 foi imediatamente submetido a análise histológica. Os demais grupos (A2 e A3) foram transferidos para glicerina e permaneceram imersos por 13 dias (A2) e 28 dias (A3). As amostras do grupo G foram retiradas do meio na seguinte cronologia: G1 com 48 horas, G2 com 15 dias e G3 com 30 dias, para a avaliação histológica. Alteração na morfologia das fibras colágenas e presença de componentes celulares na epiderme e derme classificou os tratamentos em eficaz, eficaz com alteração nas fibras colágenas e não eficaz. A análise físico-química da solução supersaturada obteve o pH 8,05, teor de umidade 25 % e a atividade de água 0,8487. Com relação a avaliação microbiológica da solução, verificou-se ausência de qualquer crescimento microbiano, já a pele foi positiva para Staphylococcus aureus. Apenas uma (3,73%) pele dos grupos A permaneceu contaminada. Um (11,11%) dos fragmentos cutâneos do grupo A1 foi considerado eficaz no processo descelularizante com alteração na morfologia das fibras colágenas. 88,88 % dos fragmentos do grupo A2 apresentou descelularização na derme superficial e profunda com discreta e moderada presença de células. Um (11,11%) dos fragmentos do grupo A2 houve descelularização moderada na epiderme. O grupo A3 obteve-se os mesmos resultados do grupo A2. Com relação a classificação dos grupos G, os resultados foram semelhantes ao grupo A na mesma cronologia. Conclui-se que a solução supersaturada de açúcar apresenta ação antimicrobiana com 48 horas de imersão e que tanto a solução supersaturada de açúcar quanto a de glicerina não são viáveis para promover completa descelularização em tecido cutâneo canino.

Matrizes extracelulares descelularizadas (dMEC) têm sido utilizadas com sucesso como biomateriais biológicos para regeneração tecidual, já que apresentam vantagens como semelhança estrutural com os tecidos naturais, biocompatibilidade , biodegradabilidade, capacidade de sinalização e homeostase tecidual. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de quatro protocolos para descelularização de músculo esquelético murino, objetivando a produção de matrizes extracelulares (MEC) acelulares para potenciais aplicações na engenharia de tecidos. Músculos tibiais foram coletados e congelados a -20°C ou armazenados a temperatura ambiente, seguido por descelularização em soluções contendo reagentes químicos EDTA + Tris, SDS e Triton X-100, os quais foram aplicados em diferentes sequências e analisados de acordo com modificações macroscópicas causadas nos tecidos, remoção de conteúdo celular e genético das matrizes e na capacidade de preservar a composição protéica e estrutura tridimensional da MEC. Observou-se a otimização da remoção de conteúdo celular, além da preservação da ultraestrutura e composição da MEC nos protocolos com congelação prévia a -20°C e descelularização inicial com a solução SDS, quando comparado àqueles que iniciaram com EDTA + Tris. O segundo objetivo deste trabalho foi comparar a biocompatibilidade da dMEC de músculo murino e placenta canina em modelo murino de injúria muscular. As dMEC foram produzidas a partir da placenta canina (1% SDS, 5 mM EDTA + 0,05% Tripsina, 1% Triton X-100) e do músculo esquelético tibial de ratos Wistar (Congelação a -20°C, 1% SDS, 5 mM EDTA + 50mM Tris, 1% Triton X-100). A lesão muscular foi realizada a partir de uma incisão de 1cm e divulsão na região média do músculo tibial; então, as dMEC foram implantadas. Um grupo cirúrgico, sem o implante, foi usado como um controle. Os animais foram eutanasiados depois de 3, 15 e 45 dias. Análise histológica e imunohistoquímica foram realizadas para avaliar a morfologia tecidual e a presença de infiltrado inflamatório e células em proliferação (CD163 e PCNA). No 3° dia após a implantação, uma intensa reação inflamatória (CD163+) e proliferação celular (PCNA+) foram observadas, adjacentes ao biomaterial, em ambas as matrizes. No 