A diferenciação morfo-fisiológica entre rainhas e operárias de Apis mellifera decorre da alimentação recebida durante o desenvolvimento larval. Dentre as diferenças morfológicas entre as duas castas encontram-se estruturas especializadas para a coleta de pólen e própolis, localizadas nas pernas metatorácicas das operárias, ausentes nas pernas de rainhas. Os padrões de expressão de Ultrabithorax (Ubx) durante o desenvolvimento de operárias e rainhas estão associados aos padrões de cerdas das pernas de fêmeas adultas. Pernas mesotorácicas de operárias apresentam estruturas descritas como importantes na coleta de pólen, ausentes em rainhas. Por outro lado, as asas não possuem estruturas casta-específicas. No presente trabalho, análises globais de transcrição gênica por hibridação de lâminas de microarrays a partir de RNA total de pernas metatorácicas de operárias e rainhas em três estágios do desenvolvimento mostram 1952 genes diferencialmente expressos. Discos de pernas metatorácicas de larvas no início do quinto estágio larval, quando comparados aos de estágios mais tardios no desenvolvimento, têm alto níveis de transcritos de ativadores de Ubx, o qual está 25 vezes mais expresso em estágios subseqüentes do desenvolvimento. Buscas por motivos de ligação de fatores de transcrição nos promotores dos grupos de genes diferencialmente expressos revelam que os motivos para ligação de Ubx, Zeste e Twist estão super-representados em um dos conjuntos analisados. Dentro deste grupo, estão presentes genes cujos ortólogos em Drosophila são controlados por Ubx, como o caso do gene lola. Análises do processamento do mRNA de Ubx em pernas e asas de ambas as castas mostram que são produzidas três isoformas diferentes quanto à presença de dois microéxons (m1 and m2), que contêm 42 nt and 53 nt, respectivamente. A isoforma IIa-like, que contém o m2, entretanto, parece não ser capaz de produzir uma proteína Hox, já que possui um códon de terminação antes do homeodomínio. O perfil de transcrição diferencial de Ubx entre as castas está associado a apêndices que apresentam diferenças morfológicas, sendo Ubx mais transcrito em pernas meso e metatorácicas de operárias que rainhas. Quando analisadas as porcentagens de expressão de cada isoforma nos apêndices, claramente a isoforma IVa-like, sem microéxons, é a mais transcrita em todos os tecidos. Entretanto, nota-se que nas asas anteriores, onde há menos Ubx, a isoforma IIa-like é proporcionalmente mais transcrita que II nos outros apêndices. Destaca-se uma tendência à inclusão do microéxon m1 (isoforma IIIa-like) ao mRNA de Ubx transcrito em asas posteriores e pernas de rainhas em comparação a operárias, em detrimento da isoforma IVa-like. Análises do uso da região 3UTR em pupas de operárias mostram que há um microssatélite transcrito na porção distal da região 3UTR deUbx. A estrutura secundária predita agrupa separadamente as regiões codificadora e as regiões 3UTR proximal e distal. Análises de seqüenciamento de última geração revelaram que oito dos 51 microRNAs com sítios-alvo preditos na região 3UTR de Ubx estão mais expressos em asas anteriores, e outros dois em asas posteriores. Assim, nossos resultados mostram que o controle da expressão diferencial de Ubx é dada pela ativação desse gene por fatores de transcrição que se ligam ao promotor, controle do splicing alternativo, e expressão de microRNAs diferencial em cada casta e apêndice, controlando, assim, a morfogênese diferencial dos apêndices de fêmeas observada em A. mellifera. / Along with differences in physiological and behavioral characteristics, workers and queens of Apis mellifera also differ in appendage morphology. Some appendage specializations in the hind legs of honeybee workers, which are highly specialized pollinators, deserve special attention. The hind tibia of the worker has an expanded bristle-free region used for carrying pollen and propolis, the corbicula. In queens, this structure is absent. Although these morphological differences have been well characterized, the genetic inputs triggering the development of this alternative morphology have remained unknown. Through microarray analysis, we detected 1,952 genes that are differentially expressed during worker versus queen hind leg development. The gene expression signatures of the two castes have similar patterns of genes controlling development. At the beginning of the last larval instar, Ultrabithorax (Ubx) activators are more strongly expressed than in prepupae and early pupae; at this time Ubx expression is approximately 25 times higher. Within the gene expression signature, we identified a cluster formed by genes in which Ubx, Twist and Zeste binding sites are over-represented. This cluster includes genes for which Drosophila orthologs are known to be bound by Ubx, as in the case of lola. We also tested the extent of Ubx mRNA processing during wing and leg development. Unexpectedly, we found Ubx alternative splicing in both workers and queens; there were two microexons (m1 and m2) encoding 42 nt and 53 nt, respectively, arguing against the hypothesis that alternative splicing occurs exclusively within the Diptera. Inclusion of the m2 exon inserts a stop codon upstream from the exon containing the homeodomain, producing a truncated protein. Moreover, these bee microexons conserve the nucleotides known to be important for alternative splicing in Drosophila. During bee wing development, Ubx mRNA isoforms are transcribed in similar amounts in both castes; however, during leg development, queens produce 60% of the Ubx levels transcribed by workers. Analysis of 3UTR usage during bee development revealed a microsatellite region transcribed within the Ubx 3UTR. The predicted secondary structure locations separated the coding region into three branches and the proximal and the distal 3UTR regions. Deep-sequencing analysis revealed that eight out of 51 miRNAs predicted to target the Ubx mRNA are more highly expressed in worker forewings and two are more expressed in the hindwings. Therefore, we conclude that Ubx differential expression is activated by transcription factors that bind to its promoter, by control of alternative splicing, and moreover by microRNAs differentially expressed according to tissue and caste, resulting in differential morphogenesis of the hind leg in honeybee females.