Les monocytes sont des leucocytes dérivés de précurseurs de la moelle osseuse pouvant se différencier en macrophages, cellules dendritiques (CD), ou ostéoclastes (OC). Ils jouent un rôle critique dans la persistance de l'inflammation et la destruction des articulations par le biais de mécanismes encore mal connus. Les monocytes sont composés de deux grandes sous-populations chez la souris, discriminées sur la base du marqueur de surface Ly6C. Il a été suggéré que les OC pouvait être préférentiellement différenciés à partir de la sous-population monocytaire Ly6Chigh, dont l'activation excessive et prolongée est une signature clé de nombreuses pathologies inflammatoires. Parmi les acteurs moléculaires responsables de la régulation de l'expression des gènes, les miARNs jouent un rôle majeur dans de nombreux processus physiologiques, dont la réponse inflammatoire, en régulant finement les programmes génétiques au niveau post-transcriptionnel. Leur implication dans l'ostéoclastogénèse est encore mal connue. Par ailleurs, leur expression est perturbée dans de nombreuses pathologies, dont la polyarthrite rhumatoïde qui implique à la fois un dysfonctionnement de la réponse inflammatoire et de l'homéostasie osseuse. Mon projet de thèse vise à mieux comprendre l'implication des sous-populations monocytaires dans la persistance de l'inflammation et de l'activité des OC au travers de l'étude du rôle de miR-146a dans des conditions physiologiques et inflammatoires. J'ai montré que miR-146a est le miARN le plus différemment exprimé entre monocytes classiques Ly6Chigh et non-classiques Ly6Clow, et que son expression est diminuée dans les Ly6Chigh en conditions arthritiques. J'ai également montré que la perte de miR-146a augmente l'ostéoclastogénèse in vitro et l'érosion osseuse in vivo chez les souris arthritiques. Enfin, la surexpression artificielle de miR-146a dans les monocytes Ly6Chigh inhibe la différenciation osteoclastique et la perte osseuse dans l'arthrite expérimentale chez la souris. Mes résultats suggèrent que miR-146a contrôle l'hétérogénéité fonctionnelle des monocytes et qu'une diminution de son expression dans la sous-population Ly6Chigh serait responsable de l'augmentation de l'osteoclastogénèse et de l'érosion osseuse observées en conditions arthritiques. Pour finir, mes résultats montrent également qu'augmenter l'expression de miR-146a dans les monocytes Ly6Chigh présente un intérêt thérapeutique pour contrecarrer la perte osseuse associée à l'arthrite. / Introduction : Monocytes represent a prototypic cell type when investigating the interplay between immune and skeletal systems as they can give rise to different cell types including dendritic cells, macrophages and osteoclasts (OC), which play key roles in immunity and bone homeostasis. Circulating monocytes consist of at least two main functional subsets, Ly6Chigh and Ly6Clow monocytes. It has been suggested that OC might develop preferentially from the Ly6Chigh monocyte subset, which excessive and prolonged activation is a hallmark of many inflammatory diseases. Among key molecular rheostats of cell fate, micro(mi)RNAs are a class of regulatory RNAs that control basic biological functions and orchestrate inflammatory responses. Few miRNAs have been involved in osteoclastogenesis. The present study aimed at investigating the role of miRNAs in osteoclastogenesis in the context of monocyte subsets, under steady state and inflammatory conditions. Methods & Results : Using genome-wide miRNA expression study we have identified miRNAs and putative targeted pathways that are differentially expressed between Ly6Chigh and LyC6low FACS sorted mouse monocytes, and common to their human counter parts CD14+CD16- and CD14dimCD16+ monocytes, respectively. Among these, miR-146a showed higher expression in Ly6Clow monocytes when compared to Ly6Chigh monocytes. Under inflammatory arthritis conditions, expression of miR-146a in Ly6Chigh monocytes was down regulated as compared to healthy controls. Using mouse deficient for miR-146a, we showed that knockdown of miR-146a increased OC differentiation in vitro. While no bone phenotype was evidenced in miR-146a deficient mice, nor under steady state or ovariectomized conditions, arthritis-induced bone resorption and bone loss were increased in miR-146a knockout mice. Finally, using a liposomal formulation able to delivermiR-146a mimics to Ly6Chigh monocytes upon