Os pêssegos são frutos bastante sensíveis e, quando não manuseados adequadamente, podem estar sujeitos ao ataque de fitopatógenos. A podridão parda, causada pelo fungo Monilinia fructicola (G. Winter) Honey é a doença mais importante da cultura do pessegueiro no Brasil. O tratamento com fungicidas sintéticos é o principal método de controle empregado, entretanto, o seu uso pode selecionar estirpes resistentes do patógeno e, eventualmente, acarretar na presença de resíduos químicos nos frutos comercializados. A fim de desenvolver medidas alternativas, realizou-se esse trabalho com o objetivo de avaliar a eficiência de tratamentos com radiação UV-C, metassilicato de sódio (MS), oxicloreto de cálcio (OC) e Bacillus subtilis (BS), no controle da podridão parda em pêssegos. Foram realizados testes in vitro, para avaliar o efeito sobre os conídios do fungo, e a aplicação dos tratamentos nos frutos após a colheita, tanto em condições experimentais controladas como em uma linha de seleção comercial. Nos testes in vitro, a germinação dos conídios de dois isolados submetidos aos tratamentos com UV-C, MS e OC ficou abaixo de 4% enquanto nas testemunhas foi acima de 94%. Com relação ao número de unidades formadoras de colônias, o efeito foi semelhante à germinação. Em condições controladas, todas as doses de UV-C testadas reduziram a incidência de podridão parda nas cvs. Chiripá e Eragil em pelo menos 38%. Na mesma condição, as maiores concentrações de MS (1%) e de BS (2,5%) apresentaram controle de podridão acima de 80% em pêssegos ‘Eragil’. No teste realizado em 2012 na linha comercial de seleção de frutas, o maior controle foi alcançado pela dose de 0,1153kJ.m-2 de UV-C (83,3%), seguido pelo tratamento com 0,8% de MS (70,9%). Não houve alteração dos parâmetros de qualidade dos frutos devido à aplicação dos tratamentos. No ano seguinte, o tratamento com 1% de MS obteve controle de 89,42% e os demais tratamentos não exerceram controle satisfatório. Devido às variações nos tratamentos com UV-C e MS entre as safras, sugere-se a realização de mais estudos sobre a sua adaptação para uso em operações comerciais. / Peaches are delicate fruits and when not properly handled constitute a rich medium for the proliferation and development of microorganisms. Brown rot, caused by the fungus Monilinia fructicola (Wint) Honey is the main stone fruit disease in Brazil. Treatment with synthetic fungicides is the most widely used method, however, its use may well select resistant strains of the pathogen and possibly result in the presence of chemical residues on fruits. Intending the development of alternative measures to control brown rot in peaches, the present work was conducted on evaluations on the effectiveness of treatments with UV-C, sodium metasilicate (SM), calcium oxychloride (CO) and Bacillus subtilis (BS). Trials were performed in vitro as well as in vivo tests. The in vitro tests indicated that the germination of conidia of two isolates treated with UV-C, SM and CO was below 4% while in the control treatment conidia germination was above 94%. With regards to the number of colony forming units results were alike the ones of the conidia germination test. Under controlled conditions, all tested doses UV-C reduced the incidence of brown rot in ‘Chiripá’ and ‘Eragil’ peaches to at least 38%. In the same condition, the highest concentrations of SM (1%) and BS (2.5%) controlled brown rot above 80% in peaches of the cultivar Eragil. In the test conducted in 2012 at a commercial fruit selection line better control was achieved by the dose of 0.1153 kJ.m-2 UV-C (83.3%) followed by treatment with 0.8% SM in which decay control reached 70.9%. There was no change in fruit quality parameters due to treatment applications. In the second year of trials the treatment with 1% MS resulted in 89.42% decay control. The decay control outcome of the other treatments was not reasonable. Because variations in the treatments with UV-C and SM among trials, it is suggested that further studies on the adaptation of its use in commercial operations.