15° dia, o biomaterial de MEC placentária ainda preservou o infiltrado celular (CD163+ e PCNA+) e iniciou o processo de absorção do biomaterial, enquanto que a dMEC do músculo já estava completamente absorvida. Finalmente, depois dos 45 dias, ambos os biomateriais foram absorvidos e o músculo estava completamente cicatrizado, sem fibrose. Conclui-se que congelar as amostras a -20°C anteriormente ao processamento e submeter à incubação inicial em solução de 1% SDS (Protocolo 2B) favoreceu a descelularização de músculo esquelético murino. Além disso, dMEC xenogênicas e alogênicas foram reabsorvidas e apresentaram processos de integração distintos em modelo não-crítico de lesão muscular esquelética, sugerindo que eventuais alterações sistêmicas, observadas a longo prazo, sejam avaliadas, bem como, a validação da utilização destas matrizes em modelos de perda muscular volumétrica. / Decelularized extracellular matrices (dECM) have been successfully used as biological biomaterials for tissue engineering, since they present advantages such as structural similarity with natural tissues, biocompatibility, biodegradability, signaling capacity and tissue homeostasis. The first aim of this study was to evaluate the efficacy of four protocols for the decellularization of murine skeletal muscle for the production of acellular extracellular matrices (ECM) for potential applications in tissue engineering. Tibial muscle was frozen at -20°C or stored at room temperature, followed by decellularization in solutions containing EDTA + Tris, SDS and Triton X- 100 chemical reagents, which were applied in different sequences and analyzed according to macroscopic modifications , removal of cellular and genetic content and the ability to preserve the ECM composition and three-dimensional structure. Thus, the optimization of cellular removal was observed, as well as the preservation of the ECM ultrastructure and composition in the protocols with freezing at -20°C and initial decellularization with the SDS solution, when compared to those starting with EDTA + Tris. The second aim of this study was to compare the biocompatibility of the dECM of murine muscle and canine placenta in murine model of muscle injury. Decellularized ECM were produced from the canine placenta (1% SDS, 5 mM EDTA + 0.05% Trypsin, 1% Triton X-100) and the tibial muscle of Wistar rats (freezing at - 20°C, 1% SDS , 5 mM EDTA + 50 mM Tris, 1% Triton X-100). The muscle injury was performed followed a 1 cm incision and divulsion in the middle region of the tibial muscle, where the dECM were implanted. A surgical group, without the implant, was used as a control. The animals were euthanized after 3, 15 and 45 days. Histological and immunohistochemistry analyses were performed to evaluate the tissue morphology and the presence of inflammatory infiltrate and cells in proliferation (CD163 and PCNA). On the 3rd day after implantation, an intense inflammatory reaction (CD163+) and cell proliferation (PCNA+) were observed, adjacent to the biomaterial, in both matrices. On 15th day, the placenta biomaterial still preserved the cellular infiltrate (CD163+ and PCNA+) and started the biomaterial absorption process, while the muscle biomaterial was already fully absorbed. Finally, after 45th day, both biomaterials were absorbed and the muscle was completely healed, without fibrosis. It was concluded that freezing samples at -20°C prior to processing and subjecting to the initial incubation in 1% SDS solution (Protocol 2B) favored the decellularization of murine skeletal muscle. In addition, xenogeneic and allogeneic dECM were resorbed and presented a distinct integration process in a non-critical model of skeletal muscle, suggesting that potential systemic changes, observed in the long term evaluation, as well as the validation of the use of these matrices in volumetric muscle loss models must be tested.