intravenous injection, we showed that enforced expression of miR-146a led to decreased number of TRAP positive cells within the synovium of arthritic mice, and efficiently reduced bone erosion in inflammatory arthritis. This effect was associated with decreased RelB expression in miR-146a-overexpressing Ly6Chigh osteoclast progenitors. Conclusion : Overall, our results show that specific over-expression of miR-146a in Ly6Chigh monocytes altered OC differentiation and decreased bone erosion in inflammatory arthritis. These data suggest a novel role for miR-146a in controlling osteoclast fate of Ly6Chigh monocyte progenitors and that reduced miR-146a expression in Ly6Chigh monocytes under arthritic conditions contributes to pathogenic bone loss. Finally, delivery of miR-146a mimics to Ly6Chigh monocytes may offer valuable therapeutic potential to interfere with pathological bone loss.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune (MAI) dans laquelle des anticorps anti-peptides citrullinés (ACPA) sont un outil diagnostique très spécifique. L’un des traitements clé de la PR est le méthotrexate (MTX). En plus de son action directe sur la maladie il renforce l’effet des anti-TNF alpha (aTNF). Ceci pourrait passer par une prévention de la formation d’anticorps anti-médicaments dirigés contre les aTNF ce qui leur fait perdre leur efficacité.Nous avons développé un modèle macaque pour reproduire la maladie humaine par immunisation avec des peptides citrullinés dans le contexte d’un facteur génétique favorisant la PR : l’épitope HLA partagé. L’immunisation de macaques avec divers peptides citrullinés en utilisant un boost intra-articulaire a déclenché une réponse T et B anti-citrulline et a entraîné une mono-arthrite chronique.Le rôle du MTX sur l’immunogénicité des aTNF a été étudié sur un modèle de souris autoimmunes, les souris BAFF transgéniques (tg) qui présentent une MAI. L’utilisation du MTX juste avant l’injection d’aTNF a permis de prévenir l’immunisation contre ce médicament uniquement chez ces souris BAFFtg et pas chez des souris sauvages ou chez des macaques. Nous avons démontré que ces souris BAFFtg surexprimaient CD73, ce qui permettait une sécrétion accrue d’adénosine et de cellules B régulatrices sous l’effet du MTX. L’interaction entre BAFF et le méthotrexate a été confirmée chez l’homme dans la cohorte ABIRISK : le MTX prévient plus efficacement l’immunogénicité chez les patients avec des taux de BAFF élevés.En conclusion, nous avons mis au point deux nouveaux modèles animaux permettant de mieux comprendre la physiopathologie de la PR et d’optimiser l’utilisation des traitements biologiques qui s’étend dans tous les domaines de la médecine. / Title : Development of new animal models to study the pathophysiology of RA and the role of methotrexate-induced tolerance.Keywords : Rheumatoid arthritis, shared epitope, ACPA, immunogenicity, methotrexate, TNF inhibitorsAbstract: Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease (AID) where antibodies directed against citrullinated peptides (ACPA) are highly specific for the diagnosis. One of the key treatments of RA is methotrexate. It has an action on both the disease and reinforces the effect of second line TNF inhibitors (TNFi). MTX might act via prevention of anti-drug antibodies (ADAb) directed against TNFi that are implicated in loss of efficacy of TNFi. We have developed a macaque model to recapitulate the human disease by immunization with citrullinated peptides in the context of a genetic factor favoring RA: the shared epitope on the HLA. Immunization of macaques with citrullinated peptides and intra-articular boost cause an anti-citrulline T and B cell response and a chronic monoarthritis.The role of MTX-induced tolerance against TNFI has been studied in autoimmune BAFF transgenic (tg) mice using MTX just before treatment with TNFi we were able to prevent ADAb formation in BAFFtg mice and not wild type mice or macaques. We identified that BAFFtg mice expressed elevated CD73 leading to more adenosine and regulatory B cells as actors in MTX-induced tolerance. This MTX-BAFF interaction was further confirmed in humans in the ABIRISK cohort where MTX was more efficient to prevent ADAb formation in RA patients with elevated BAFF levels.Setting up two new animal models allows better understanding of RA pathophysiology and better use of biologics that extend to other domains of medicine.