Os pêssegos são frutos bastante sensíveis e, quando não manuseados adequadamente, podem estar sujeitos ao ataque de fitopatógenos. A podridão parda, causada pelo fungo Monilinia fructicola (G. Winter) Honey é a doença mais importante da cultura do pessegueiro no Brasil. O tratamento com fungicidas sintéticos é o principal método de controle empregado, entretanto, o seu uso pode selecionar estirpes resistentes do patógeno e, eventualmente, acarretar na presença de resíduos químicos nos frutos comercializados. A fim de desenvolver medidas alternativas, realizou-se esse trabalho com o objetivo de avaliar a eficiência de tratamentos com radiação UV-C, metassilicato de sódio (MS), oxicloreto de cálcio (OC) e Bacillus subtilis (BS), no controle da podridão parda em pêssegos. Foram realizados testes in vitro, para avaliar o efeito sobre os conídios do fungo, e a aplicação dos tratamentos nos frutos após a colheita, tanto em condições experimentais controladas como em uma linha de seleção comercial. Nos testes in vitro, a germinação dos conídios de dois isolados submetidos aos tratamentos com UV-C, MS e OC ficou abaixo de 4% enquanto nas testemunhas foi acima de 94%. Com relação ao número de unidades formadoras de colônias, o efeito foi semelhante à germinação. Em condições controladas, todas as doses de UV-C testadas reduziram a incidência de podridão parda nas cvs. Chiripá e Eragil em pelo menos 38%. Na mesma condição, as maiores concentrações de MS (1%) e de BS (2,5%) apresentaram controle de podridão acima de 80% em pêssegos ‘Eragil’. No teste realizado em 2012 na linha comercial de seleção de frutas, o maior controle foi alcançado pela dose de 0,1153kJ.m-2 de UV-C (83,3%), seguido pelo tratamento com 0,8% de MS (70,9%). Não houve alteração dos parâmetros de qualidade dos frutos devido à aplicação dos tratamentos. No ano seguinte, o tratamento com 1% de MS obteve controle de 89,42% e os demais tratamentos não exerceram controle satisfatório. Devido às variações nos tratamentos com UV-C e MS entre as safras, sugere-se a realização de mais estudos sobre a sua adaptação para uso em operações comerciais. / Peaches are delicate fruits and when not properly handled constitute a rich medium for the proliferation and development of microorganisms. Brown rot, caused by the fungus Monilinia fructicola (Wint) Honey is the main stone fruit disease in Brazil. Treatment with synthetic fungicides is the most widely used method, however, its use may well select resistant strains of the pathogen and possibly result in the presence of chemical residues on fruits. Intending the development of alternative measures to control brown rot in peaches, the present work was conducted on evaluations on the effectiveness of treatments with UV-C, sodium metasilicate (SM), calcium oxychloride (CO) and Bacillus subtilis (BS). Trials were performed in vitro as well as in vivo tests. The in vitro tests indicated that the germination of conidia of two isolates treated with UV-C, SM and CO was below 4% while in the control treatment conidia germination was above 94%. With regards to the number of colony forming units results were alike the ones of the conidia germination test. Under controlled conditions, all tested doses UV-C reduced the incidence of brown rot in ‘Chiripá’ and ‘Eragil’ peaches to at least 38%. In the same condition, the highest concentrations of SM (1%) and BS (2.5%) controlled brown rot above 80% in peaches of the cultivar Eragil. In the test conducted in 2012 at a commercial fruit selection line better control was achieved by the dose of 0.1153 kJ.m-2 UV-C (83.3%) followed by treatment with 0.8% SM in which decay control reached 70.9%. There was no change in fruit quality parameters due to treatment applications. In the second year of trials the treatment with 1% MS resulted in 89.42% decay control. The decay control outcome of the other treatments was not reasonable. Because variations in the treatments with UV-C and SM among trials, it is suggested that further studies on the adaptation of its use in commercial operations.

Os pêssegos são frutos bastante sensíveis e, quando não manuseados adequadamente, podem estar sujeitos ao ataque de fitopatógenos. A podridão parda, causada pelo fungo Monilinia fructicola (G. Winter) Honey é a doença mais importante da cultura do pessegueiro no Brasil. O tratamento com fungicidas sintéticos é o principal método de controle empregado, entretanto, o seu uso pode selecionar estirpes resistentes do patógeno e, eventualmente, acarretar na presença de resíduos químicos nos frutos comercializados. A fim de desenvolver medidas alternativas, realizou-se esse trabalho com o objetivo de avaliar a eficiência de tratamentos com radiação UV-C, metassilicato de sódio (MS), oxicloreto de cálcio (OC) e Bacillus subtilis (BS), no controle da podridão parda em pêssegos. Foram realizados testes in vitro, para avaliar o efeito sobre os conídios do fungo, e a aplicação dos tratamentos nos frutos após a colheita, tanto em condições experimentais controladas como em uma linha de seleção comercial. Nos testes in vitro, a germinação dos conídios de dois isolados submetidos aos tratamentos com UV-C, MS e OC ficou abaixo de 4% enquanto nas testemunhas foi acima de 94%. Com