Tese de mestrado integrado. Bioengenharia. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia.. 2011

A busca por técnicas alternativas para suprir a escassez de tecidos e órgãos danificados levou ao surgimento da engenharia de tecidos. Scaffolds biológicos criados a partir da matriz extracelular (MEC) de órgãos e tecidos tem sido uma promissora ferramenta aplicada para suprir esta necessidade. A matriz extracelular placentária descelularizada surge como uma potencial ferramenta para a produção de scaffolds biológicos para recelularização e implantação em áreas lesionadas. Para ser classificado como um scaffolds biológico ideal, a matriz extracelular deve ser acelular e ter preservada suas proteínas e características físicas para viabilizar a adesão celular. Neste contexto, desenvolvemos o scaffolds biológico descelularizado a partir de placentas caninas com 35 e 40 dias de gestação. A eficiência da descelularização foi confirmada pela ausência de conteúdo celular e quantidade de DNA remanescente. A arquitetura vascular e as proteínas da matriz extracelular, tais como, colágenos tipo I, III e IV, laminina e fibronectina, foram preservadas. Para o processo de recelularização, utilizamos células-tronco progenitoras endoteliais derivadas do saco vitelino canino (SVC) e células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas de medula óssea canina (CMOC) e de polpa de dente canina (CPDC). O processo de recelularização em placas não aderentes por 7 e 14 dias, na presença do scaffolds placentário secos em ponto crítico auxiliou na eficiência da recelularização, comprovada por imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura, evidenciando a adesão das células no scaffolds e comprovando ser um promissor biomaterial para utilização na medicina regenerativa tecidual. / The search for alternative techniques to address the scarcity of damaged tissues and organs has led to the emergence of tissue engineering. Biological scaffolds created from the extracellular matrix (ECM) of organs and tissues have been a promising applied tool to meet this need. The decellularized placental extracellular matrix appears as a potential tool for the production of biological scaffolds for recellularization and implantation in injured areas. To be classified as an ideal biological scaffold, the extracellular matrix must be acellular and have preserved its proteins and physical characteristics to enable cell adhesion. In this context, we developed the biological scaffold decellularized from canine placentas with 35 and 40 days of gestation. The efficiency of the decellularization was confirmed by the absence of cellular content and amount of DNA remaining. Vascular architecture and extracellular matrix proteins, such as collagens type I, III and IV, laminin and fibronectin, have been preserved. For the process of recellularization, we used stem cells derived from the canine yolk sac (CYSC) and mesenchymal stem cells (MSCs) derived from canine bone marrow (CBMC) and canine dental pulp (CDPC). The process of recellularization in non-adherent plaques for 7 and 14 days in the presence of placental scaffold dried at a critical point assisted in the efficiency of the recellularization, evidenced by immunocytochemistry and scanning electron microscopy, evidencing the adhesion of the cells in the scaffold and proving to be a promising biomaterial for use in tissue regenerative medicine.

Submitted by Onia Arantes Albuquerque (onia.ufg@gmail.com) on 2018-10-30T13:45:30Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Damasio Cardoso - 2018.pdf: 3279572 bytes, checksum: 019cc5a3b996db0774fcbab0c3c38770 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-30T15:16:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Damasio Cardoso - 2018.pdf: 3279572 bytes, checksum: 019cc5a3b996db0774fcbab0c3c38770 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-30T15:16:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Damasio Cardoso - 2018.pdf: 3279572 bytes, checksum: 019cc5a3b996db0774fcbab0c3c38770 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-10-01 / The loss of tissue because of congenital defects, pathological processes or traumas stimulated the development of tissue engineering, with the aim of repairing or replacing damaged tissues or organs. Due to its elastic properties, cartilaginous tissue has been widely used in reconstructive procedures. The use of this tissue as biomaterial mainly aims at maintaining the three-dimensional properties of the matrix, prioritizing structural, mechanical and biological support for the cells and allowing adequate remodeling. The ideal is to obtain a biomaterial with characteristics of biocompatibility, biofunctionality and mechanical resistance. In this sense, treatments were developed in order to minimize possible inflammatory processes and rejection of the biomembrane at the receptor. The aim of this study was to compare the histological changes in elastic cartilages of the external ear of bovines, submitted to different treatments of conservation with chemical treatment by alkaline solution. The samples were cleaned, standardized and divided into control group and treatment groups. The conservation methods were evaluated with supersaturated salt solution, supersaturated sugar solution, glycerine, formalin and alkaline solution. The samples were maintained in storage media for 60 days and in alkaline solution for 72 hours. After, they underwent preparation, analysis and interpretation on histological slides. In each treatment were evaluated microstructureal parameters, as the maintenance of elastic fibers, fundamental amorphous substance and decellularization. When comparing to the other groups, we verified that the cartilages treated in alkaline solution had better decellularization rate, fundamental amorphous substance removal and mantainance of elastic fibers tridimensional structure. For this reason, this group was considered the most effective method in this study. / A perda de tecidos devido a defeitos congênitos, processos patológicos ou traumas estimulou o desenvolvimento da engenharia tecidual com objetivo de reparo ou substituição de tecidos ou órgãos danificados. Devido às suas propriedades elásticas, o tecido cartilaginoso tem sido bastante utilizado em procedimentos reconstrutivos. A utilização deste tecido como biomaterial se dá principalmente pela manutenção das propriedades tridimensionais da matriz, priorizando sustentação estrutural, mecânica e biológica para as células e permitindo remodelamento adequado. O ideal é que se obtenha um biomaterial com características de biocompatibilidade, biofuncionalidade e resistência mecânica. Neste sentido, foram desenvolvidos tratamentos a fim de minimizar possíveis processos inflamatórios e rejeição da biomembrana no receptor. Objetivou-se comparar as alterações histológicas em cartilagens elásticas de orelha externa de bovinos submetidas a diferentes métodos de conservação com tratamento químico por solução alcalina. As amostras passaram por um processo de dissecação e higienização, sendo posteriormente divididas em grupo controle e grupos de tratamentos. Foram avaliados os métodos de conservação com solução supersaturada de sal, solução supersaturada de açúcar, glicerina, formalina e solução alcalina. As amostras foram mantidas em meios de conservação durante 60 dias e em solução alcalina durante 72 horas. Posteriormente passaram por preparação, análise e interpretação em lâminas histológicas. Em cada tratamento foram avaliados parâmetros microestruturais tais como a manutenção de fibras elásticas, substância fundamental amorfa e descelularização. Em comparação aos demais grupos, foi observado que o grupo do tratamento alcalino apresentou maior descelularização, remoção da substância fundamental amorfa e manutenção da estrutura tridimensional das fibras elásticas. Por isso, este grupo foi considerado o método mais efetivo neste estudo.

