Membranas celulares (MCs; Cell Sheets), constituídas por células-tronco (CTs), são autodestacáveis da placa de cultivo, e sem subcultivos geram grande quantidade de células que podem ser transplantadas de maneira mais próxima da fisiologia celular, mantendo-se as ligações celulares e a matriz extracelular produzidas em cultura. O ácido ascórbico ou vitamina C (VC) tem efeito indutor da formação destas MCs, aumentando a longevidade e tempo de indiferenciação das CTs. A similaridade observada entre respostas biológicas da VC em MCs e aquelas da Laserfototerapia (LFT) sobre células e tecidos, nos levou à hipótese de que estas terapias poderiam se complementar melhorando o prognóstico de futura aplicação clínica dessas MCs em regenerações de tecidos de interesse odontológico. Para testar essa hipótese, LFT e VC foram aplicadas associadas ou não na indução de MCs de células-tronco da polpa dentária humana (hDPSCs). Para tanto, hDPSCs descongeladas, que expressaram níveis típicos de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais, foram plaqueadas em placas de 6 poços (5x104 células por poço). Vinte e quatro horas depois do plaqueamento as culturas foram submetidas aos tratamentos dos grupos experimentais: Controle: hDPSCs em P3 cultivadas com meio clonogênico; Senescente: hDPSCs em P27 cultivadas com meio clonogênico; VC: P3 cultivadas com meio clonogênico acrescido de VC (20 ?g/ml); Laser: P3 cultivadas com meio clonogênico e submetido à LFT (contato e pontual - 5 pontos / poço, 660 nm, 20 mW, 0,028 cm², 0,71 W/cm², 7 segundos, 5 J/cm², 0,14 J por ponto, 48 horas de intervalo) e Laser+VC: P3 cultivadas com meio clonogênico acrescido de VC e submetido à LFT. Em 24 horas, 7 e 13 dias as hDPSCs dos diferentes grupos experimentais foram observadas macro e microscopicamente, e atividade da enzima telomerase foi avaliada por PCR-TRAP, complementado por ELISA. Para a avaliação da expressão de genes relacionados à natureza e indiferenciação (Mitofilina e Oct 4) e à longevidade (fase catalítica da enzima telomerase - hTERT); bem como à senescência das células do grupo senescente (?-galactosidase), as hDPSCs de todos os grupos experimentais foram submetidas ao RT-qPCR As hDPSCs foram capazes de formar MCs somente nos grupos VC e Laser+VC (100%), entre 10 e 13 dias. As MCs do grupo Laser+VC apresentaram maior facilidade na manipulação. Atividade de Telomerase nas hDPSCs foi observada somente em 24 horas (Controle e LFT) e em 7 dias (VC e Laser+VC). Os marcadores de indiferenciação (Oct 4) e mesenquimal (mitofilina), bem como a hTERT foram expressos nas hDPSCs de todos os grupos experimentais. O Oct4 e o hTERT, em 7 dias, apresentaram expressões significativamente maiores nos grupos VC e Laser+VC em comparação com os demais (p < 0,0001, p = 0,0009, respectivamente). A expressão da mitofilina foi significativamente maior no grupo Laser+VC, em 7 dias (p =0,033). A técnica de obtenção de MCs de hDPSCs por essa metodologia foi considerada adequada para ser testada em procedimentos regenerativos. A LFT quando associada à VC não interferiu na formação das MCs, nem na manutenção da longevidade e indiferenciação das hDPSCs. Adicionalmente, a LFT melhorou a manipulação das MCs. Assim sendo, a associação de VC e LFT na indução de MCs parece promissora para futura utilização de MCs na odontologia regenerativa. / Cell Sheets, consisting of stem cells (SCs) are self detachable from the cultivation plate, and with no subcultivation can generate large amount of cells. The cell sheets can be transplanted closer to cell physiology environment by keeping the cell connections and the extracellular matrix produced in culture. Ascorbic acid or Vitamin C (VC) has inductive effect on cell sheet formation, increasing the longevity and the stemness of the cell for long period of time. The similarity between biological responses of VC in cell sheets and those of Laserphototherapy (LPT, Laser) on cells and tissues led us to hypothesize that these therapies could improve the prognosis of future clinical application of these cell sheets in regeneration