Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCristyaneBenicio2010.pdf: 531193 bytes, checksum: 9a3d68036fe340ca60db84cb20f7066b (MD5) Previous issue date: 2010-02-18 / Objectives (i) Present review article focusing on pneumococcal vaccines and carriage; (ii) to validate sequential multiplex PCR for identifying pneumococcal capsular serotypes from children attending day-care centers; (iii) determine the multilocus sequence typing; (iv) to identify the capsular types of multiple colonies of S. pneumoniae isolates from a single sample of nasopharyngeal secretions of children attending day-care centers in Goiânia. Materials and Methods S. pneumoniae was obtained from health children less than 5 years old attending 62 day care centers of Goiânia. The laboratory procedures were performed according to WHO recommendations. Were selected 217 isolates (penicillin resistant and sensitive) for capsular typing by multiplex PCR technique. MLST was performed for 55 isolates representing the serotypes detected and the different susceptibility patterns for penicillin. Quellung reaction was used for typing isolates serotypes 6A, 6B, 18C and the isolates not typed by multiplex PCR. For 28 presumptive pneumococcal positive NP swabs, 3 colonies were picked to acess possible serotype diversity. Eighty four pneumococci were identified by conventionally procedure and multiplex PCR was performed. Results Serotypes were deduced for 177/217 (81.6%) of the pneumococcal. The most frequent serogroups/serotypes were 14, 6, 23F, 19F and 18. Multiple serotypes were detected in 13 specimens. Were found 19 MLST types and two new ST. Forty (18.4%) were not serotyped by the multiplex PCR and quellung reaction. The analysis of three colonies from the same NP permitted the detection of differente serotypes in 7/28 (25%) NP samples. Conclusion (i) The multiplex PCR is simple and cost-effective method for detecting multiple serotypes in nasopharyngeal isolates; (ii) and thus might be useful for the monitoring of pneumococcal colonization over time; (iii) the use of multiplex PCR can further broaden our understanding of the dynamics of pneumococcal carriage, including multiple serotypes, the effect of vaccination on carriage, and transmission, as well as surveillance of IPD and co-colonization. / Objetivos: (i) Apresentar uma revisão focando as vacinas pneumocócicas e o portador de S. pneumoniae na nasofaringe; (ii) realizar a tipagem capsular de pneumococos colonizadores de nasofaringe de crianças de creches pela técnica de multiplex PCR; (iii) identificar o perfil MLST dos pneumococos isolados na nasofaringe; (iv) identificar os tipos capsulares de múltiplas colônias de S. pneumoniae isolados de uma única amostra de secreção da nasofaringe de crianças que frequentam creches do município de Goiânia pela técnica de multiplex PCR. Material e Métodos: Um estudo de prevalência de portador de pneumococo foi conduzido de agosto a dezembro de 2005, em crianças de dois a 59 meses de idade, atendidas em 62 creches em Goiânia. Os procedimentos laboratoriais para isolamento e identificação dos pneumococos foram realizados de acordo com as técnicas recomendadas pela Organização Mundial de Saúde. Foram selecionados 217 isolados (resistentes e sensíveis à penicilina) para a tipagem capsular pela técnica de multiplex PCR. O perfil MLST foi realizado para 55 isolados, representando os sorotipos detectados e os diferentes perfis de suscetibilidade à penicilina. A reação de Quellung foi usada para tipar os sorotipos 6A, 6B e 18C e os isolados não tipados pelo multiplex PCR. Para a análise de múltiplas colônias de S. pneumoniae, utilizou-se 28 amostras positivas para pneumococo, das quais se recuperou 3 colônias de cada placa de ágar sangue, totalizando 84 colônias, que foram submetidas aos testes de tipagem fenotípica e caracterização capsular pela técnica de multiplex PCR. Resultados: Cento e setenta e sete sorotipos em duzentos e dezessete (177/217), totalizando 81,6% dos pneumococos foram tipados. Os sorotipos mais freqüentes foram 14, 6, 23F, 19F e 18. Foram identificadas múltiplas colônias em 13 amostras de nasofaringe. Foram observados 19 tipos MLST e dois novos tipos de seqüência (ST). Quarenta (18,4%) dos isolados não foram tipados pelo multiplex PCR e todos não tipados pela reação de Quellung. A análise de múltiplas colônias de S. pneumoniae pela técnica de multiplex PCR permitiu a detecção de mais de um tipo em 25% (7/28) das amostras. Conclusões: (i) O método de multiplex PCR mostrou-se seguro e simples na detecção de diferentes tipos capsulares incluídos na reação, além de mais barato; (ii) representou uma valiosa ferramenta em investigações de vigilância de pneumococos; (iii) Aplicação da técnica multiplex PCR permitiu o conhecimento da diversidade genética de pneumococos colonizadores da nasofaringe, detectando a dinâmica da colonização desta bactéria na população, incluindo a colonização por múltiplos sorotipos; a substituição ou mudança de sorotipo como resultado da vacinação; como também vigilância das doenças pneumocócicas invasivas.