Matrizes extracelulares descelularizadas (dMEC) têm sido utilizadas com sucesso como biomateriais biológicos para regeneração tecidual, já que apresentam vantagens como semelhança estrutural com os tecidos naturais, biocompatibilidade , biodegradabilidade, capacidade de sinalização e homeostase tecidual. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de quatro protocolos para descelularização de músculo esquelético murino, objetivando a produção de matrizes extracelulares (MEC) acelulares para potenciais aplicações na engenharia de tecidos. Músculos tibiais foram coletados e congelados a -20°C ou armazenados a temperatura ambiente, seguido por descelularização em soluções contendo reagentes químicos EDTA + Tris, SDS e Triton X-100, os quais foram aplicados em diferentes sequências e analisados de acordo com modificações macroscópicas causadas nos tecidos, remoção de conteúdo celular e genético das matrizes e na capacidade de preservar a composição protéica e estrutura tridimensional da MEC. Observou-se a otimização da remoção de conteúdo celular, além da preservação da ultraestrutura e composição da MEC nos protocolos com congelação prévia a -20°C e descelularização inicial com a solução SDS, quando comparado àqueles que iniciaram com EDTA + Tris. O segundo objetivo deste trabalho foi comparar a biocompatibilidade da dMEC de músculo murino e placenta canina em modelo murino de injúria muscular. As dMEC foram produzidas a partir da placenta canina (1% SDS, 5 mM EDTA + 0,05% Tripsina, 1% Triton X-100) e do músculo esquelético tibial de ratos Wistar (Congelação a -20°C, 1% SDS, 5 mM EDTA + 50mM Tris, 1% Triton X-100). A lesão muscular foi realizada a partir de uma incisão de 1cm e divulsão na região média do músculo tibial; então, as dMEC foram implantadas. Um grupo cirúrgico, sem o implante, foi usado como um controle. Os animais foram eutanasiados depois de 3, 15 e 45 dias. Análise histológica e imunohistoquímica foram realizadas para avaliar a morfologia tecidual e a presença de infiltrado inflamatório e células em proliferação (CD163 e PCNA). No 3° dia após a implantação, uma intensa reação inflamatória (CD163+) e proliferação celular (PCNA+) foram observadas, adjacentes ao biomaterial, em ambas as matrizes. No 15° dia, o biomaterial de MEC placentária ainda preservou o infiltrado celular (CD163+ e PCNA+) e iniciou o processo de absorção do biomaterial, enquanto que a dMEC do músculo já estava completamente absorvida. Finalmente, depois dos 45 dias, ambos os biomateriais foram absorvidos e o músculo estava completamente cicatrizado, sem fibrose. Conclui-se que congelar as amostras a -20°C anteriormente ao processamento e submeter à incubação inicial em solução de 1% SDS (Protocolo 2B) favoreceu a descelularização de músculo esquelético murino. Além disso, dMEC xenogênicas e alogênicas foram reabsorvidas e apresentaram processos de integração distintos em modelo não-crítico de lesão muscular esquelética, sugerindo que eventuais alterações sistêmicas, observadas a longo prazo, sejam avaliadas, bem como, a validação da utilização destas matrizes em modelos de perda muscular volumétrica. / Decelularized extracellular matrices (dECM) have been successfully used as biological biomaterials for tissue engineering, since they present advantages such as structural similarity with natural tissues, biocompatibility, biodegradability, signaling capacity and tissue homeostasis. The first aim of this study was to evaluate the efficacy of four protocols for the decellularization of murine skeletal muscle for the production of acellular extracellular matrices (ECM) for potential applications in tissue engineering. Tibial muscle was frozen at -20°C or stored at room temperature, followed by decellularization in solutions containing EDTA + Tris, SDS and Triton X- 100 chemical reagents, which were applied in different sequences and analyzed according to macroscopic modifications , removal of cellular and genetic content and the ability to preserve the ECM composition and three-dimensional structure. Thus, the optimization of cellular removal was observed, as well as the preservation of the ECM ultrastructure and composition in the protocols with freezing at -20°C and initial decellularization with the SDS solution, when compared to those starting with EDTA + Tris. The second aim of this study was to compare the biocompatibility of the dECM