of dental tissues. To test this hypothesis, LPT and VC were applied, associated or not, to induce human dental pulp stem cells (hDPSCs). Therefore, hDPSCs, which expressed typical levels of mesenchymal stem cell surface markers, were plated in 6-well plates (5x104 cells per well). Twenty-four hours later they were subjected to the treatment of experimental groups: Control: hDPSCs in P3 cultured with regular medium; Senescent: hDPSCs in P27 cultured with regular medium; VC: P3 cultured with regular medium supplemented with VC (20 ?g/ml); Laser: P3 cultures with regular medium and submitted to LPT (punctual and contact mode-5 points / well, 660 nm, 20 mW, 0.028 cm², 0.71 W/cm², 7 sec, 5 J/cm², 0.14 J per point, 48 hours-intervals) and Laser+VC: P3 cultured with regular medium supplemented with VC and submitted to LPT Within 24 hours, 7 and 13 days the hDPSCs of the different experimental groups were observed macroscopically and microscopically, and the telomerase enzyme activity was assessed by PCR-TRAP, complemented by ELISA. To evaluate the expression of genes related to the nature and differentiation (Mitofilina and Oct 4), longevity (catalytic phase of telomerase-hTERT enzyme), and the senescence of the senescent group cells (?-galactosidase), the hDPSCs of all experimental groups were subjected to RT-qPCR. The RT-qPCR data were compared by ANOVA complemented by the Tukey\'s test (p <= 0.05). The hDPSCs were able to form cell sheets only in the VC and Laser+VC groups (100%). Additionally, the cell sheets of the Laser+VC group presented easier handling. Telomerase activity in hDPSCs was observed only in 24 hours (Control and Laser) and seven days (VC and Laser + VC). The undifferentiating marker (Oct 4) and mesenchymal marker (mitofilin), as well as hTERT were expressed in hDPSCs of all experimental groups. Oct4 and hTERT presented expressions significantly higher at 7 days in VC and Laser+VC groups than in all other groups (p < 0.0001, p = 0.0009, respectively). The expression of mitofilin was significantly higher in the Laser+VC group, in 7 days (p = 0.0338). The technique of obtaining cell sheets of hDPSCs by the methodology here presented was considered appropriate to be further tested in regenerative procedures. The LPT when combined with VC did not interfere with the formation of the cell sheets, neither in the maintenance of longevity and undifferentiating status of hDPSCs. Moreover, LPT improved the handling of the cell sheets. Thus, the association of VC and LPT in the induction of cell sheets seems promising for future use in regenerative dentistry.

Este estudo se propõe a analisar a resposta pulpar de dentes humanos a preparos cavitários de classe V, em função de duas diferentes técnicas de instrumentação e de duas diferentes técnicas de restauração. Para tal, cavidades classe V, nas superfícies vestibulares de 48 pré-molares hígidos de pacientes entre 11 e 25 anos, que estavam em tratamento ortodôntico, foram preparadas e restauradas de acordo com os seguintes grupos experimentais: G 1 (n=24) - preparos cavitários realizados com ponta diamantada em alta rotação, restaurados com guta-percha plastificada, cimento ionômero de vidro e verniz cavitário (G 1A; n=12) ou com técnicas adesivas (sistema restaurador adesivo aplicando-se o condicionamento ácido total) e cimento ionômero de vidro (G 1B; n=12); G 2 (n=24) - preparos cavitários com ponta CVD ativada por ultrassom, restaurados com gutapercha plastificada, cimento ionômero de vidro e verniz cavitário (G 2A; n=12) ou com técnicas adesivas (sistema restaurador adesivo aplicando-se o condicionamento ácido total) e cimento ionômero de vidro (G 2B; n=12); e G 3 (controle; n=4) - dentes que foram extraídos sem a realização de qualquer procedimento. Os preparos cavitários foram realizados mantendo o assoalho da cavidade o mais próximo possível da polpa, no entanto, sem provocar exposição pulpar. Os dentes foram extraídos após três períodos experimentais (imediato, sete e trinta dias após o preparo cavitário), fixados, descalcificados, e processados