relação ao número de unidades formadoras de colônias, o efeito foi semelhante à germinação. Em condições controladas, todas as doses de UV-C testadas reduziram a incidência de podridão parda nas cvs. Chiripá e Eragil em pelo menos 38%. Na mesma condição, as maiores concentrações de MS (1%) e de BS (2,5%) apresentaram controle de podridão acima de 80% em pêssegos ‘Eragil’. No teste realizado em 2012 na linha comercial de seleção de frutas, o maior controle foi alcançado pela dose de 0,1153kJ.m-2 de UV-C (83,3%), seguido pelo tratamento com 0,8% de MS (70,9%). Não houve alteração dos parâmetros de qualidade dos frutos devido à aplicação dos tratamentos. No ano seguinte, o tratamento com 1% de MS obteve controle de 89,42% e os demais tratamentos não exerceram controle satisfatório. Devido às variações nos tratamentos com UV-C e MS entre as safras, sugere-se a realização de mais estudos sobre a sua adaptação para uso em operações comerciais. / Peaches are delicate fruits and when not properly handled constitute a rich medium for the proliferation and development of microorganisms. Brown rot, caused by the fungus Monilinia fructicola (Wint) Honey is the main stone fruit disease in Brazil. Treatment with synthetic fungicides is the most widely used method, however, its use may well select resistant strains of the pathogen and possibly result in the presence of chemical residues on fruits. Intending the development of alternative measures to control brown rot in peaches, the present work was conducted on evaluations on the effectiveness of treatments with UV-C, sodium metasilicate (SM), calcium oxychloride (CO) and Bacillus subtilis (BS). Trials were performed in vitro as well as in vivo tests. The in vitro tests indicated that the germination of conidia of two isolates treated with UV-C, SM and CO was below 4% while in the control treatment conidia germination was above 94%. With regards to the number of colony forming units results were alike the ones of the conidia germination test. Under controlled conditions, all tested doses UV-C reduced the incidence of brown rot in ‘Chiripá’ and ‘Eragil’ peaches to at least 38%. In the same condition, the highest concentrations of SM (1%) and BS (2.5%) controlled brown rot above 80% in peaches of the cultivar Eragil. In the test conducted in 2012 at a commercial fruit selection line better control was achieved by the dose of 0.1153 kJ.m-2 UV-C (83.3%) followed by treatment with 0.8% SM in which decay control reached 70.9%. There was no change in fruit quality parameters due to treatment applications. In the second year of trials the treatment with 1% MS resulted in 89.42% decay control. The decay control outcome of the other treatments was not reasonable. Because variations in the treatments with UV-C and SM among trials, it is suggested that further studies on the adaptation of its use in commercial operations.

A produção de massa celular de Candida parapsilosis var, Intermedia e das leveduras naturais provenientes da"goga"(mel de cacau), safra/87, foram obtidas em meio Sabouraud líquido. O crescimento das células foi interrompido com 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas consecutivas de fermentação, sendo realizados posteriormente, testes para avaliar a produção, por parte das leveduras, de um fator capaz de inibir o crescimento de P. capsici. As células foram separadas do meio fermentado por centrifugação, sendo depois rompidas com material abrasivo, sob resfriamento, separando-se a fração subcelular dos seus restos celulares. Todas as fraç6es obtidas (meio fermentado, restos celulares e fração subcelular) foram esterilizadas por autoclavagem. Os testes de inibição do crescimento de P. capsici foram conduzidos em placas de Petri contendo meio BDA, onde foram adicionadas diferentes concentraç6es do meio fermentado, de células rompidas e de fração subcelular, res- pectivamente. Estas placas foram inoculadas com P. capsici, observando-se seu crescimento durante 5 (cinco) dias consecutivos em temperatura ambiente. Os resultados obtidos mostraram que houve a produção de um fator inibidor do crescimento de P. capsici, no meio fermentado de Candida parapsilosis var, Intermedia mais acentuado até cerca de 48 horas de fermentação. Mesmo após esse período, a produção do fator de inibição se manteve ligeiramente crescente até 144 horas de fermentação nas concentrações estudadas de 1:10 e 1:5. Já para as leveduras naturais da"goga"de cacau, o fator de inibição, produzido no meio com concentração 1:10 manteve-se ligeiramente crescente de 6 a 120 horas, aumentando vigorosamente até 100% após 144 horas, o que pode ser verificado mesmo em concentrações menores como 1:20. O fator de inibição do crescimento de P. capsici, sendo produzido no interior das células no curso da fermentação, foi liberado para o meio fermentado, como pode ser demonstrado nos experimentos com frações subcelulares e restos celulares, cuja inibição foi considerada insignificante em relação ao meio fermentado / In order to reduce the"dark gray rottenness"of the cacao-tree fruits, caused by P. capsici, experiments were carried out to promote the biological control of this fungus. Its growth was accomplished in potato-dextrose-agar (PDA), showing a rapid