A Pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome hipertensiva específica da gravidez, atualmente compreendida como uma doença sistêmica que cursa com inflamação, distúrbios da coagulação, desordens metabólicas, disfunção endotelial e desequilíbrio entre agentes vasoconstrictores e vasodilatadores. Contudo, a fisiopatologia da PE ainda não foi completamente elucidada. Este estudo investigou, em 51 gestantes, o estresse oxidativo, a via L-arginina-óxido nítrico e agregação plaquetária, na gestação normal (n=27) e na PE (n=24). Amostras de soro e plaquetas de gestantes normotensas e com PE, foram utilizadas para a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a carbonilação de proteínas, a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), assim como a produção de óxido nítrico (NO) pela formação de nitrito. Nas plaquetas foram avaliados, também, o transporte de L-arginina, a atividade da óxido nítrico sintase (NOS) e a agregação plaquetária. Em amostras de plasma foram realizadas medidas da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e do aminoácido L-arginina. Estes resultados demonstram que não há diferença nas medidas da proteína C reativa e da L-arginina entre gestantes normotensas e com PE. A formação de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx se encontram reduzidas no soro de gestantes com PE, enquanto a medida de TBARS e a carbonilação de proteínas não foi diferente das gestantes normotensas. Em plaquetas, o transporte de L-arginina pelo sistema y+L está diminuído na PE, ao passo que, a atividade da NOS, a formação de nitrito e a agregação plaquetária não modificaram em relação a gestação normal. A carbonilação de proteínas está aumentada em plaquetas na PE e a atividade da CAT está reduzida. Concluiu-se, que a menor formação de nitrito no soro sugere uma menor produção de NO em pacientes com PE. Este dado correlaciona com uma redução da defesa antioxidante observada pela menor atividade das enzimas SOD, CAT, GPx que deve contribuir para uma maior inativação do NO. Apesar dos níveis plasmáticos normais de L-arginina na PE, o sistema de transporte via y+L está reduzido em plaquetas, o que pode estar associado em parte ao estresse oxidativo que contribui para alterações físicas e estruturais da membrana, podendo afetar o influxo do aminoácido. Apesar do transporte de L-arginina reduzido e do aumento do estresse oxidativo em plaquetas na PE, não houve alteração da atividade da NOS, da produção de NO e da agregação plaquetária, indicando que mecanismos compensatórios possam estar contribuindo para a manutenção da produção de NO e de sua função modulatória sobre a agregação / Pre-eclampsia (PE) is a syndrome of pregnancy induced hypertension, currently understood as a systemic disease that leads to inflammation, coagulation, metabolic disorders, endothelial dysfunction and imbalance between vasoconstrictor and vasodilator agents. However, the pathophysiology of PE has not been fully elucidated. This study investigated in 51 women, oxidative stress and its correlation with the L-Arginine-nitric oxide and platelet aggregation in normal pregnancy (n = 27) and PE (n = 24). Serum and platelets of normotensive pregnant women and PE were used to measure thiobarbituric acid reactive species (TBARS), carbonyl proteins, the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) and nitric oxide (NO) production by the formation of nitrite. We also evaluated the transport of L-arginine, the activity of the nitric oxide synthase (NOS) and aggregation in platelets. Plasma samples were used to measure C-reactive protein highly sensitive (hsCRP) and the amino acid L-arginine. Our results demonstrate that there is no difference in the measurements of C-reactive protein and L-arginine at PE compared to normotensive pregnant women. The formation of nitrite and the activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and GPx are reduced in serum from women with PE, while the measure of TBARS and protein carbonyls were not different from normotensive pregnant women. In platelets, the transport of L-arginine by system y+L is reduced in PE, whereas the NOS activity, nitrite formation and platelet aggregation did not change compared to normal pregnancy. Carbonylation of proteins is increased in platelets in