histologicamente. Cortes teciduais longitudinais seriados de 5 m foram obtidos, corados pelas técnicas de H & E e de Brown & Brenn, e examinados em microscopia ótica. As avaliações morfométricas e por escores foram realizadas e os resultados das mesmas, submetidos, respectivamente, aos testes estatísticos de Mann-Whitney e de Kruskal-Wallis/Dunn, adotando-se um nível de significância de 5%. No período inicial, todos os grupos experimentais (1A, 1B, 2A e 2B) exibiram ligeiro desarranjo da camada odontoblástica vacuolizada e leve invasão da zona acelular de Weil. Não houve diferença entre os grupos experimentais iniciais e o grupo controle. No intervalo de sete dias, pôde-se observar redução da camada odontoblástica, muitos núcleos de odontoblastos aspirados nos túbulos dentinários, alguns espécimes com ausência de pré-dentina e resposta inflamatória aguda com hemorragia. Trinta dias depois, cinco espécimes do total avaliado apresentaram dentina terciária; dois espécimes do grupo 1B apresentaram necrose relacionada com a presença de bactérias nos túbulos dentinários; e os demais mostraram graus variados de inflamação crônica, associados a restaurações adesivas ou a processos de reparo, com proliferação de vasos e persistência de focos de hemorragia. Portanto, os dois tipos de instrumentação cavitária promovem respostas pulpares similares entre si, mas as diferentes técnicas restauradoras promovem efeitos significativamente diferentes sobre o complexo dentinopulpar. / The aim of this study is to analyze the pulp response of human teeth to class V cavity preparation, in function of two different instrumentation and restorative techniques. Class V cavities were made on the buccal surfaces of 48 sound human pre-molars from orthodontic patients from 11 to 25 years, and were divided as follows: G1 (n=24) cavity preparations were made with diamond bur under high speed, restored with either plasticized gutta-percha, glass ionomer cement and surface coated with varnish (G1A) or adhesive protocol (total etch technique and adhesive system application) with glass ionomer filling (G1B); G2 (n=24) cavity preparations were made with diamond CVD point and ultrasonic device, restored with either plasticized gutta-percha, glass ionomer cement and surface coated with varnish (G2A) or adhesive protocol (total etch technique and adhesive system application) with glass ionomer filling (G2B); and control group G3 (n=4) extracted teeth with no previous cavity preparation. All avities were prepared with the cavity floor as close to the pulp as possible, without causing pulp exposure. Teeth extractions were made in three experimental periods (immediate, 7 and 30 days after cavity preparation) and right after extraction they were submitted to histological procedures. Longitudinal tissue serial sections of 5 mm were obtained, H&E and Brown&Brenn stained, and analyzed under optical microscope. Morphometric and score evaluations were carried out and data from both were, respectively, submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis/Dunn tests, with 5% significance. Immediately, all experimental groups (1A, 1B, 2A and 2B) exhibited a discrete disorganization of the odontoblastic layer and invasion of the Weil zone. There was no difference between experimental and control groups. At 7-day interval, a decrease of the odontoblastic layer was observed. Many odontoblasts nucleus were seen displaced into the dentinal tubules. Some specimens showed absence of pre-dentine and inflammatory pulp response with hemorrhage. Thirty days later, five specimens presented tertiary dentin formation; two specimens from group 1B presented necrosis coincident with bacteria inside the dentinal tubules; the other specimens showed various degrees of chronic inflammation, associated to adhesive restorations or repair processes, with blood vessels proliferation and persistent hemorrhagic areas. Therefore, both instrumentation techniques promoted similar pulp response, but different restoration procedures elicited significantly different responses of the dentinpulp complex.