sporulation. The production of Candida parapsilosis var, Intermedia cell mass and natural yeasts from"goga"Cacao- honey), harvest/87, were obtained in liquid Sabouraud medium. The cells growth was interrupted with 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 consecutive hours of fermentation; posterior tests were made to evaluate the production of an inhibition factor, by yeasts, suitable to inhibit the P. capsici, growth. The cells were separated from the fermentated medium by centrifugation, and then, they were broken with abrasive material, by cooling; the subcell fraction was separated from its cell rests. All the fractions obtained (fermentated medium, cell rests, and subcell fraction) were sterilized by autoclaving. The inhibition tests of the P. capsici, growth were conducted on Petri plates, containing PDA medium, adding different concentrations of the fermentated medium, broken cells and subcell fractions, respectively. These plates were inoculated with P. capsici, its growth was observed during five consecutive days at room temperature. The obtained results showed that there was production of a P. capsici, growth inhibitor factor Candida parapsilosis var, Intermediafermentated medium, until almost 48 hours of fermentation. Thus, after this period, the production of the inhibition factor maintained light increase until 144 hours of fermentation, at the 1:10 and 1:5 concentrations. Otherwise, the inhibition factor produced by cacao"goga"natural yeasts, in a medium with the concentration 1 :10, maintained a light increase from 6 through 12Q hours, augmenting strongly till 100%, after 144 hours, the same could be observed in concentrations smaller than 1:20. The P. capsici, growth inhibition factor produced inside the cells during the fermentation, was released to the fermentated medium, as could be demonstrated in the experiments with subcell fractions and cell rests, whose inhibition was considered insignificant in relation to the fermentated medium

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. / O Brasil é um dos principais países produtores de madeira tropical no mundo, com destaque ao setor madeireiro da Amazônia, cuja atividade de exploração madeireira é intensa. O Laboratório de Produtos Florestais (LPF), entre as suas linhas de atuação, busca identificar e caracterizar tecnologicamente as madeiras dos diversos biomas brasileiros, conferindo-lhes a possibilidade de novos usos. Através da área de Biodegradação e Preservação, mantém a Coleção de fungos xilófagos como fonte de recursos biológicos viáveis ao desenvolvimento de suas pesquisas, especialmente para os testes de durabilidade natural da madeira (TDN). Essa é uma propriedade inerente à cada espécie madeireira que determina, em grande parte, a sua utilização, principalmente, em condições tropicais. Entre as principais causas de sua biodeterioração estão os fungos causadores de podridão, que podem degradar a madeira da árvore viva ou pós-colheita. Esses fungos são lignocelulolíticos, estando em sua maior parte classificados no filo Basidiomycota, onde são encontradas as espécies mais eficientes na degradação da biomassa lenhosa, que são essenciais ao ciclo global do carbono. Este trabalho apresentou o objetivo geral de identificar e caracterizar os isolados pertencentes à Coleção de fungos xilófagos do LPF associados às podridões branca e parda, e como objetivos específicos: confirmar a identidade dos isolados por meio de caracterização molecular; realizar triagem dos isolados com maior atividade enzimática; realizar ensaios enzimáticos para produção e caracterização de enzimas; realizar ensaios colorimétricos para obtenção de suas curvas de crescimento; e avaliar o potencial biodegradativo dos isolados por meio de ensaio de apodrecimento acelerado. Os isolados foram submetidos à técnica de purificação monohifal para, em seguida, serem utilizados nos testes. A identificação molecular final foi obtida por análises filogenéticas através do método de máxima verossimilhança. A caracterização enzimática foi realizada por meio de testes para CMCases, xilanases, FPases e lacases com os sobrenadantes de cada isolado, em dez dias de cultivo, sob agitação a 120 rpm e 28 ºC, em meio mínimo com serragem de Swartzia psilonema como fonte lignocelulósica. As curvas de crescimento foram determinadas por método indireto de quantificação de proteína intracelular. As análises moleculares permitiram gerar uma árvore filogenética para a classe Agaricomycetes, posicionando os isolados em clados segundo as suas respectivas ordens. A caracterização enzimática resultou na obtenção de curvas de atividades específicas, para as quais o isolado Trametes versicolor apresentou os maiores valores de atividade. O isolado da ordem Auriculariales indeterminado apresentou a maior taxa de crescimento, em detrimento dos menores valores de atividade enzimática observados. O ensaio de apodrecimento acelerado contribuiu para atestar o potencial biodegradativo de seis isolados, sendo que as maiores perdas de massa em S. psilonema foram registradas nos ensaios com Gloeophyllum trabeum e o isolado da ordem Polyporales indeterminado. Os resultados obtidos permitiram a autenticação parcial da coleção e a sugestão de novos mecanismos