PE and CAT activity is reduced. In conclusion, the lower formation of nitrite in serum suggests a lower NO production in patients with PE. This finding correlates with a reduced antioxidant defense observed by the lower activity of SOD, CAT, GPx which might contribute to increased inactivation of NO. Despite normal plasma levels of L-arginine on PE, the transport system via y+L in platelets is reduced, which can be associated in part with oxidative stress that contributes to physical and structural changes of the membrane, which may affect the influx of amino acid. Despite of the reduced L-arginine transport and the increased oxidative stress in platelets from PE, no change occurs in NOS activity, NO production and platelet aggregation, indicating that compensatory mechanisms may be contributing to the maintenance of NO production and its modulatory role on aggregation

Orientador: Gilberto De Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maziero_AlineMendes_D.pdf: 2175096 bytes, checksum: b3e712ed8baf6a7f7d4ef12131b9e85a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os eosinófilos participam de processos inflamatórios e alérgicos. Estando relacionados com o sistema de imunidade inata do organismo, eles representam uma linha fundamental de defesa contra invasão microbiana e, quando ativados, produzem uma série de mediadores solúveis que atuam nas respostas inflamatórias e alérgicas. A relação entre a atividade dos eosinófilos e plaquetas foi observada nas últimas décadas por muitos cientistas. Estas observações incluem o aumento do número de eosinófilos associados a desordens plaquetárias, incluindo alterações na cascata de coagulação e agregação plaquetária. Com base nessas observações, a interação entre os eosinófilos e plaquetas foram analisadas na agregação plaquetária. Plaquetas humanas foram incubadas com a fração citosólica de eosinófilos, linhagem celular promielocítica humana HL-60 clone 15 e proteína catiônica do eosinófilo (ECP). A agregação em plasma rico em plaquetas (PRP) foi induzida por difosfato de adenosina, fator de ativação plaquetária, ácido araquidônico e colágeno, e as plaquetas lavadas (PL) foram ativadas por trombina. A agregação induzida por todos os agonistas foi inibida de maneira concentração de células dependente pela fração citosólica de eosinófilos. Esta inibição foi apenas parcialmente revertida pela prévia incubação dos eosinófilos com L-Nitro-Arginina-metil-éster (L-NAME). A prévia incubação com indometacina não impediu a inibição induzida pela fração citosólica. A separação da fração citosólica de eosinófilos por gel filtração em Sephadex G-75 mostrou que a atividade inibitória foi concentrada na fração de peso molecular mais baixo. As células HL -60 clone 15 diferenciadas em eosinófilos por 5 e 7 dias foram capazes de inibir a agregação plaquetária. A proteína de ECP inibiu a agregação plaquetária em PRP e PL. Esta inibição foi mais evidente em PL, e o ensaio de citotoxicidade com MTT demonstrou a viabilidade de plaquetas testadas, indicando que a inibição observada pela proteína ECP não ocorre simplesmente pela morte celular. A proteína EDN, clonada e expressa em sistema eucarioto, também apresentou efeito de inibição sobre a agregação plaquetária em PRP, enquanto que a proteína MBP não apresentou efeito de inibição da agregação plaquetária significativo. Os nossos resultados indicam que os eosinófilos desempenham um papel fundamental na inibição da agregação plaquetária / Abstract: Eosinophils participate in allergic and inflammatory processes, being related to innate immunity system of the body, they represent a fundamental line of defense against microbial invasion and when activated produce a number of soluble mediators that act in inflammatory and allergic responses. The relationship between the activity of eosinophils and platelets has been observed in recent decades by many scientists. These observations include increased numbers of eosinophils associated with platelet disorders, including changes in the coagulation cascade and platelet aggregation. Based on these observations, the interaction between eosinophils and platelets in platelet aggregation was analyze. Human platelets were incubated with eosinophil cytosolic fraction, promyelocytic human HL-60 clone 15 cell