Dans la prise en charge de la polyarthrite rhumatoïde (PR), l’identification de biomarqueurs associés à un diagnostic, un pronostic mais surtout à une bonne réponse thérapeutique est un des enjeux de la prochaine décennie, d’autant que de nombreux outils sont maintenant disponibles grâce à l’étude du génome, du transcriptome et du protéome. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à l’identification de différentes classes de biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement par biothérapies.Tout d’abord par une approche protéomique, j’ai identifié une combinaison de biomarqueurs protéiques sériques, MCP-1 et EGF, permettant à l’initiation du traitement par étanercept (anti-TNFα), puis par rituximab (anti-CD20), de prédire la réponse clinique à 3 mois. En parallèle, toujours chez des patients PR traités par rituximab, j’ai recherché un biomarqueur cellulaire par cytométrie de flux. J’ai ainsi pu montrer que la densité de CCR5 à la surface des lymphocytes T CD4+ circulants est faible chez les patients PR . Celle-ci est corrélée positivement à l’activité de la maladie et négativement au taux intracellulaire d’ARNm de CCR5. Trois mois après l’initiation du traitement, la densité de CCR5 à la surface des lymphocytes T CD4+ circulants augmente proportionnellement à la diminution de l’activité de la maladie. J’ai également étudié l’intérêt de biomarqueurs génétiques. Tout d’abord, en analysant le profil d’expression de 723 micro(mi)ARNs dans le sang de patients PR, j’ai montré que l’expression de 37 miARNs était dérégulée par rapport à des donneurs sains. Par ailleurs, j’ai montré que le niveau d’expression de miR-125b dans le sang des patients PR à l’initiation du traitement par rituximab permet de prédire la réponse à 3 mois. J’ai enfin exploré les polymorphismes de gènes de cytokines et de récepteurs aux cytokines afin de prédire la réponse au traitement par rituximab à 6 mois chez 63 patients atteints de PR active. Douze polymorphismes de nucléotides uniques (SNPs) ont été génotypés et ont permis d’identifier 2 SNPs du facteur de croissance transformant beta 1 (TGFb1) codon 25 et codon 10 prédictifs d’une bonne réponse au rituximab.Je me suis aussi intéressée à la thérapie génique qui est un outil thérapeutique pour délivrer des agents anti-TNF dans la PR. En effet le transfert de gène permet à l’organisme de synthétiser in situ la protéine médicament et d’éviter des administrations répétées comme c’est le cas avec les biothérapies. Le défi de demain réside plus dans le développement de vecteurs fiables et efficients. Dans un premier travail réalisé dans l’équipe de recherche du Pr Hirsch à Pittsburgh (E.U), j’ai évalué in vitro l’intérêt d’un virus adéno-associé recombinant de sérotype 2 (rAAV2) contenant un ARN double brin pour le transfert de gène dans les synoviocytes humains. Dans un contexte inflammatoire, celui-ci s’est révélé efficace lorsqu’associé à un inhibiteur du protéasome, le zLLL. Lors d’un deuxième stage effectué au sein du laboratoire du Pr Jorgensen (Montpellier), j’ai évalué le potentiel thérapeutique d’un rAAV de sérotype 5 (rAAV5) exprimant un petit ARN interférant ciblant le TNF-α dans un modèle expérimental d’arthrite. L’inhibition du TNF-α a été validée in vitro sur des macrophages murins, puis in vivo dans le modèle murin d’arthrite au collagène, après injection dans les articulations arthritiques. Depuis la fin des années 90, l’avènement des biothérapies a permis de bouleverser l’évolution de la PR. Les biomarqueurs, en particulier ceux permettant le suivi des traitements, sont des outils de choix à développer pour notre pratique clinique courante afin de choisir d’emblée le traitement le plus efficace et le mieux toléré pour chaque patient. D’autres thérapies innovantes, telles que la thérapie génique, s’appuient sur les succès des biothérapies pour permettre d’autres avancées en choisissant d’emblée les cibles les plus pertinentes. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease. The effective use of biologics, which block key molecules involved in the pathogenesis of RA, has dramatically improved the treatment of this chronic disease over recent years. However, for at least one-third of patients with RA biologic treatments will produce an inadequate response. Therefore, the use of predictive biomarkers of response to identify individuals who are likely to respond to specific treatments will provide benefit. An individualised approach will allow patients to receive effective treatment without unnecessary exposure to potentially toxic side effects.During my thesis, I identified predictive biomarkers in RA patients treated with biologics by using proteomics, genetics and cellular biomarkers.Genen therapy could be used to optimise drug administration by avoiding repetitive administration. I validated the interest of a recombinant adeno-associated virus in RA synovial fibroblasts.