para o seu gerenciamento, com mudanças nos atuais métodos de preservação empregados. Os resultados ainda corroboraram a caracterização tecnológica pioneira quanto à durabilidade natural da madeira de S. psilonema. / Brazil is one of the main tropical timber producing countries in the world, with emphasis on the timber industry in the Amazon, whose logging activity is intense. The Forest Products Laboratory (LPF), among its lines of action, seeks to identify and technologically characterize the wood of the various Brazilian biomes, granting them the possibility of new uses. Through the area of Biodegradation and Preservation, it maintains the Collection of xylophagous fungi as a source of viable biological resources for the development of their researches, especially for the tests of natural durability of wood (TDN). This is an inherent property of each species of wood which largely determines its use, mainly in tropical conditions. Among the main causes of its biodeterioration are rotting fungi, which can degrade living or post-harvest tree wood. These fungi are lignocellulolytic, being mostly classified in the phylum Basidiomycota, where the most efficient species are found in the degradation of the woody biomass, which are essential to the global carbon cycle. This work presented the general objective of identifying and characterizing the isolates belonging to the LPF xylophagous fungi associated to white and brown rot, and specific objectives: to confirm the identity of the isolates by means of molecular characterization; screening of isolates with higher enzymatic activity; performing enzymatic assays for the production and characterization of enzymes; to perform colorimetric assays to obtain their growth curves; and to evaluate the biodegradable potential of the isolates by means of the accelerated rotting test. The isolates were submitted to the monohifal purification technique and then used in the tests. The final molecular identification was obtained by phylogenetic analysis using the maximum likelihood method. The enzymatic characterization was performed by means of tests for CMCases, xylanases, FPases and laccases with the supernatants of each isolate, in ten days of cultivation, under agitation at 120 rpm and 28 ºC, in a medium with Swartzia psilonema sawdust as a lignocellulosic source. Growth curves were determined by indirect method of intracellular protein quantification. The molecular analyzes allowed to generate a phylogenetic tree for the class Agaricomycetes, positioning the isolates in clades according to their respective orders. The enzymatic characterization resulted in the obtaining of curves of specific activities, for which the isolate Trametes versicolor presented the highest values of activity. The isolate of the order Auriculariales undetermined showed the highest growth rate, in detriment of the lowest values of enzymatic activity observed. The accelerated rotting assay contributed to the biodegradation potential of six isolates, and the highest mass losses in S. psilonema were recorded in the Gloeophyllum trabeum assays and the indeterminate Polyporales isolate. The results obtained allowed the partial authentication of the collection and the suggestion of new mechanisms for its management, with changes in the current preservation methods employed. The results also corroborated the pioneering technological characterization of the natural durability of S. psilonema wood.

A produção de massa celular de Candida parapsilosis var, Intermedia e das leveduras naturais provenientes da"goga"(mel de cacau), safra/87, foram obtidas em meio Sabouraud líquido. O crescimento das células foi interrompido com 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas consecutivas de fermentação, sendo realizados posteriormente, testes para avaliar a produção, por parte das leveduras, de um fator capaz de inibir o crescimento de P. capsici. As células foram separadas do meio fermentado por centrifugação, sendo depois rompidas com material abrasivo, sob resfriamento, separando-se a fração subcelular dos seus restos celulares. Todas as fraç6es obtidas (meio fermentado, restos celulares e fração subcelular) foram esterilizadas por autoclavagem. Os testes de inibição do crescimento de P. capsici foram conduzidos em placas de Petri contendo meio BDA, onde foram adicionadas diferentes concentraç6es do meio fermentado, de células rompidas e de fração subcelular, res- pectivamente. Estas placas foram inoculadas com P. capsici, observando-se seu crescimento durante 5 (cinco) dias consecutivos em temperatura ambiente. Os resultados obtidos mostraram que houve a produção de um fator inibidor do crescimento de P. capsici, no meio fermentado de Candida parapsilosis var, Intermedia mais acentuado até cerca de 48 horas de fermentação. Mesmo após esse período, a produção do fator de inibição se manteve ligeiramente crescente até 144 horas de fermentação nas concentrações estudadas de 1:10 e 1:5. Já para as leveduras naturais da"goga"de cacau, o fator de inibição, produzido no meio com concentração 1:10 manteve-se ligeiramente crescente de 6 a 120 horas, aumentando vigorosamente até 100% após 144 horas, o que pode ser verificado mesmo em concentrações menores como 1:20. O