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bees of the genus Apis are widely distributed throughout the tropical regions of the planet, playing fundamental role as pollinators. In Brazil they are a polihibrid formed by the crossbreed of African subspecies Apis mellifera scutellata and European subspecies, where due generalist habits the introgression of alleles of the African subspecies has led to a predominance of the your characteristics in relation to European subspecies. The scope of this work was to characterize the divergence among 71 colonies of Africanized honey bees located in three distinct ecoregions (Forest zone, Ecotone and Semiarid) of the State of Sergipe Brazilian northeast, through morphological and behavioral analyses, in order to assess the relationship between the effects of seasonality and the different patterns morphoclimatic ecoregions in morphology, behavior and distribution of these groups of bees. In this work we used geometric morphometric techniques observing the anatomical landmarks of the wing venation with the aid of software Tps / DIG and evaluation of hygienic behavior by pin-killing method in two distinct seasonal periods, the dry and rainy. The correlation between the hygienic behavior indexes and environmental variables was obtained by Spearman correlation and the causal relations by path analysis, with the aid of software R. The morphometric analyzes were performed by means of multivariate analysis with the aid of software MORPHOJ and PAST. Thus, the results of this study demonstrated that the high gene flow evidenced between studied colonies and pronounced differences in apiaries and ecoregions with influence of altitude on shape (r=0,06239; p= 0.05) and size (0.001) contributed therefore for the separation of these groups as result of phenotypic plasticity rather than genetic divergence among populations of Africanized honey bees. Furthermore, the results also demonstrated significant difference in hygienic behavior of these populations between the dry and rainy season (p= 0,022; α=0,05) and between ecoregions (p=0,001; α=0,05) with the influence of temperature (ρ=0,065; p=0,471; α=0,05) and altitude (ρ=-0,294; p=0,001 α=0,05) upon pluviosity (ρ=0,274; p=0,002; α=0,05) that demonstrated be the main modulator of hygienic behavior, thus reinforcing the influence of environmental factors on the expression of this trait. Therefore, it is concluded by the influence of stochastic factors in the morphology, behavior and distribution of Africanized honey bees, where polyphenisms found denote the high genetic variability of these populations, a fact that can be exploited in future conservation, handling and breeding programs. / As abelhas do genero Apis estao amplamente distribuidas pelas regioes tropicais do planeta, sendo fundamentais no papel de polinizadores. No Brasil, estas sao um poliibrido formado pelo cruzamento entre a subespecie africana Apis mellifera scutellata e as subespecies europeias. Devido a habitos generalistas, a introgressao de alelos da subespecie africana tem levado a uma predominancia nas caracteristicas desta em relacao as europeias. O presente trabalho teve como escopo a caracterizacao da divergencia entre 71 colonias de A. mellifera africanizadas, situadas em tres distintas ecorregioes (Zona da Mata, Agreste e Sertao) do Estado de Sergipe, nordeste do Brasil, por meio de analises morfologicas e comportamentais, com o objetivo de avaliar as relacoes entre os efeitos da sazonalidade e dos distintos padroes morfoclimaticos das ecorregioes na morfologia, comportamento e distribuicao desses grupos de abelhas. Neste estudo foram utilizadas tecnicas de morfometria geometrica, com observacao dos marcos anatomicos da venacao alar, com o auxilio do software Tps/DIG e avaliacao do comportamento higienico pelo metodo de perfuracao de crias em dois periodos estacionais, o seco e o chuvoso. A correlacao entre os indices de comportamento higienico e as variaveis ambientais foi obtida por meio da correlacao de Spearman e as relacoes de causalidade por meio da analise de trilha, com o auxilio do software R. As analises morfometricas foram realizadas por meio de tecnicas de analise multivariada, com o auxilio dos softwares MORPHOJ e PAST. Assim, os resultados deste trabalho demonstraram que o intenso fluxo genico evidenciado entre as colonias estudadas e as diferencas pronunciadas nos distintos apiarios e ecorregioes, com influencia da altitude na forma (r=0,06239; p= 0.05) e tamanho (0.001) contribuiram, portanto, para a separacao desses grupos como resultado da plasticidade fenotipica e nao de divergencia genetica entre as populacoes de abelhas africanizadas. Alem disso, os resultados tambem demonstraram haver diferenca significativa no comportamento higienico dessas populacoes, entre os periodos seco e chuvoso (p= 0,022 ¿=0,05) e entre as ecorregioes (p=0,001; ¿=0,05), com influencia da temperatura ( Ï=0,065 p=0,471; ¿=0,05) e altitude ( Ï=-0,294; p=0,001; ¿=0,05) sobre a pluviosidade ( Ï=0,274 p=0,002; ¿=0,05) sendo esta o principal modulador do comportamento higienico, reforcando a influencia de fatores ambientais na manifestacao dessa caracteristica. Portanto, conclui-se pela influencia de fatores estocasticos na morfologia, comportamento e distribuicao das abelhas africanizadas, onde os polifenismos encontrados denotam a grande variabilidade genetica dessas populacoes, fato esse que pode ser explorado em futuros programas de conservacao, manejo e melhoramento.