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire, auto-immune, chronique et systémique avec la présence d’arthrites et synovites périphériques. Une autre conséquence sévère de la maladie et de ses traitements est la présence d’une rigidité artérielle élevée précoce, par conséquent une haute incidence de problèmes cardiovasculaires pour les sujets atteints. La pratique d'exercices physiques (EP) est reconnue comme une des thérapies non-pharmacologiques les plus efficaces pour lutter contre le risque cardiovasculaire. Cependant la population PR présente un bas niveau de pratique d’activité physique et les programmes d’EP sont rarement proposés dans la prise en charge thérapeutique de ces patients. Pour dépasser cette problématique l’association de la cryothérapie à un programme d’EP adapté semble être une stratégie intéressante. L’objectif de ce travail était de concevoir et de tester un programme d’EP associé à de la cryothérapie adapté aux patients PR afin de lutter contre le risque cardiovasculaire.A partir d’une revue systématique, nous avons montré le caractère lacunaire de la littérature en termes de programme d’EP associé à de la cryothérapie pour des patients PR, le manque de consensus sur les méthodes utilisées aussi bien pour le type d’EP à proposer que pour les méthodes de cryothérapie et les températures employées. Face à cette situation, nous avons proposé plusieurs études préliminaires afin de déterminer les modalités d’exercice et de cryothérapie les plus appropriées pour définir un programme simple, efficace et adapté aux patients PR. Ces travaux ont été réalisés d’une part avec des sujets sains et d’autre part avec des patients PR. Nous avons également entrepris de mieux définir les conditions d’utilisation de la vitesse de propagation de l’onde de pression pour traduire la rigidité artérielle, afin d’utiliser cette dernière comme un marqueur des effets de nos propositions de programme d’EP sur le risque cardiovasculaire. Enfin nous avons tenté d’évaluer quels pouvaient être les freins à la pratique d’EP pour ces patients afin de pouvoir les prendre en compte et les contourner dans la mise en place de nos propositions. Les principaux résultats de nos travaux nous ont permis de définir les caractéristiques d’un programme d’EP associé à de la cryothérapie pour des patients PR afin d’agir sur leur rigidité artérielle.Ce programme, intitulé Prexcrim, a été mise en œuvre avec un groupe de patients atteints de PR. Les premiers résultats que nous avons obtenus confirment la faisabilité de nos propositions et la bonne tolérance des patients. Aucune sortie de l’étude ou effet secondaire a été observé. A ce stade des inclusions et de l’analyse des résultats, il semble que le programme d’EP proposé permette de modifier la rigidité artérielle en particulier des patients qui présentaient une rigidité artérielle élevée au départ. Il n’a pas été observé d’aggravation de la maladie ou du syndrome inflammatoire ce qui semble renforcer l’intérêt de la méthode de cryothérapie proposée. Les inclusions qui se poursuivent permettront sans doute d’affiner ces premières interprétations.En conclusion, notre travail a permis de combler une partie des lacunes constatées dans la littérature en termes de lutte contre le risque cardiovasculaires accru constaté chez les patients PR. Notre approche a permis la réalisation d’un programme simple et facile d’EP associé à de la cryothérapie, dont les premiers résultats répondent aux attentes fixées. Les premières analyses que nous avons réalisées montrent que les principes d’individualisation et de progressivité seront certainement à améliorer pour optimiser les effets du programme. / Rheumatoid arthritis (RA) is an inflammatory, autoimmune, chronic and systemic disease with the presence of arthritis and peripheral synovitis. Another severe consequence of the disease and its treatments is the presence of early high arterial stiffness, hence a high incidence of cardiovascular problems for the subjects with RA. The practice of physical exercises (PE) is recognized as one of the most effective non-pharmacological therapies against the cardiovascular risk. However, the RA population has a low level of physical activity and PE programs are rarely