of murine muscle and canine placenta in murine model of muscle injury. Decellularized ECM were produced from the canine placenta (1% SDS, 5 mM EDTA + 0.05% Trypsin, 1% Triton X-100) and the tibial muscle of Wistar rats (freezing at - 20°C, 1% SDS , 5 mM EDTA + 50 mM Tris, 1% Triton X-100). The muscle injury was performed followed a 1 cm incision and divulsion in the middle region of the tibial muscle, where the dECM were implanted. A surgical group, without the implant, was used as a control. The animals were euthanized after 3, 15 and 45 days. Histological and immunohistochemistry analyses were performed to evaluate the tissue morphology and the presence of inflammatory infiltrate and cells in proliferation (CD163 and PCNA). On the 3rd day after implantation, an intense inflammatory reaction (CD163+) and cell proliferation (PCNA+) were observed, adjacent to the biomaterial, in both matrices. On 15th day, the placenta biomaterial still preserved the cellular infiltrate (CD163+ and PCNA+) and started the biomaterial absorption process, while the muscle biomaterial was already fully absorbed. Finally, after 45th day, both biomaterials were absorbed and the muscle was completely healed, without fibrosis. It was concluded that freezing samples at -20°C prior to processing and subjecting to the initial incubation in 1% SDS solution (Protocol 2B) favored the decellularization of murine skeletal muscle. In addition, xenogeneic and allogeneic dECM were resorbed and presented a distinct integration process in a non-critical model of skeletal muscle, suggesting that potential systemic changes, observed in the long term evaluation, as well as the validation of the use of these matrices in volumetric muscle loss models must be tested.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-08-29T18:04:13Z No. of bitstreams: 1 franciscocarlosdaguia.pdf: 1708670 bytes, checksum: 0477005c8ad48befeb5fdbdaec28770a (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T11:46:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 franciscocarlosdaguia.pdf: 1708670 bytes, checksum: 0477005c8ad48befeb5fdbdaec28770a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T11:46:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 franciscocarlosdaguia.pdf: 1708670 bytes, checksum: 0477005c8ad48befeb5fdbdaec28770a (MD5) Previous issue date: 2016-03-07 / Lesões na musculatura esquelética podem ocorrer devido desordens genéticas ou trauma. Em lesões menos extensas nas quais vasos sanguíneos ou tecido conectivo não são atingidos o músculo consegue se regenerar sem intervenção médica. Contudo, lesões envolvendo porções maiores do tecido a regeneração não consegue ser completa sem intervenção. Desse modo, a engenharia tecidual aparece como uma alternativa para a regeneração completa do tecido. Dentre os biomateriais empregados na regeneração muscular, as matrizes extracelulares descelularizadas figuram como as classes de biomateriais mais empregadas. Contudo até o presente momento não foi desenvolvido uma metodologia de descelularização de tecido esquelético que preserve a arquitetura do tecido e sua composição química com uma taxa adequada de remoção de células. Desta forma, o presente trabalho almeja produzir um biomaterial composto da matriz extracelular de músculo esquelético de rato Wistar descelularizada. Para tanto, músculo esquelético de ratos Wistar machos foram extraídos e submetidos a lavagens sucessivas com soro fisiológico estéril. Posteriormente, os músculos foram congelados e fatiados, sendo então novamente lavado com soro fisiológico e submetido a irradiação com luz UV por 20 min em cada face do material. Após a irradiação, O tecido foi então digerido em uma solução de tripsina 0,05% contendo 0,2% de EDTA pH 7,6 por 2h a 37°C. Em seguida o tecido sofreu banhos, sob refrigeração, em solução de SDS 1% (p/v) por 4 a 5 dias com trocas diárias da solução. Finalmente o material foi submetido a um banho em água destilada por dois dias finalizando assim a descelularização. Após o procedimento foi obtido um biomaterial com aparência translucida e com uma concentração de DNA de 0,005 ± 0,002 ng de DNA por mg enquanto o controle não descelularizado apresentou uma concentração de 0,800 ± 0,107 ng de DNA por mg de tecido. Além disso, a análise em microscopia de fluorescência comprovou a inexistência de estruturas nucleares e a preservação da arquitetura do