fator de inibição do crescimento de P. capsici, sendo produzido no interior das células no curso da fermentação, foi liberado para o meio fermentado, como pode ser demonstrado nos experimentos com frações subcelulares e restos celulares, cuja inibição foi considerada insignificante em relação ao meio fermentado / In order to reduce the"dark gray rottenness"of the cacao-tree fruits, caused by P. capsici, experiments were carried out to promote the biological control of this fungus. Its growth was accomplished in potato-dextrose-agar (PDA), showing a rapid sporulation. The production of Candida parapsilosis var, Intermedia cell mass and natural yeasts from"goga"Cacao- honey), harvest/87, were obtained in liquid Sabouraud medium. The cells growth was interrupted with 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 consecutive hours of fermentation; posterior tests were made to evaluate the production of an inhibition factor, by yeasts, suitable to inhibit the P. capsici, growth. The cells were separated from the fermentated medium by centrifugation, and then, they were broken with abrasive material, by cooling; the subcell fraction was separated from its cell rests. All the fractions obtained (fermentated medium, cell rests, and subcell fraction) were sterilized by autoclaving. The inhibition tests of the P. capsici, growth were conducted on Petri plates, containing PDA medium, adding different concentrations of the fermentated medium, broken cells and subcell fractions, respectively. These plates were inoculated with P. capsici, its growth was observed during five consecutive days at room temperature. The obtained results showed that there was production of a P. capsici, growth inhibitor factor Candida parapsilosis var, Intermediafermentated medium, until almost 48 hours of fermentation. Thus, after this period, the production of the inhibition factor maintained light increase until 144 hours of fermentation, at the 1:10 and 1:5 concentrations. Otherwise, the inhibition factor produced by cacao"goga"natural yeasts, in a medium with the concentration 1 :10, maintained a light increase from 6 through 12Q hours, augmenting strongly till 100%, after 144 hours, the same could be observed in concentrations smaller than 1:20. The P. capsici, growth inhibition factor produced inside the cells during the fermentation, was released to the fermentated medium, as could be demonstrated in the experiments with subcell fractions and cell rests, whose inhibition was considered insignificant in relation to the fermentated medium

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana. / White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.

O controle da podridão parda do pessegueiro (Monilinia fructicola) é realizado essencialmente por aplicações preventivas de fungicidas, em sua maioria sistêmicos com modo de ação específico. O uso contínuo desses fungicidas pode levar à seleção de indivíduos resistentes ao ingrediente ativo e, consequentemente, à perda da eficiência do controle nos pomares. A evolução da população de isolados resistentes ao longo do tempo, na ausência do fungicida, pode ser prevista com estudos de habilidade competitiva entre isolados resistentes e sensíveis. Portanto, a quantificação da adaptabilidade (fitness) e da estabilidade, necessárias para caracterizar os isolados encontrados em campo, auxiliarão nas estratégias antirresistência. Embora a importância da determinação da adaptabilidade de isolados resistentes seja reconhecida, há poucos métodos descritos para a análise da habilidade competitiva. Assim, esse trabalho verificou a adaptabilidade, a estabilidade e a habilidade competitiva de isolados de M. fructicola com diferentes níveis de sensibilidade à azoxistrobina em experimentos in vitro e em frutos de pêssegos (in natura e enlatado) utilizando metodologias de avaliação diversas. A caracterização dos isolados foi realizada in vitro, in vivo e molecularmente. Foram avaliados o diâmetro da colônia e a esporulação in vitro; o período de incubação e de latência, a incidência e a severidade da doença e a esporulação in vivo dos isolados separadamente. Os dados de esporulação in vitro foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis e os dados de crescimento micelial ao teste de Tukey com 5% de probabilidade. Para a análise dos dados in vivo, utilizou-se a análise multivariada. Dez transferências em meio de cultura sem fungicida foram realizadas para o estudo da estabilidade de dois isolados resistentes (SP08435 e SP09839) e um sensível (PR09638). A esporulação, a porcentagem de germinação de conídios e o diâmetro da colônia dos isolados em meio de cultura com fungicida foram avaliados em quatro transferências (inicial, terceira, sexta e última transferência). A habilidade competitiva foi verificada pela evolução da porcentagem de indivíduos resistentes no tempo entre um isolado resistente (SP09839) e um sensível à azoxistrobina (PR09638). Modelos lineares ou modelos lineares generalizados (GLM) foram utilizados para descrever o progresso da proporção do isolado resistente ao longo do tempo. Os isolados resistentes exibiram esporulação in vitro e taxa de crescimento micelial semelhantes aos sensíveis, além de apresentarem-se no mesmo