offered in the therapeutic management of these patients. To overcome this problem, the association of cryotherapy to an appropriate PE program seems to be an interesting strategy. The objective of this work was to design and test a PE program associated with cryotherapy adapted to patients with RA in order to fight against the cardiovascular risk.From a systematic review, we have shown the lack of the literature in terms of PE program associated with cryotherapy for patients with RA, the lack of consensus on the methods used for both the type of PE to be proposed and the cryotherapy methods and temperatures employed. Consequently, we have proposed several preliminary studies to determine the most appropriate exercise and cryotherapy modalities for defining a simple, effective and suitable program. These works were carried out firstly in healthy subjects and after in patients with RA. We have also undertaken to better define the used conditions of the pulse wave velocity to interpret arterial stiffness and use it as a marker of effects of our PE program on cardiovascular risk. Finally, we tried to evaluate what could be the obstacles to the practice of PE for these patients, to consider and overcome them in the implementation of our proposals. The main results of our works allowed us to define the characteristics of a PE program associated with cryotherapy for patients with RA to act on their arterial stiffness.This program, entitled Prexcrim, was implemented with a group of patients with RA. The first results confirmed the feasibility of our proposals and the good tolerance of patients. No study output or side effect was observed in the patients. At this stage of inclusion and analysis of the results, it appears that the proposed PE program allows for changes in arterial stiffness, particularly for patients with high arterial stiffness. It was not observed exacerbation of the disease or inflammatory syndrome, which seems to reinforce the interest of the proposed cryotherapy method. The inclusions that continue will undoubtedly refine these first interpretations.In conclusion, our work proposes some responses about the lack in terms of the fight against the increased cardiovascular risk observed in patients with RA. Our approach allowed the realization of a simple and easy PE program associated with cryotherapy. The first results meet our expectations. The first analyzes shown that the principles of individualization and progressivity need to be improved to optimize the effects of the program.

La fonction de barrière de l'endothélium vasculaire est affectée par des modifications de la cadhérine des cellules endothéliales (VE-cadhérine) telles que la phosphorylation sur tyrosine dans son domaine cytoplasmique et le clivage de son domaine extracellulaire (sVE). Ce travail s'est articulé en deux parties : 1- Etude de ces modifications dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde (PR), et les mécanismes sous-tendus. Ce travail a permis de montrer que la VE-cadhérine est une cible du TNFα, une cytokine essentielle dans la PR, qui induit de la libération de sVE de façon dépendante de l'activité kinase de Src, suggérant l'implication d'un mécanisme de phosphorylation sur tyrosine dans ce processus. De plus, la VE-cadhérine est aussi la cible des protéases de la matrice extracellulaire telles que MMP-2. L'application de ces données fondamentales à la clinique a permis de montrer que sVE était retrouvée dans le sang de patients PR (n=63) et que son taux était corrélé à l'activité de la maladie. Ainsi, le dosage de sVE est d'intérêt dans la prise en charge des patients. 2-Etude de la phosphorylation de la VE-cadhérine dans un contexte d'angiogenèse hormono-régulée au cours du cycle ovarien chez la souris. Les résultats ont montré que le site Y685 de la VE-cadhérine est phosphorylé dans l'ovaire et l'utérus de souris de façon régulée pendant le cycle, ce qui permet de proposer ce modèle physiologique pour étudier la phosphorylation de la VE-cadhérine in vivo. L'analyse de souris knock-in Y685F de la VE-cadhérine (VE-Y685F) a montré que l'absence du site confère une perméabilité accrue dans l'ovaire et l'utérus mais aussi dans les petits capillaires de la peau. De plus, dans deux modèles d'induction d'arthrite, les souris VE-Y685F ont présenté un taux de sVE plus élevé que les contrôles. Au total, sVE et la phosphorylation de la VE-cadhérine ont un vaste champ d'application dans le traitement de la PR ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies pouvant s'étendre à d'autres pathologies vasculaires.