Streptococcus pneumoniae é o principal causador da pneumonia bacteriana. As vacinas atualmente disponíveis contêm polissacarídeo capsular conjugado ou não com proteínas carreadoras. No entanto, elas apresentam elevado custo ou proteção reduzida nos grupos de risco (crianças abaixo de 5 anos de idade e idosos). Proteínas de superfície de S. pneumoniae, como a PsaA e PspA, são consideradas fortes candidatas vacinais. Com o objetivo de se desenvolver uma vacina de ampla cobertura e baixo custo contra pneumococos, os genes psaA e pspA foram clonados em vetores de expressão em E. coli, pAE e pET e as proteínas expressas foram purificadas por cromatografias de afinidade e de troca aniônica. O rendimento de proteína recombinante obtido com a construção baseada em pET foi 3 vezes maior que o obtido com pAE. Condições de cultivo foram estabelecidas utilizando meio definido com indução por IPTG e/ou por lactose. As cepas recombinantes estão adequadas para serem usadas em estudos para escalonamento da produção em biorreatores. / Streptococcus pneumoniae is the main causative agent of bacterial pneumonia. The current vaccines available contain capsular polysaccharide conjugated or not with carrier proteins. However these are either too expensive or do not protect the high-risk groups. Surface proteins of S. pneumoniae, such as PsaA and PspA, are considered strong vaccine candidates. With the aim of developing a broad-coverage and low-cost vaccine against pneumococcus, the psaA and pspA genes were cloned in E. coli expression vectors, pAE and pET and the expressed proteins were purified through affinity and anion exchange chromatography. The yield of the recombinant protein obtained with the construction based in pET was 3-fold higher than that obtained with pAE. Culture conditions were established using defined media with IPTG and/or lactose induction. The recombinant strains are now ready to undergo studies for scale-up of production in bioreactors.

Streptococcus pneumoniae é o principal causador da pneumonia bacteriana. As vacinas atualmente disponíveis contêm polissacarídeo capsular conjugado ou não com proteínas carreadoras. No entanto, elas apresentam elevado custo ou proteção reduzida nos grupos de risco (crianças abaixo de 5 anos de idade e idosos). Proteínas de superfície de S. pneumoniae, como a PsaA e PspA, são consideradas fortes candidatas vacinais. Com o objetivo de se desenvolver uma vacina de ampla cobertura e baixo custo contra pneumococos, os genes psaA e pspA foram clonados em vetores de expressão em E. coli, pAE e pET e as proteínas expressas foram purificadas por cromatografias de afinidade e de troca aniônica. O rendimento de proteína recombinante obtido com a construção baseada em pET foi 3 vezes maior que o obtido com pAE. Condições de cultivo foram estabelecidas utilizando meio definido com indução por IPTG e/ou por lactose. As cepas recombinantes estão adequadas para serem usadas em estudos para escalonamento da produção em biorreatores. / Streptococcus pneumoniae is the main causative agent of bacterial pneumonia. The current vaccines available contain capsular polysaccharide conjugated or not with carrier proteins. However these are either too expensive or do not protect the high-risk groups. Surface proteins of S. pneumoniae, such as PsaA and PspA, are considered strong vaccine candidates. With the aim of developing a broad-coverage and low-cost vaccine against pneumococcus, the psaA and pspA genes were cloned in E. coli expression vectors, pAE and pET and the expressed proteins were purified through affinity and anion exchange chromatography. The yield of the recombinant protein obtained with the construction based in pET was 3-fold higher than that obtained with pAE. Culture conditions were established using defined media with IPTG and/or lactose induction. The recombinant strains are now ready to undergo studies for scale-up of production in bioreactors.