lineage, and eosinophil cationic protein (ECP). Platelet rich plasma (PRP) aggregation was induced by adenosine diphosphate, platelet activating factor, arachidonic acid, and collagen, and washed platelets (WP) were activated by thrombin. Aggregation induced by all agonists was dose dependently inhibited by eosinophil cytosolic fraction. This inhibition was only partially reversed by previous incubation of the eosinophils with L-Nitro-Arginine-Methyl-Ester (L-NAME). Previous incubation with indomethacin did not prevent the cytosolic fraction induced inhibition. The separation of eosinophil cytosolic fraction by gel filtration on Sephadex G-75 showed that the inhibitory activity was concentrated in the lower molecular weight fraction. HL-60 clone 15 cells differentiated into eosinophils for 5 and 7 day were able to inhibit platelet aggregation. The ECP protein inhibited the platelet aggregation on PRP and WP. This inhibition was more evident in WP, and the citotoxicity MTT assay proved the viability of tested platelets, showing that the observed inhibition by the ECP protein does not occur simply by cell death. The EDN protein, cloned and expressed in eukaryotic system, also showed inhibitory effect on platelet aggregation in PRP, whereas the protein MBP had no effect significative inhibiting platelet aggregation. Our results indicate that eosinophils play a fundamental role in platelet aggregation inhibition / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Orientadores: Marcio Zaffalon Casati, Antonio Wilson Sallum / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:00:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gurgel_BrunoCesardeVasconcelos_D.pdf: 2894613 bytes, checksum: b68eb32e96e2245f94ae9bfdc771987e (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar histometricamente o reparo ósseo obtido após a utilização do plasmarico em plaquetas (PRP) e/ou de membranas não reabsorvíveis no tratamentode defeitos ósseos peri-implantares, do tipo deiscência, criados cirurgicamente em cães. Foram utilizados 1O cães adultos, machos, sem raça definida, nos quais os pré-molares inferiores (P2,P3, P4)e o primeiro molar foram extraídos. Após 3 meses das extrações, os leitosparaos implantes foram criados e posteriormente 2 deiscências ósseas vestibulares bilaterais, sendo então inseridos 4 implantes dentais de titânio. As deiscências foram designadas aleatoriamente às seguintes modalidades terapêuticas: 1) controle; 2) ROG; 3)PRP;4) PRP + ROG. Após 3 meses do tratamento, os animais foram sacrificados e os blocos contendo os implantes e tecidos duros adjacentes processados para secções não descalcificadas. Na análise histométrica, os parâmetros avaliados foram o contato osso-implante, a área de preenchimento ósseo dentro das roscas, a área e a densidade de tecido ósseo formado na região fora das roscas. Análise deVariância foi utilizada para a análise estatística dos dados (p<O,O5). Os resultados demonstraram diferenças estatísticas significativas para todos os parâmetros analisados em favor dos grupos tratados commembrana (p<O,O5), no entanto, não foram observadas diferenças quando o PRP foi utilizado (p>O,O5). Dentro dos limites do presente estudo, pôde-se concluir ue o PRP não exerce efeitos adicionais no reparo ósseo e que a ROG promove uma maior formação óssea ao redor dos implantes dentais / Abstract: The aim of the present study was to evaluate, histometrically, the bone healing after utilizing the platelet-rich plasma (PRP) and/ornon-resorbable membranes on the treatment of peri-implant bone defects, deiscense type, surgically created in dogs. Ten mongrel male adult dogswere used; in which the threel ow premolars (P2,P3,P4) and the first molar were extracted. Three months after dental extraction, dental implants sites were created and lately two bilater albuccal bone dehiscence, in which four titanium dental implants were inserted. Dehiscences werer and omly assignedfor the following treatment: 1) contrai; 2) GBR;3) PRP; 4) PRP+ GBR. After 3 months, animais were sacrificed; dental implants and adjacent hard tissues were pracessed for undecalcified sections. At histometrical analysis,the parameter se valuated were bone-implant contact, bone filling area into threads, bone tissue area and bone density formed out the