Nous avons développé des nanoparticules d’une prodrogue de glucocorticoïde, la dexaméthasone palmitate (DXP) à visée thérapeutique dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde (PR). Cette maladie auto-immune est caractérisée par une inflammation articulaire, une érosion osseuse et cartilagineuse et une dérégulation du système immunitaire. Parmi les traitements indiqués dans la PR, l'utilisation des glucocorticoïdes est limitée par leurs effets secondaires importants induits par leur pharmacocinétique défavorable. Afin de traiter la PR par voie intraveineuse, la formulation de nanoparticules PEGylées semble indispensable afin d’échapper au phénomène d’opsonisation et d’espérer obtenir une accumulation spécifique au niveau des articulations inflammées. Pour cela, nous avons développé des nanoparticules de DXP (DXP-NP) stabilisées par le DSPE-PEG2000.Les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules obtenues ont été évaluées ainsi que leur stabilité au cours du temps. La structure interne des nanoparticules définie comme amorphe ainsi que leur très fort taux de charge prouvent ainsi l’impact du DSPE-PEG2000 dans l’organisation moléculaire des DXP-NP. In vivo, l’étude de la pharmacocinétique et de la biodistribution des DXP-NP suite à leur administration intraveineuse a démontré une circulation prolongée du système. Dans un modèle murin de polyarthrite rhumatoïde, les DXP-NP ont démontré leur accumulation spécifique dans les articulations inflammées en corrélation avec une supériorité thérapeutique significative en comparaison avec la molécule libre hydrosoluble. Des études histologiques ainsi que l’évaluation du traitement sur l’apparition d’effets indésirables complètent l’étude in vivo. / We developed nanoparticles of a glucocorticoid prodrug, dexamethasone palmitate (DXP) for the treatment of rheumatoid arthritis (RA). Joint inflammation, bone and cartilage erosion and dysregulation of the immune system characterize this autoimmune disease. Among the treatments indicated in RA, the use of glucocorticoids is hampered by their side effects induced by their unfavorable pharmacokinetics. To treat RA intravenously, the formulation of PEGylated nanoparticles seems essential in order to escape from opsonization and to obtain a specific accumulation in the joints inflamed. Therefore, we developed DXP nanoparticles (DXP-NPs) stabilized by the DSPE-PEG2000.The physicochemical characteristics of the nanoparticles obtained were evaluated as well as their stability over time. The amorphous internal structure of the nanoparticles and their very high drug loading thus prove the impact of DSPE-PEG2000 in the molecular organization of DXP-NPs. In vivo, the study of the pharmacokinetics and biodistribution of DXP-NPs following intravenous administration demonstrated prolonged circulation of the system. In a mouse model of rheumatoid arthritis, DXP-NPs their demonstrated specific accumulation in inflamed joints in correlation with significant therapeutic superiority in comparison with the water-soluble free molecule. Histological studies as well as adverse events evaluation supplemented the in vivo study.