grupo de similaridade que os isolados sensíveis. Nenhuma mutação no cyt b foi associada à resistência de M. fructicola à azoxistrobina (G143A, G137R, e F129L) e em todos os isolados foi observado o íntron antes do códon 143. Mesmo após 10 transferências em meio de cultura sem fungicida, os isolados resistentes à azoxistrobina não reduziram sua sensibilidade nem sua capacidade de esporulação e crescimento fora do pêssego. Independentemente da metodologia utilizada para avaliar a habilidade competitiva, a resistência à azoxistrobina não correspondeu a um custo adaptativo para M. fructicola, pois a proporção do isolado resistente manteve-se inalterada ao longo das transferências. O uso de pêssego enlatado é recomendado na substituição de frutos in natura para experimentos de habilidade competitiva. / Control of brown rot in peaches (caused by Monilinia fructicola) is mainly by preventive applications of fungicides, mostly single-target site. Repeated use of these fungicides can, however, select for resistant pathogen populations, which may result in failure of disease control. The evolution of resistant isolates in a population over time can be predicted with competitive ability assays between sensitive and resistant isolates. Therefore, studies quantifying pathogen fitness and stability are necessary to characterize field isolates and improve anti-resistant strategies. However, there are limited reports concerning the methodology used in competitive ability assays. This study determined the fitness of M. fructicola isolates with different levels of sensitivity to azoxystrobin in trials in vitro and in vivo (in natura and canned peaches) with different monocyclic components. Isolates characterization were carried out in vitro, in vivo and molecularly. Mycelial growth rate and sporulation were estimated in vitro, and disease incidence, severity, lesion sporulation, incubation and latent period were evaluated in peach fruit for sensitive and resistant isolates. Sporulation in vitro data were analyzed by Kruskal-Wallis test and mycelial growth rate with the Tukey test at 5% probability. For the in vivo experiments, multivariate analysis were carried out. Ten consecutive transfers on non-amended media were conducted to determine the stability of isolates (two resistant and one sensitive). Sporulation, percent spore germination and colony diameter on azoxystrobin amended media were also evaluated four times (the first, the third, the sixth and the last transfer). Competitive ability was investigated by testing the percentage increase of resistant individuals five generations after inoculation with a mix of azoxystrobin sensitive and resistant isolates. The competitive ability of sensitive and resistant isolates were compared with different variables as colony-forming unit and spore germination. Linear or generalized linear models (GLM) were adjusted to compare the progress of resistant isolates over time. All resistant isolates had in vitro sporulation and mycelial growth rate similar to sensitive isolates. All isolates sequenced presented an intron close to codon 143 and did not have any of the point mutations commonly associated with resistance to QoI fungicides (G143A, G137R, and F129L). After 10 transfers in PDA, colony diameter of resistant isolates was not reduced in azoxystrobin-amended media with 1 μg.ml-1 nor was their sporulation in vitro For all parameters used to measure competitive ability, no fitness cost was associated to M. fructicola isolates resistant to azoxystrobin. Canned peach is a viable option for studies aiming to determine fitness cost of resistant isolates.

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana. / White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Florestal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-20T13:36:50Z No. of bitstreams: 1 2012_DiegoMartinsStangerlin.pdf: 14158894 bytes, checksum: c1bfe7066feba591dfd67abac94b74a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2012-09-20T20:43:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DiegoMartinsStangerlin.pdf: 14158894 bytes, checksum: c1bfe7066feba591dfd67abac94b74a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-20T20:43:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DiegoMartinsStangerlin.pdf: 14158894 bytes, checksum: c1bfe7066feba591dfd67abac94b74a8 (MD5) / O objetivo desse estudo foi monitorar as propriedades biológicas, psico-físicas, físicas, químicas e mecânicas de madeiras submetidas ao ataque de fungos apodrecedores. Para tanto, corpos de prova de três espécies, Simarouba amara, Cariniana micrantha e Dipteryx odorata, foram submetidos a ensaios de apodrecimento acelerado com dois tipos de fungos, podridão parda (Gloeophyllum trabeum) e podridão branca (Trametes versicolor), durante 20 semanas, ao empregar metodologia adaptada da ASTM D 2017. A propriedade biológica foi monitorada por meio da determinação de perda de massa, método convencional. As técnicas não destrutivas de colorimetria e DRIFT-MIR foram empregadas no monitoramento dos parâmetros colorimétricos (psico-físicos), de acordo com o sistema CIELab, e químicos, mediante avaliação de diferentes intensidades de bandas relacionadas aos grupos funcionais dos polissacarídeos e