Objetivos: verificar a influência da técnica de microinfiltração, pressão pulpar simulada, armazenamento e fadiga cíclica na microinfiltração e integridade marginal das coroas In-Ceram alumina. Material e métodos: Dentes pré-molares superiores humanos de dimensões semelhantes receberam preparos para coroa total com 4mm de altura, 6 graus de convergência e 2mm de desgaste axial e oclusal. Coroas de In-Ceram alumina com 0,5mm de espessura foram obtidas e cimentadas com Panavia F/Clearfil SE Bond (PAN-SE) e/ou Rely XARC/Adper Single Bond 2 (REL-SB). Quatro hipóteses foram testadas: 1) Ausência de diferença na microinfiltração entre uma nova técnica sugerida para verificar a microinfiltração, quando comparada à técnica convencional, 1.1) Verificar se a nova técnica é adequada para estudos laboratoriais de microinfiltração, 2) A pressão pulpar simulada (15cmH2O) não altera a microinfiltração; 3) O armazenamento (90 dias) / fadiga cíclica (500.000 ciclos, 2Hz, 5kg) não têm influência na microinfiltração marginal e 4) O armazenamento/fadiga cíclica não influenciam a integridade marginal das coroas. Grupos controle foram constituídos em todos os experimentos. Resultados: 1) Nenhuma diferença estatisticamente significante foi detectada entre as duas técnicas testadas para analisar a microinfiltração dentro de cada conjunto cimento/adesivo (p>0,05); 2) A pressão pulpar simulada alterou significativamente a microinfiltração nos conjuntos PAN-SE (Mann-Whitney, p=0,025) e REL-SB (Mann-Whitney, p=0,014); 3) O armazenamento em água (Mann-Whitney, p=0,032) e armazenamento/fadiga cíclica (Mann-Whitney, p=0,008) aumentaram significativamente a microinfiltração no conjunto PAN-SE; 4) A perda de integridade marginal foi de 4% e 10% nos conjuntos REL-SB e PAN-SE, respectivamente. Conclusões: 1) não houve diferença na microinfiltração entre uma nova técnica sugerida para verificar a microinfiltração, quando comparada à técnica convencional, 1.1) A nova técnica parece adequada para estudos laboratoriais de microinfiltração; 2) O uso da pressão pulpar alterou significativamente os valores de microinfiltração para os dois cimentos/adesivos; 3) O armazenamento/fadiga cíclica mostrou influência na microinfiltração para o cimento Panavia F; 4) O armazenamento/fadiga cíclica não tiveram influência estatisticamente significante na integridade marginal dos cimentos/adesivos testados. / Objectives: To verify the influence of microleakage technique, simulated pulpal pressure, water storage and cyclic fatigue on marginal integrity and microleakage of In-Ceram alumina crowns. Material and methods: Human premolar teeth of similar dimensions received complete crown preparation with a 6 convergence degree, 4mm-height and 2mm of axial and occlusal reduction. In-Ceram alumina copings 0.5mm-thick were obtained and cemented either with Panavia F/Clearfil SE Bond (PAN-SE) or Rely XARC/Adper Single Bond 2 (REL-SB). Four hypotheses were made: 1) No difference between a new technique and a standard one to verify microleakage, 1.1) To verify if a new microleakage technique is adequate for laboratorial studies; 2) Simulated pulpal pressure (15cmH2O) does not alter microleakage; 3) Water storage (90 days) / cyclic fatigue (500.000 cycles, 2Hz, 5kg) does not have influence on microleakage and 4) Water storage/cyclic fatigue does not influence marginal integrity of crowns. Control groups were established for all experiments. Results: 1) No statistically significant difference was detected between the two techniques to assess microleakage in each cement/adhesive combination; 2) Simulated pulpal pressure significantly altered microleakage for PAN-SE (Mann-Whitney, p=0.025) and REL-SB (Mann-Whitney, p=0.014); 3) Water storage (Mann-Whitney, p=0.032) and water storage/cyclic fatigue (Mann-Whitney, p=0.008) significantly increased microleakage only in PAN-SE groups. These parameters were not decisive in REL-SB groups even with higher microleakage values, and 4) Loss of marginal integrity was of 4% and 10% in REL-SB and PAN-SE groups, respectively. Conclusions: 1) No differences on microleakage were observed when a new technique suggest to assess microleakage was compared to a standard one. 1.1) This new technique seems adequate for laboratorial microleakage studies; 2) Simulated pulpal pressure significantly altered microleakage values for both adhesives/cements; 3) Water storage/cyclic fatigue influenced on microleakage of Panavia F and 4) Water storage/cyclic fatigue did not have influence on marginal integrity of both adhesives/cements tested.