threads. Variance Analysis was utilized for statistical analysis of the data (p<O,O5). There sults demonstrated statically significant differences for ali parameters toward membrane treated graups (p<O,O5), although, differences were not observed when PRP was utilized( p>O,O5). Within the limits of the present study, it was concluded that PRP do not exert additional effects on bone healing and that guided bone regeneration provides increased bone formation araund dental implants / Doutorado / Periodontia / Doutor em Clínica Odontológica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A insuficiência renal crônica (IRC) e a hipertensão arterial sistêmica (HAS) são patologias com alta morbidade e mortalidade, consumindo grandes verbas de saúde pública. A disfunção endotelial presente tanto na IRC, como na hipertensão, contribui para a manutenção de elevada resistência periférica, favorecendo complicações como a aterosclerose. Esta disfunção endotelial é parte de um estado pró-trombótico, levando à ocorrência de eventos cardiovasculares, principal causa de morte nestas patologias. O óxido nítrico (NO) tem um papel importante na modulação da atividade plaquetária. Anormalidades na síntese e/ou inativação do NO são descritas tanto na insuficiência renal crônica como na hipertensão. Estudos prévios demonstraram uma redução do influxo de L-arginina em eritrócitos e plaquetas de pacientes hipertensos e em um modelo animal de hipertensão. Além disso, em IRC, nosso grupo mostrou uma ativação da via L-arginina-NO em plaquetas. O objetivo dessa tese é avaliar a via L-arginina-NO na HAS e em diferentes estágios da IRC, bem como investigar o ciclo da uréia, e a presença de marcadores de estresse nesses pacientes. De acordo com o presente estudo pôde-se verificar que não houve alteração na síntese de NO em eritrócitos na hipertensão, todavia ocorre uma ativação do ciclo da uréia, que pode ser dada pelo aumento do influxo de L-arginina eritrocitário previamente demonstrado. Não foi demonstrada diferença significativa na peroxidação lipídica sistêmica, em plaquetas ou eritrócitos na HAS. Em plaquetas, no entanto, houve uma redução da atividade da NO sintase (NOS), que não foi acompanhada por alteração da expressão das isoformas da NOS, da arginase, da fosfodiesterase 5 (PDE5) ou da guanilato ciclase (GC) solúvel. Essa redução na síntese de NO em plaquetas pode ser explicada por um menor influxo de L-arginina que está presente na hipertensão. Os eritrócitos de pacientes renais crônicos em hemodiálise mostraram um maior influxo de L-arginina associado a um aumento da expressão e da atividade da arginase, não havendo diferença na atividade da NOS. Além disso, apesar e não ter sido mostrado alteração nos marcadores de peroxidação lipídica em eritrócitos e plaquetas, foi detectado um aumento dos mesmos no soro de pacientes com IRC em hemodiálise. Por outro lado, as plaquetas dos mesmos pacientes apresentaram uma maior expressão da eNOS, da iNOS e da GC solúvel, acompanhada de uma redução da atividade da arginase, o que pode justificar a disfunção plaquetária que existe nesses pacientes. Plaquetas de pacientes portadores de IRC em tratamento conservador mostraram um aumento da atividade da NOS associado com maior expressão tanto da iNOS como da eNOS. Curiosamente foram detectados menores concentrações de 35-monofosfato de guanosina cíclica (GMPc), não havendo no entanto, diferença nos padrões de agregação plaquetária induzida por colágeno ou adenosina difosfato (ADP). As descobertas aqui apresentadas certamente contribuirão para uma melhor compreensão da fisiopatologia da HAS e da IRC. / Chronic renal failure (CRF) and essential hypertension (EH) are diseases associated with high rates of morbidity and mortality, consuming huge amounts of money from the public health system. The endothelial dysfunction existent in both diseases, CRF and EH, contributes to the maintenance of the high peripheral resistance, and contribute to circulatory complications such as atherosclerosis. This endothelial dysfunction is part of a pro-thrombotic state, leading to cardiovascular events, which are the major cause of death in these disorders. Nitric oxide (NO) plays an important role in the modulation of platelet function. Abnormalities of NO synthesis or inactivation are