lignina, respectivamente. A propriedade física da molhabilidade foi caracterizada com auxilio de goniômetro, por meio do qual foram medidos os ângulos de contato da gota d’água (técnica da gota sessil). E por fim, avaliou-se a perda de resistência mecânica por meio de metodologia destrutiva ao empregar o durômetro de Rockwell. Dentre os resultados expostos e discutidos pode-se destacar que: A madeira de Dipteryx odorata apresentou maior resistência natural, quando comparada a Simarouba amara e Cariniana micrantha. Em relação aos fungos apodrecedores, Gloeophyllum trabeum proporcionou maiores alterações nas propriedades tecnológicas das madeiras avaliadas. O período de 8 a 12 semanas, de acordo com ASTM D 2017, não foi suficiente para caracterização da resistência natural, por meio da perda de massa. O período de tempo necessário para caracterização da resistência natural ao fungo Trametes versicolor foi de 20, 14 e 12 semanas, enquanto que para Gloeophyllum trabeum foi de 20, 18 e 14 semanas para as madeiras de Simarouba amara, Cariniana micrantha e Dipteryx odorata, respectivamente. O ensaio de dureza Rockwell apresentou viabilidade para ser empregado como ferramenta complementar ou principal na caracterização da deterioração da madeira por fungos apodrecedores sendo sensível na predição dos estágios iniciais. Dentre os parâmetros colorimétricos, os principais estimadores da resistência natural aos fungos de podridão branca e parda foram a coordenada b* e a claridade (L*), respectivamente. Por meio do DRIFTMIR verificou-se que o ataque do fungo Trametes versicolor proporcionou redução, de modo indistinto, na intensidade das bandas intrínsecas aos polissacarídeos e a lignina, exceto para a madeira de Cariniana micrantha. Para o fungo Gloeophyllum trabeum, apesar das intensidades de algumas bandas relacionadas a lignina serem decrescidas, a principal característica foi a redução da intensidade das bandas relacionadas aos polissacarídeos. Com relaçãoo a técnica da gota séssil apesar do alto desvio padrão do angulo de contato, as amostras apodrecidas apresentaram tendência de redução do espalhamento da gota d’água, proporcionando menor molhabilidade. De modo geral, as técnicas não convencionais de ensaio foram eficientes na diferenciação dos ataques proporcionados pela podridão branca e parda. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study was to evaluate biological, psycho-physical, physical, chemical and mechanical properties of wood submitted to decay fungi. For this purpose, samples of three species, Simarouba amara, Cariniana micrantha and Dipteryx odorata, were submitted for accelerated decay with two types of fungi, brown rot (Gloeophyllum trabeum) and white rot (Trametes versicolor), for 20 weeks, using the methodology adapted of ASTM D 2017. The biological property was monitored by determining the weight loss, the conventional method. The non-destructive techniques colorimetry and DRIFT-MIR were used in monitoring the colorimetric (psycho-physical) parameters, according to the CIELab system, and chemicals, through evaluation of different intensities of bands related to the functional groups of the polysaccharides and lignin, respectively. The physical property of wetting was characterized with the aid of a goniometer, by means of which were measured drop of water contact angles (sessile drop technique). Finally, we evaluated the mechanical strength loss by destructive methods to use the Rockwell hardness tester. Among the results presented and discussed may be noted that: The wood Dipteryx odorata showed a higher natural resistance when compared to Simarouba amara and Cariniana micrantha. For rot fungi, Gloeophyllum trabeum resulted in higher changes in technological properties of wood tested. The period 8-12 weeks, according to ASTM D 2017, was not sufficient for characterization of the natural resistance by mass loss. The time required for the characterization of natural resistance to fungi Trametes versicolor was 20, 14 and 12 weeks, while for Gloeophyllum trabeum was 20, 18 and 14 weeks for the wood Simarouba amara, Cariniana micrantha and Dipteryx odorata, respectively. The Rockwell hardness test was viable to be used as a complementary or principal tool in the characterization of deterioration of wood by decay fungi, being sensitive in predicting the early stages. Among the colorimetric parameters, the main estimators of natural resistance to white rot fungi and brown were the coordinate b* and lightness (L*), respectively. Through the DRIFT-MIR was found that the fungus attack Trametes versicolor provided reduction in a similar way, the intensity of bands intrinsic to polysaccharides and lignin, except for wood Cariniana micrantha. To the fungus Gloeophyllum trabeum, although some of the intensities of bands related to the lignin being reduced, the main characteristic was the reduction in intensity of the bands related to the polysaccharides. With respect to the sessile drop technique, although high standard deviation of the contact angle, the decayed samples tended to reduce the scattering drop of water, with lower wettability. In general, the test unconventional techniques were able to differentiate the attacks provided by white and brown rot.