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A fototerapia com laser em baixa intensidade (FTLBI) é capaz de aumentar o metabolismo celular, o que poderia influenciar na diferenciação ósseo/odontogênica das células-tronco da polpa dentária humada (hDPSCs). O PDGF e o BMP-2 são fatores de crescimento envolvidos na dentinogênese e na reparação tecidual. O PDGF tem papel importante durante o desenvolvimento embrionário, na proliferação e migração celular e na angiogênese, enquanto o BMP-2 está fortemente associado à diferenciação celular em tecidos mineralizados, como o osso e a dentina. Sendo assim, o objetivo do estudo foi analisar os efeitos da FTLBI e dos fatores de crescimento (PDGF-BB ou BMP-2), isolados ou em associação, na diferenciação ósseo/odontogênica das hDPSCs. Para o estudo hDPSCs foram cultivadas em meio regular (G1) e irradiadas (G2), meio mineralizante (G3) e irradiadas (G4), meio mineralizante contendo PDGF-BB (G5) e irradiadas (G6), meio mineralizante contendo BMP-2 (G7) e irradiadas (G8). Para os grupos irradiados, a FTLBI foi realizada no modo pontual e em contato, com um laser de diodo semi-condutor, com área de feixe de 0,028cm2 e comprimento de onda 660nm (InGaAlP-vermelho), utilizando-se os seguintes parâmetros: potência de 20mW, densidade de energia de 5J/cm2, tempo de irradiação de 7 segundos por ponto e 0,14J de energia por ponto. A expressão dos genes relacionados à diferenciação ósseo/odontogênica (DSPP, DMP-1 e OCN) através do PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), a atividade da fosfatase alcalina e os depósitos de cálcio foram analisados em 3, 7 e 14 dias. Os dados obtidos foram comparados pelo teste ANOVA complementado pelo teste de Tukey (p<0,05). As culturas tratadas com meio mineralizante contendo BMP-2 e irradiadas (G8) foram as que mostraram os maiores índices de diferenciação ósseo/odontogênica nos testes realizados. As expressões de DSPP, OCN e DMP-1, ao menos em 14 dias, foram significantemente maiores no G8 que nos demais grupos experimentais, exceto os grupos G3 e G7. Estes grupos apresentaram expressões de DSPP e OCN semelhantes às do G8 em 14 dias. A maior atividade de ALP foi observada no G8 em 3 dias e a menor no mesmo grupo aos 14 dias. A maior quantidade de depósitos de cálcio também foi encontrada no G8 em 14 dias. A associação de FTLBI e BMP-2 se mostrou capaz de induzir a diferenciação ósseo/odontogênica em células-tronco de polpa dentária humana de forma mais marcante que as demais terapias isoladas ou associadas estudadas. Portanto, o uso de uma terapia associando FTLBI e BMP-2 poderia ser de relevância para o restabelecimento da fisiologia pulpar quando aplicada em casos de exposição deste tecido, uma vez que poderia favorecer a diferenciação das células indiferenciadas da polpa dentária. / Laser phototherapy (LPT) is able to increase cellular metabolism, which in turn could influence the odontogenic differentiation of dental pulp stem cells (hDPSCs). PDGF and BMP-2 are growth factors involved in dentinogenesis and tissue repair. PDGF plays a role in embryonic development, cell proliferation, cell migration, and angiogenesis, whereas BMP-2 is strongly associated with cell differentiation in mineralized tissues such as bone and dentin. The aim of this study was to analyze the effects of LPT and the growth factors PDGF-BB and BMP-2 combined or not on the odontogenic differentiation of hDPSCs. These cells were grown in regular medium (G1) and irradiated (G2), mineralizing medium (G3) and irradiated (G4), mineralizing medium containing PDGF-BB (G5) and irradiated (G6), mineralizing medium containing BMP-2 (G7) and irradiated (G8). For irradiated groups, LPT was performed in punctual and contact mode with a semiconductor diode laser, with a beam spot area of 0.028 cm2 and wavelength of 660nm (InGaAlP-visible red), using the following parameters: power of 