La fonction de barrière de l'endothélium vasculaire est affectée par des modifications de la cadhérine des cellules endothéliales (VE-cadhérine) telles que la phosphorylation sur tyrosine dans son domaine cytoplasmique et le clivage de son domaine extracellulaire (sVE). Ce travail s'est articulé en deux parties : 1- Etude de ces modifications dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde (PR), et les mécanismes sous-tendus. Ce travail a permis de montrer que la VE-cadhérine est une cible du TNFα, une cytokine essentielle dans la PR, qui induit de la libération de sVE de façon dépendante de l'activité kinase de Src, suggérant l'implication d'un mécanisme de phosphorylation sur tyrosine dans ce processus. De plus, la VE-cadhérine est aussi la cible des protéases de la matrice extracellulaire telles que MMP-2. L'application de ces données fondamentales à la clinique a permis de montrer que sVE était retrouvée dans le sang de patients PR (n=63) et que son taux était corrélé à l'activité de la maladie. Ainsi, le dosage de sVE est d'intérêt dans la prise en charge des patients. 2-Etude de la phosphorylation de la VE-cadhérine dans un contexte d'angiogenèse hormono-régulée au cours du cycle ovarien chez la souris. Les résultats ont montré que le site Y685 de la VE-cadhérine est phosphorylé dans l'ovaire et l'utérus de souris de façon régulée pendant le cycle, ce qui permet de proposer ce modèle physiologique pour étudier la phosphorylation de la VE-cadhérine in vivo. L'analyse de souris knock-in Y685F de la VE-cadhérine (VE-Y685F) a montré que l'absence du site confère une perméabilité accrue dans l'ovaire et l'utérus mais aussi dans les petits capillaires de la peau. De plus, dans deux modèles d'induction d'arthrite, les souris VE-Y685F ont présenté un taux de sVE plus élevé que les contrôles. Au total, sVE et la phosphorylation de la VE-cadhérine ont un vaste champ d'application dans le traitement de la PR ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies pouvant s'étendre à d'autres pathologies vasculaires. / The vascular endothelium barrier function is influenced by vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) modifications such as its cytoplasmic tail tyrosine phosphorylation and its ecto-domain cleavage (sVE). The work reported herein was divided into two parts: 1- Study of VE-cadherin modifications and the mechanisms underlying these ones in the rheumatoid arthritis context. This work demonstrated that VE-cadherin is a target of TNFα, a highly important cytokine in rheumatoid arthritis (RA) pathogenesis. We found TNFα to induce sVE shedding in a Src kinase dependent manner, suggesting the involvement of phosphorylation mechanism in this process. In addition, this VE-cadherin cleavage requires matrix metalloproteinase activities such as that of MMP-2. Applying these fundamental data to clinical study showed that sVE was detected in sera of 63 RA patients and its titer was correlated with the disease activity. This finding suggests an obvious interest for assaying sVE in RA therapies. 2- Study of VE-cadherin tyrosine phosphorylation in a context of hormones-regulated angiogenesis during mouse estrous cycle. The results showed VE-cadherin phosphorylation at Y685 that was regulated along mouse estrous cycle allowing to proposing mouse estrous cycle as a physiological model for studying VE-cadherin phosphorylation in vivo. The analysis of VE-cadherin Y685F knock-in mice (VE-Y685F) showed that these mice exhibit a higher vascular permeability in uterus and ovaries and the skin small capillaries compared to wild-type animals. Moreover, VE-Y685F mice presented higher levels of soluble VE-cadherin compared to wild-type counterparts in two induced arthritis model. Altogether, sVE and VE-cadherin phosphorylation present an array of interests for RA therapies as well as developing new therapeutic tools in RA and other vascular diseases.