described in CRF and EH. It was previously reported an inhibition of L-arginine transport in erythrocytes of hypertensive patients and in an animal model of hypertension. Moreover, we have also demonstrated an activation of L-arginine-NO pathway in platelets taken from uraemic patients. The aim of the present thesis is to investigate L-arginine-NO pathway in arterial hypertension and in different stages of chronic renal failure. It will also be evaluated urea cycle and the presence of oxidative stress markers in these patients. According to the present study it was not detected any alteration in erythrocytres NO synthesis in hypertension, however, there was an activation of urea cycle, which could be explained by an increase in L-arginine influx. The present study has not demonstrated significative difference in markers of lipid peroxidation in the serum, platelets or erythrocytes in hypertension. In platelets however, there was an inhibition of NO synthase (NOS) activity without any alterations of NOS isoforms, arginase, phosphodiesterase 5 (PDE5) or soluble guanylyl cyclase (sGC) expression. This reduction of NO synthesis may be explained by a lower influx of L-arginine that is present on hypertension. Erythrocytes from chronic renal failure patients under haemodyalysis have shown an increased influx of L-arginine associated with a higher expression and activity of arginase with no difference in NOS activity. Therefore, although it was not shown abnormalities of lipid per oxidation markers in erythrocytes and platelets, it was detected increased levels of these markers in the serum of chronic renal failure patients under hemodyalysis. On the other hand, platelets from the same patients exhibited increased expression of eNOS, iNOS and soluble guanylyl cyclase associated with reduced arginase activity, which can explain the platelet dysfunction observed in these patients. Platelets taken from patients with chronic renal failure under conservative treatment have shown increased NOS activity associated with higher expression of both iNOS and eNOS. Curiously, it was been detected a lower concentration of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), although there was no difference in the patterns of platelet aggregation induced by collagen or adenosine diphosphate (ADP). The findings reported in this study may contribute to a better understanding of EH and CRF physiopathology.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A insuficiência renal crônica (IRC) e a hipertensão arterial sistêmica (HAS) são patologias com alta morbidade e mortalidade, consumindo grandes verbas de saúde pública. A disfunção endotelial presente tanto na IRC, como na hipertensão, contribui para a manutenção de elevada resistência periférica, favorecendo complicações como a aterosclerose. Esta disfunção endotelial é parte de um estado pró-trombótico, levando à ocorrência de eventos cardiovasculares, principal causa de morte nestas patologias. O óxido nítrico (NO) tem um papel importante na modulação da atividade plaquetária. Anormalidades na síntese e/ou inativação do NO são descritas tanto na insuficiência renal crônica como na hipertensão. Estudos prévios demonstraram uma redução do influxo de L-arginina em eritrócitos e plaquetas de pacientes hipertensos e em um modelo animal de hipertensão. Além disso, em IRC, nosso grupo mostrou uma ativação da via L-arginina-NO em plaquetas. O objetivo dessa tese é avaliar a via L-arginina-NO na HAS e em diferentes estágios da IRC, bem como investigar o ciclo da uréia, e a presença de marcadores de estresse nesses pacientes. De acordo com o presente estudo pôde-se verificar que não houve alteração na síntese de NO em eritrócitos na hipertensão, todavia ocorre uma ativação do ciclo da uréia, que pode ser dada pelo aumento do influxo de L-arginina eritrocitário previamente demonstrado. Não foi demonstrada diferença significativa na peroxidação lipídica sistêmica, em plaquetas ou eritrócitos na HAS. Em plaquetas, no entanto, houve uma redução da atividade da NO sintase (NOS), que não foi acompanhada por alteração da expressão das isoformas da NOS, da arginase, da fosfodiesterase 5 (PDE5) ou da guanilato ciclase (GC) solúvel. Essa redução na síntese de NO em plaquetas pode ser explicada por um menor influxo de