20mW, energy density of 5J/cm2 and irradiation time of 7 seconds per point (0,14 J per point). Differentiation was assessed by the following analysis: expression of genes related to odontogenic differentiation (DSPP, DMP-1 and OCN) using quantitative real time PCR (qRT-PCR); alkaline phosphatase activity and calcium deposition using alizarin red staining in 3, 7 and 14 days. Data were compared by ANOVA and Tukey´s test (p<0.05). The cultures treated with mineralizing medium containing BMP-2 and irradiated (G8) showed the highest rate of odontogenic differentiation. The expressions of DSPP, DMP-1 and OCN genes, at least in 14 days, were significantly higher in G8 compared to all other groups, except for the groups G3 and G7. These groups showed similar expressions of DSPP and OCN than G8 in 14 days. G8 showed the highest ALP activity in 3 days and the lowest in 14 days compared to all other groups. The largest amount of calcium deposits was observed in G8 in 14 days. The most striking feature on induction of odontogenic differentiation of hDPSCs was observed when LPT was applied in association with BMP-2. Therefore, the use of a combined LPT and BMP-2 therapy could be of relevance for the re-establishment of pulp physiology when applied in cases of dental pulp exposure by promoting the differentiation of hDPSCs.

Durante o processo de reparação tecidual, o fator de transformação de crescimento <font face=\"symbol\">b1 (TGF-<font face=\"symbol\">b1) apresenta um importante papel na regulação da expressão da <font face=\"symbol\">a-actina de músculo liso (<font face=\"symbol\">a-AML) e portanto, na diferenciação miofibroblástica. Como os fibroblastos pulpares apresentam características peculiares, com a expressão de proteínas específicas que os diferem de fibroblastos de outros tecidos conjuntivos, o presente estudo avaliou in vitro se o TGF-<font face=\"symbol\">b1 aumenta a expressão de <font face=\"symbol\">a-AML em fibroblastos pulpares humanos comparando-os com fibroblastos de gengiva. Para tal, diferentes doses de TGF-<font face=\"symbol\">b1 (5 à 10 ng/ml) foram adicionadas às culturas de células, sendo a expressão da <font face=\"symbol\">a-AML analisada por imunofluorescência e western-blotting. Ambos os tipos celulares imunoexpressaram <font face=\"symbol\">a-AML mesmo sem o tratamento com o TGF-<font face=\"symbol\">b1, estando aumentada consideravelmente, quando o TGF-<font face=\"symbol\">b1 foi adicionado às culturas. Os resultados do presente estudo demonstraram que o TGF-<font face=\"symbol\">b1 induz a expressão de <font face=\"symbol\">a-AML, sugerindo a indução do fenótipo miofibroblástico em fibroblastos pulpares. / Transforming growth factor-beta 1 (TGF-<font face=\"symbol\">b1) has been related to induce the expression of <font face=\"symbol\">a-smooth muscle actin (<font face=\"symbol\">a-SMA) in fibroblasts during repair. Since pulpal fibroblasts seem to be somewhat different from other fibroblasts, the present study investigated in vitro whether TGF-<font face=\"symbol\">b1 enhances the expression of <font face=\"symbol\">a-SMA in human pulpal fibroblasts. TGF-<font face=\"symbol\">b1 was added in doses between 5-10 ng/ml to cultures of both dental pulp and gingiva human fibroblasts. The expression of <font face=\"symbol\">a-SMA was analyzed by immunofluorescence and western-blotting. Both cell types were immunoreactive for <font face=\"symbol\">a-SMA even without TGF-<font face=\"symbol\">b1. When TGF-<font face=\"symbol\">b1 was added to cell cultures, the expression of <font face=\"symbol\">a-SMA increased dramatically in pulpal fibroblasts, independent of the concentration used. It was confirmed by the western blot analysis. The present findings showed that TGF-<font face=\"symbol\">b1 up-regulated the expression of <font face=\"symbol\">a-SMA thus inducing pulpal fibroblasts to acquire the myofibroblast phenotype.