La polyarthrite Rhumatoïde (PR) et le syndrome de Sjögren primitif (pSS) sont des deux maladies auto-immunes invalidantes pour lesquelles il n’existe à ce jour pas de traitement permettant la guérison des patients. Bien que les lymphocytes B soient impliqués dans le développement ces pathologies, l’existence de lymphocytes B capables de réguler l’inflammation est maintenant largement reconnue. Ces lymphocytes B régulateurs (Bregs) sont capables à la fois d’induire des lymphocytes T régulateurs et d’empêcher le développement de lymphocytes T pro-inflammatoires. In vivo, le transfert de ces Bregs est protecteur dans de nombreux modèles murins de maladies auto-immunes suggérant ainsi que promouvoir ces Bregs serait prometteur pour traiter les patients atteints de PR ou pSS. Cependant, il n’existe à ce jour pas de marqueur spécifique des Bregs, ce qui complique leur étude. Comme leurs fonctions régulatrices sont principalement médiées par l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, les Bregs peuvent être définis par leur capacité à produire de l’IL-10 après activation par des composés bactériens, notamment CpG, motifs mimant l’ADN microbien. Ces Bregs sont appelés B10+. Toutefois, les fonctions de ces B10+ ne sont pas bien définies chez l’homme. Ainsi, nous ignorons si la seule production d’IL-10 est suffisante pour définir les Bregs.Cette thèse a donc pour premier objectif de définir les fonctions les B10+ stimulés par CpG chez les individus sains et chez les patients, afin de déterminer si la production d’IL-10 était un bon marqueur des Bregs. Nous avons montré que les B10+ induits par CpG étaient capables d’induire des lymphocytes T régulateurs (Tregs et Tr1) mais ne diminuaient pas la proportion de lymphocytes T pro-inflammatoires (Th1 et LT-TNFα+). Chez les patients PR et pSS, les B10+ induisaient des Tregs et Tr1 mais chez les patients PR, ils induisaient également des Th1. Ces résultats suggèrent que la production d’IL-10 seule ne suffit pas à récapituler toutes les fonctions régulatrices des Bregs, et que le stimulus CpG impacte probablement leur fonctions.Pour mieux comprendre les mécanismes contrôlant la production d’IL-10 des lymphocytes B et pouvoir proposer d’autres stimuli pour les générer, nous avons étudié l’effet de l’acétate, un composé produit par les bactéries commensales, sur la génération des B10+. L’acétate était capable d’induire des B10+ chez la souris et chez l’homme. D’autre part, nous avons également étudié le métabolisme cellulaire de ces B10+. Nous avons montré que la glutamine était un nutriment essentiel à la génération des B10+ et à leurs fonctions régulatrices. En définitive, ce travail a permis de définir les fonctions des B10+ induits par CpG, de caractériser leur métabolisme et de proposer de un stimulus alternatif pour générer les B10+. / Rheumatoid arthritis (RA) and primary Sjögren's syndrome (pSS) are two debilitating autoimmune diseases. There is currently no treatment to cure patients. Although B lymphocytes are involved in the development of these pathologies, the existence of B cells capable of regulating inflammation is now widely recognized. These regulatory B cells (Bregs) are able of both inducing regulatory T cells and preventing the development of pro-inflammatory T cells. In vivo, the transfer of these Bregs is protective in many mouse models of autoimmune diseases thus suggesting that promoting these Bregs would be promising for treating patients with RA or pSS. However, there is currently no specific marker for Bregs, which largely hinders their study. Since their regulatory functions are mainly mediated by IL-10, an anti-inflammatory cytokine, Bregs can be defined by their ability to produce IL-10 after activation by bacterial compounds, including CpG. Those Bregs are called B10+ cells. However, the functions of these B10+ cells are not well defined in humans. We do not know whether IL-10 production is a sufficient marker to define Bregs.The main goal of this thesis was to define CpG-induced B10+ cell functions in healthy individuals and patients, to determine whether IL-10 production was a good marker for Bregs. We showed that CpG-induced B10+ cells were able to induce regulatory T cells (Tregs and Tr1) but did not decrease the proportion of pro-inflammatory T cells (Th1 and LT-TNFα +). In RA and pSS patients, B10+ cells induced Tregs and Tr1 but in RA patients they also induced Th1. These results shows that IL-10 production alone does not recapitulate all the Breg functions and that CpG stimulation might impact their functions.To better understand the mechanisms controlling IL-10 production by B cells, and to be able to propose other stimuli to generate them, we studied the effect of acetate, a compound produced by commensal bacteria, on B10+ cells generation. Acetate was able to induce B10+ cells in mice and humans. Besides, we studied B10+ cell metabolism. We have showed that glutamine was an essential nutrient for B10+ cell generation and for their regulatory functions. This work has made it possible to define the CpG-induced B10+ cell functions, to characterize their metabolism and to propose an alternative stimulus to generate B10+ cells.