L-arginina que está presente na hipertensão. Os eritrócitos de pacientes renais crônicos em hemodiálise mostraram um maior influxo de L-arginina associado a um aumento da expressão e da atividade da arginase, não havendo diferença na atividade da NOS. Além disso, apesar e não ter sido mostrado alteração nos marcadores de peroxidação lipídica em eritrócitos e plaquetas, foi detectado um aumento dos mesmos no soro de pacientes com IRC em hemodiálise. Por outro lado, as plaquetas dos mesmos pacientes apresentaram uma maior expressão da eNOS, da iNOS e da GC solúvel, acompanhada de uma redução da atividade da arginase, o que pode justificar a disfunção plaquetária que existe nesses pacientes. Plaquetas de pacientes portadores de IRC em tratamento conservador mostraram um aumento da atividade da NOS associado com maior expressão tanto da iNOS como da eNOS. Curiosamente foram detectados menores concentrações de 35-monofosfato de guanosina cíclica (GMPc), não havendo no entanto, diferença nos padrões de agregação plaquetária induzida por colágeno ou adenosina difosfato (ADP). As descobertas aqui apresentadas certamente contribuirão para uma melhor compreensão da fisiopatologia da HAS e da IRC. / Chronic renal failure (CRF) and essential hypertension (EH) are diseases associated with high rates of morbidity and mortality, consuming huge amounts of money from the public health system. The endothelial dysfunction existent in both diseases, CRF and EH, contributes to the maintenance of the high peripheral resistance, and contribute to circulatory complications such as atherosclerosis. This endothelial dysfunction is part of a pro-thrombotic state, leading to cardiovascular events, which are the major cause of death in these disorders. Nitric oxide (NO) plays an important role in the modulation of platelet function. Abnormalities of NO synthesis or inactivation are described in CRF and EH. It was previously reported an inhibition of L-arginine transport in erythrocytes of hypertensive patients and in an animal model of hypertension. Moreover, we have also demonstrated an activation of L-arginine-NO pathway in platelets taken from uraemic patients. The aim of the present thesis is to investigate L-arginine-NO pathway in arterial hypertension and in different stages of chronic renal failure. It will also be evaluated urea cycle and the presence of oxidative stress markers in these patients. According to the present study it was not detected any alteration in erythrocytres NO synthesis in hypertension, however, there was an activation of urea cycle, which could be explained by an increase in L-arginine influx. The present study has not demonstrated significative difference in markers of lipid peroxidation in the serum, platelets or erythrocytes in hypertension. In platelets however, there was an inhibition of NO synthase (NOS) activity without any alterations of NOS isoforms, arginase, phosphodiesterase 5 (PDE5) or soluble guanylyl cyclase (sGC) expression. This reduction of NO synthesis may be explained by a lower influx of L-arginine that is present on hypertension. Erythrocytes from chronic renal failure patients under haemodyalysis have shown an increased influx of L-arginine associated with a higher expression and activity of arginase with no difference in NOS activity. Therefore, although it was not shown abnormalities of lipid per oxidation markers in erythrocytes and platelets, it was detected increased levels of these markers in the serum of chronic renal failure patients under hemodyalysis. On the other hand, platelets from the same patients exhibited increased expression of eNOS, iNOS and soluble guanylyl cyclase associated with reduced arginase activity, which can explain the platelet dysfunction observed in these patients. Platelets taken from patients with chronic renal failure under conservative treatment have shown increased NOS activity associated with higher expression of both iNOS and eNOS. Curiously, it was been detected a lower concentration of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), although there was no difference in the patterns of platelet aggregation induced by collagen or adenosine diphosphate (ADP). The findings reported in this study may contribute to a better understanding of EH and CRF physiopathology.