A fototerapia com laser em baixa intensidade (FTLBI) é capaz de aumentar o metabolismo celular, o que poderia influenciar na diferenciação ósseo/odontogênica das células-tronco da polpa dentária humada (hDPSCs). O PDGF e o BMP-2 são fatores de crescimento envolvidos na dentinogênese e na reparação tecidual. O PDGF tem papel importante durante o desenvolvimento embrionário, na proliferação e migração celular e na angiogênese, enquanto o BMP-2 está fortemente associado à diferenciação celular em tecidos mineralizados, como o osso e a dentina. Sendo assim, o objetivo do estudo foi analisar os efeitos da FTLBI e dos fatores de crescimento (PDGF-BB ou BMP-2), isolados ou em associação, na diferenciação ósseo/odontogênica das hDPSCs. Para o estudo hDPSCs foram cultivadas em meio regular (G1) e irradiadas (G2), meio mineralizante (G3) e irradiadas (G4), meio mineralizante contendo PDGF-BB (G5) e irradiadas (G6), meio mineralizante contendo BMP-2 (G7) e irradiadas (G8). Para os grupos irradiados, a FTLBI foi realizada no modo pontual e em contato, com um laser de diodo semi-condutor, com área de feixe de 0,028cm2 e comprimento de onda 660nm (InGaAlP-vermelho), utilizando-se os seguintes parâmetros: potência de 20mW, densidade de energia de 5J/cm2, tempo de irradiação de 7 segundos por ponto e 0,14J de energia por ponto. A expressão dos genes relacionados à diferenciação ósseo/odontogênica (DSPP, DMP-1 e OCN) através do PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), a atividade da fosfatase alcalina e os depósitos de cálcio foram analisados em 3, 7 e 14 dias. Os dados obtidos foram comparados pelo teste ANOVA complementado pelo teste de Tukey (p<0,05). As culturas tratadas com meio mineralizante contendo BMP-2 e irradiadas (G8) foram as que mostraram os maiores índices de diferenciação ósseo/odontogênica nos testes realizados. As expressões de DSPP, OCN e DMP-1, ao menos em 14 dias, foram significantemente maiores no G8 que nos demais grupos experimentais, exceto os grupos G3 e G7. Estes grupos apresentaram expressões de DSPP e OCN semelhantes às do G8 em 14 dias. A maior atividade de ALP foi observada no G8 em 3 dias e a menor no mesmo grupo aos 14 dias. A maior quantidade de depósitos de cálcio também foi encontrada no G8 em 14 dias. A associação de FTLBI e BMP-2 se mostrou capaz de induzir a diferenciação ósseo/odontogênica em células-tronco de polpa dentária humana de forma mais marcante que as demais terapias isoladas ou associadas estudadas. Portanto, o uso de uma terapia associando FTLBI e BMP-2 poderia ser de relevância para o restabelecimento da fisiologia pulpar quando aplicada em casos de exposição deste tecido, uma vez que poderia favorecer a diferenciação das células indiferenciadas da polpa dentária. / Laser phototherapy (LPT) is able to increase cellular metabolism, which in turn could influence the odontogenic differentiation of dental pulp stem cells (hDPSCs). PDGF and BMP-2 are growth factors involved in dentinogenesis and tissue repair. PDGF plays a role in embryonic development, cell proliferation, cell migration, and angiogenesis, whereas BMP-2 is strongly associated with cell differentiation in mineralized tissues such as bone and dentin. The aim of this study was to analyze the effects of LPT and the growth factors PDGF-BB and BMP-2 combined or not on the odontogenic differentiation of hDPSCs. These cells were grown in regular medium (G1) and irradiated (G2), mineralizing medium (G3) and irradiated (G4), mineralizing medium containing PDGF-BB (G5) and irradiated (G6), mineralizing medium containing BMP-2 (G7) and irradiated (G8). For irradiated groups, LPT was performed in punctual and contact mode with a semiconductor diode laser, with a beam spot area of 0.028 cm2 and wavelength of 660nm (InGaAlP-visible red), using the following parameters: power of 20mW, energy density of 5J/cm2 