tecido após a descelularização. A presente metodologia representa um avanço nos protocolos de descelularização, pois foi obtido um nível de descelularização 10 vezes menor que o preconizado na literatura como ideal além permitir um patamar bem superior de descelularização mantendo a estrutura tridimensional do tecido em comparação a trabalhos similares. / Injuries in skeletal muscle can occur genetic disorders or trauma. In less extensive injuries in which blood vessels or connective tissue are not affected muscle can regenerate without medical intervention. However, injuries involving major portions of the tissue regeneration can be complete without intervention. Thus, tissue engineering is an alternative to the complete tissue regeneration. Among the biomaterials used in muscle regeneration, the decellularized extracellular matrices appear as the most used biomaterials classes. However until now it has not developed a methodology of skeletal tissue decellularization that preserves the tissue architecture and chemical composition with an appropriate rate of removal of cells. Thus, the present study aims to produce a biomaterial composed of the extracellular matrix decellularized skeletal muscle of Wistar rats. To this end, the skeletal muscle of male Wistar rats were extracted and subjected to repeated washings with sterile saline. Subsequently, the muscles were frozen and sliced, and then washed again with saline and subjected to irradiation with UV light for 20 min on each face of the material. After irradiation, the tissue was then digested in a 0.05% trypsin solution containing 0.2% EDTA pH 7.6 for 2h at 37 ° C. Then the tissue baths experienced under refrigeration, in 1% SDS solution (w / v) for 4 to 5 days with daily exchanges of solution. Finally the material was subjected to a bath in distilled water for two days thus finishing the decellularization. After the procedure was obtained a biomaterial with a translucent appearance and a DNA concentration of 0.005 ± 0.002 ng per mg of DNA while the control had not decellularized a concentration of 0.800 ± 0.107 ng DNA per mg of tissue. Furthermore, fluorescence microscopy analysis confirmed the absence of nuclear facilities and the maintenance of tissue architecture after decellularization. This methodology represents an advance in decellularization protocols because it was obtained a level of decellularization 10 times lower than that recommended in the literature as ideal addition allow much higher level of decellularization keeping the three-dimensional structure of the tissue compared to similar works

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-07-17T21:13:23Z No. of bitstreams: 1 Jessica Julioti Urbano.pdf: 3065396 bytes, checksum: 1e38f15e601296f027d3fd4cd280d051 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-17T21:13:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jessica Julioti Urbano.pdf: 3065396 bytes, checksum: 1e38f15e601296f027d3fd4cd280d051 (MD5) Previous issue date: 2016-11-30 / The actual scientific approach to bioengineering organs is based on the use of natural extracellular matrix of decellularized lung as initial departure for subsequent reconstruction of the organ for recellularization in a bioreactor. The decellularization technique can be performed by two infusion ways, one through the trachea and other by pulmonary artery. The aim of this studies was to investigate in an experimental animal model, by the occlusion at the end of inspiration (OEI) and movement equation (ME), the behavior of the elastic, viscous and viscoelastic mechanical properties, of mice lungs after the process of decellularization through the trachea and the pulmonary artery. Were used 30 male mice C57BL/6, weighing 17-18 g (7-8 weeks of age), anesthetized and euthanized by exsanguination through the abdominal aorta. The decellularization protocol comprised the following steps: collecting, cleaning, freezing and thawing, rinsing with sodium dodecyl sulfate and phosphate buffered saline. For the studies I and II, the lungs were divided into the control group (GC = 10), the decellularization group by the trachea (TDG = 10) and the pulmonary artery decellularization group (PDG = 10), 5 lungs in each group for the study I that had the analysis through the technique of OEI and 5 lungs in each group for the study II with analysis through the ME. In the study I, the values of static elastance (Eest = CG: 226.9 ± 4.1, PDG: 162.6 ± 3.9, TDG: 154.8 ± 1.7) and dynamics (Edyn = CG: 240 , 9 ± 6.7, PDG: 176 ± 5.4, TDG: 177.6 ± 1.6) were significantly lower in TDG and PDG when compared to CG. In study II, the value of lung resistance presented in TDG was significantly lower in relation to the other two groups (R = CG: 5.32 ± 0.26; PDG: 5.94 ± 0.24; TDG: 2.85 ± 0.14) and GC elastance was significantly higher in comparison with TDG and PDG, and in PDG the difference was significantly lower in relation to TDG (E = CG: 279 ± 13.81; PDG: 146 ± 19.04, TDG: 209.6 ± 12.06). We can observe in both the two-way decellularization are effective to provide a scaffold ideal for pulmonary later recellularization when evaluated by the OEI and ME. Furthermore, the decellularized lungs through the pulmonary artery may be used to create a pulmonary scaffold in less time, because the protocol can be performed in a day, which facilitates the process for obtaining functional lungs scaffolds. / A abordagem científica atual para a bioengenharia de órgãos é baseada na utilização da matriz extracelular natural do pulmão descelularizado como partida inicial para posterior reconstrução do órgão por recelularização em um biorreator. A técnica de descelularização pode ser realizada por duas vias de perfusão, uma através da traqueia e a outra pela artéria pulmonar. O objetivo deste estudo foi investigar em um modelo experimental animal, através da técnica de oclusão ao final da inspiração (OFI) e equação do movimento (EM), o comportamento das propriedades mecânicas elásticas, viscosas e viscoelásticas de pulmões descelularizados de camundongos pelos métodos de perfusão através da traqueia e da artéria pulmonar. Foram utilizados 30 camundongos machos da raça C57BL/6, com peso de 17-18 g (7-8 semanas de idade), anestesiados e eutanasiados por exsanguinação pela aorta abdominal. O protocolo de descelularização seguiu as etapas de coleta, limpeza, congelamento e descongelamento, lavagem com dodecil-sulfato de sódio e tampão fosfato-salino. Para a realização dos estudos I e II, os pulmões foram divididos em grupo controle (GC = 10), grupo descelularização pela traqueia (TDG = 10) e grupo descelularização pela artéria pulmonar (PDG = 10), sendo 5 pulmões em cada grupo para o estudo I que teve a análise através da técnica de OFI e 5 pulmões em cada grupo para o estudo II com análise através da EM. No estudo I, os valores de elastância estática (Eest = CG: 226,9 ± 4,1; PDG: 162,6 ± 3,9; TDG: 154,8 ± 1,7) e dinâmica (Edyn = CG: 240,9 ± 6,7; PDG: 176 ± 5,4; TDG: 177,6 ± 1,6) foram significativamente menores em TDG e PDG quando comparados com o CG. Já no estudo II, o valor da resistência pulmonar apresentado no TDG foi significativamente menor em relação aos outros dois grupos (R = CG: 5,32 ± 0,26; PDG: 5,94 ± 0,24; TDG: 2,85 ± 0,14) e o valor da elastância de CG apresentou-se maior de forma significativa em comparação com a TDG e PDG, e no PDG a diferença foi menor significativamente em relação à TDG (E = CG: 279 ± 13,81; PDG: 146 ± 19,04; TDG: 209,6 ± 12,06). Podemos observar que, quando avaliadas pelas técnicas de OFI e EM, as duas vias de descelularização foram eficazes na geração de um scaffold pulmonar ideal para posterior recelularização. Além disso, a técnica de descelularização através da artéria pulmonar mostrou-se eficaz para a obtenção de um scaffold pulmonar em menor período de tempo, uma vez que o protocolo pode ser realizado em um dia, o que facilita o processo de obtenção de pulmões funcionais.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-21T19:41:07Z No. of bitstreams: 1 Renata Kelly da Palma.pdf: 5650038 bytes, checksum: 27a64e62c897fb5ab5e43cf7a98e3250 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-21T19:41:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Kelly da Palma.pdf: 5650038 bytes, checksum: 27a64e62c897fb5ab5e43cf7a98e3250 (MD5) Previous issue date: 2015-10-07 / Organ biofabrication is a potential future alternative for obtaining viable organs for transplantation. Achieving intact scaffolds to be recellularized is a key step in lung bioengineering. The decellularizing agent perfusion technique via the pulmonary artery (PA) has been shown very effective in the process however; vascular perfusion pressure and flow vary along the pulmonary decellularization process. These factors are not fully