and irradiation time of 7 seconds per point (0,14 J per point). Differentiation was assessed by the following analysis: expression of genes related to odontogenic differentiation (DSPP, DMP-1 and OCN) using quantitative real time PCR (qRT-PCR); alkaline phosphatase activity and calcium deposition using alizarin red staining in 3, 7 and 14 days. Data were compared by ANOVA and Tukey´s test (p<0.05). The cultures treated with mineralizing medium containing BMP-2 and irradiated (G8) showed the highest rate of odontogenic differentiation. The expressions of DSPP, DMP-1 and OCN genes, at least in 14 days, were significantly higher in G8 compared to all other groups, except for the groups G3 and G7. These groups showed similar expressions of DSPP and OCN than G8 in 14 days. G8 showed the highest ALP activity in 3 days and the lowest in 14 days compared to all other groups. The largest amount of calcium deposits was observed in G8 in 14 days. The most striking feature on induction of odontogenic differentiation of hDPSCs was observed when LPT was applied in association with BMP-2. Therefore, the use of a combined LPT and BMP-2 therapy could be of relevance for the re-establishment of pulp physiology when applied in cases of dental pulp exposure by promoting the differentiation of hDPSCs.

Durante o processo de reparação tecidual, o fator de transformação de crescimento <font face=\"symbol\">b1 (TGF-<font face=\"symbol\">b1) apresenta um importante papel na regulação da expressão da <font face=\"symbol\">a-actina de músculo liso (<font face=\"symbol\">a-AML) e portanto, na diferenciação miofibroblástica. Como os fibroblastos pulpares apresentam características peculiares, com a expressão de proteínas específicas que os diferem de fibroblastos de outros tecidos conjuntivos, o presente estudo avaliou in vitro se o TGF-<font face=\"symbol\">b1 aumenta a expressão de <font face=\"symbol\">a-AML em fibroblastos pulpares humanos comparando-os com fibroblastos de gengiva. Para tal, diferentes doses de TGF-<font face=\"symbol\">b1 (5 à 10 ng/ml) foram adicionadas às culturas de células, sendo a expressão da <font face=\"symbol\">a-AML analisada por imunofluorescência e western-blotting. Ambos os tipos celulares imunoexpressaram <font face=\"symbol\">a-AML mesmo sem o tratamento com o TGF-<font face=\"symbol\">b1, estando aumentada consideravelmente, quando o TGF-<font face=\"symbol\">b1 foi adicionado às culturas. Os resultados do presente estudo demonstraram que o TGF-<font face=\"symbol\">b1 induz a expressão de <font face=\"symbol\">a-AML, sugerindo a indução do fenótipo miofibroblástico em fibroblastos pulpares. / Transforming growth factor-beta 1 (TGF-<font face=\"symbol\">b1) has been related to induce the expression of <font face=\"symbol\">a-smooth muscle actin (<font face=\"symbol\">a-SMA) in fibroblasts during repair. Since pulpal fibroblasts seem to be somewhat different from other fibroblasts, the present study investigated in vitro whether TGF-<font face=\"symbol\">b1 enhances the expression of <font face=\"symbol\">a-SMA in human pulpal fibroblasts. TGF-<font face=\"symbol\">b1 was added in doses between 5-10 ng/ml to cultures of both dental pulp and gingiva human fibroblasts. The expression of <font face=\"symbol\">a-SMA was analyzed by immunofluorescence and western-blotting. Both cell types were immunoreactive for <font face=\"symbol\">a-SMA even without TGF-<font face=\"symbol\">b1. When TGF-<font face=\"symbol\">b1 was added to cell cultures, the expression of <font face=\"symbol\">a-SMA increased dramatically in pulpal fibroblasts, independent of the concentration used. It was confirmed by the western blot analysis. The present findings showed that TGF-<font face=\"symbol\">b1 up-regulated the expression of <font face=\"symbol\">a-SMA thus inducing pulpal fibroblasts to acquire the myofibroblast phenotype.