understood it being very important in the optimization process, ensuring the integrity of the scaffold. The objectives were to characterize the pressure / pulmonary vascular flow associated with variation in vascular resistance (VR), according to the control of the infusion (pressure or flow) at the time of the infusion of different decellularizing agents in PA and determine the VR's behavior in relation to different pressures of lung inflation (tracheal pressure) and perfusion (pulmonary artery). For the first study, were used 43 lungs of the healthy mice (C57/BL6) with 7–8 weeks old and in the second study, lungs of the 5 healthy rat (Sprague- Dawley) with 7-8 weeks old. In the first study, after excision and tracheal cannulation, lungs were inflated at 10 cmH2O airway pressure and subjected to conventional decellularization process being perfused through PA. For the second study, the decellularized lungs were subjected to variations in tracheal pressure (0 to 15 cmH2O) and vascular pressure (5 to 30 cmH2O). Pressure (PPA) and flow (V’PA) at the pulmonary artery were continuously measured. The VR (VR=PPA/V’PA) considerably varied throughout lung decellularization, particularly for pressure controlled perfusion, as compared with flow-controlled perfusion. This study shows that monitoring perfusion mechanics throughout decellularization provides information relevant for optimizing the process time while ensuring that vascular pressure is kept within a safety range to preserve the organ scaffold integrity. Moreover, arterial lung pressure has more influence on behavior of vascular resistance in decellularized lungs than positive airway pressure, providing information that could be relevant for future cell repopulation by using the vascular resistance as a facilitator cell distribution throughout pulmonary circuit. / A geração artificial de órgãos é uma alternativa potencial na obtenção de órgãos viáveis para o transplante humano. Obter scaffolds perfeitos para serem recelularizados é um grande desafio e um passo fundamental na bioengenharia de pulmões. A técnica de perfusão de agentes descelularizantes através da artéria pulmonar (AP) tem se apresentado muito eficaz no processo entretanto, a pressão e o fluxo de perfusão vascular variam ao longo do processo de descelularização pulmonar. Estes fatores ainda não se encontram totalmente compreendidos, sendo muito importantes na otimização do processo, assegurando a integridade dos scaffolds. Os objetivos foram caracterizar a relação pressão/fluxo vascular pulmonar associado a variação de resistência vascular (RV), de acordo com o controle da perfusão (pressão ou fluxo) no momento da infusão de diferentes agentes descelularizantes na AP e determinar o comportamento da RV em relação a diferentes pressões de insuflação pulmonar (pressão traqueal) e de perfusão (artéria pulmonar). Para o primeiro estudo, foram utilizados 43 pulmões de camundongos machos saudáveis (C57/BL6) com idade de 7-8 semanas e no segundo estudo, pulmões de 5 ratos machos saudavéis (Sprague- Dawley) com idade de 7-8 semanas. No primeiro estudo, após excisão e canulação da traqueia e da artéria pulmonar, os pulmões foram insuflados a uma pressão de 10 cmH2O na via aérea e submetidos ao processo convencional de descelularização sendo perfundidos através da AP. Para o segundo estudo, os pulmões descelularizados foram submetidos a variações de pressão traqueal (0 à 15 cmH2O) e pressão vascular (5 à 30 cmH2O). A pressão na artéria pulmonar (PPA) e o fluxo da artéria pulmonar (V’PA) foram continuamente mensurados. A RV (Rv=PPA/V`PA.Rv) variou consideravelmente ao longo do processo de descelularização pulmonar, particularmente na perfusão por pressão controlada, quando comparado a perfusão controlada por fluxo. Concluimos que o monitoramento da mecânica de perfusão ao longo do processo de descelularização fornece informações relevantes na otimização do processo, assegurando um limite para pressão vascular, preservando a integridade do scaffold. Somado a estes achados um resultado relevante demonstrou que a pressão arterial pulmonar tem mais influência no comportamento da RV nos pulmões descelularizados do que pressão positiva nas vias aéreas, fornecendo informações importantes para futuro manejo no processo de recelularização utilizando a RV como um facilitador na distribuição celular através do arcabouço celular pulmonar.