Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Endo_MarcosSergio_M.pdf: 2753651 bytes, checksum: 43bc558b5fae49fdc35b6c39ba8cf0c8 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi investigar a microbiota e a presença de endotoxina bacteriana de dentes com insucesso endodôntico antes e após preparo químico-mecânico (PQM) e uso da medicação intracanal (MIC), através do método de cultura microbiana e da reação em cadeia da polimerase (PCR). Este trabalho também se propôs a quantificar endotoxinas e unidades formadoras de colônias (UFCs) dos mesmos dentes, correlacionando seus níveis com aspectos clínicos e radiográficos. Quinze dentes unirradiculares com insucesso endodôntico e lesão periapical foram selecionados. Foram empregados métodos bioquímicos e PCR para identificação dos microrganismos. O teste turbidimétrico LAL (Pyrogent 5000) quantificou a concentração de endotoxina antes e após PQM e MIC. As espécies comumente isoladas pelo método de cultura foram Gemella morbillorum, Haemophilus aphrophilus, Enterococcus faecalis e Actinomyces naeslundii, enquanto que Parvimonas micra, Prevotella nigrescens, Gemella morbillorum e Fusobacterium nucleatum foram detectados frequentemente pelo método de PCR. Foram detectados níveis de endotoxinas e UFCs em todos os casos antes e após PQM. Na coleta inicial foram obtidos valores de endotoxinas e UFCs, mediana - 3,96 EU/mL e 2,57 x 102 UFC/mL - respectivamente. Correlação positiva entre concentração de endotoxina e radioluscência periapical maior que 5 mm foi observada (p<0,05). PQM foi capaz de reduzir UFCs (99,93%) e endotoxinas (60,6%) (ambos, p<0,05), e foi responsável na maior redução microbiana ao comparar com a MIC. Conclui-se que houve prevalência de bactérias Gram-positivas anaeróbias facultativas, embora o método de PCR tenha detectado espécies fastidiosas Gram-negativas. Níveis de endotoxinas de bactérias Gram-negativas estão envolvidos na infecção persistente e mostraram associação com rarefação óssea periapical. Além disso, PQM associado à CLX 2% gel + EDTA 17% foi efetivo na redução de endotoxinas e UFCs presentes na infecção persistente de dentes com insucesso endodôntico, entretanto não promoveu uma completa remoção. / Abstract: This clinical study was conducted to investigate the microbiota and bacteria endotoxin of root canal from teeth with posttreatment apical periodontitis (PAP) by culture and polymerase chain reaction (PCR) before and after chemomechanical preparation (CMP) and after the use of intracanal medications (ICM). Furthermore this work aimed to quantify endotoxin and cultivable bacteria in root canals with PAP correlating their levels with the presence of clinical and radiographic features. Fifteen single root-filled teeth with PAP were sampled. Culture techniques were used to determine the colony-forming unit (CFU). Microrganisms were identified by biochemichal tests and PCR. Limulus amebocyte lysate (LAL, turbidimetric Pyrogent 5000) was used to quantify endotoxins before (S1) and after (S2) CMP and after the use of ICM. The bacterial species most frequently isolated were Gemella morbillorum, Haemophilus aphrophilus, Enterococcus faecalis and Actinomyces naeslundii; while Parvimonas micra, Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum and Gemella morbillorum were frequently detected by PCR. Endotoxin was always detected at S1 and S2. At S1, endotoxin and bacteria were detected in a median value of 3.96 EU/mL and 2.57 x 102 CFU/mL, respectively. A positive correlation was found between the endotoxin and radiolucency area (>5 mm). CMP was effective in reducing bacteria (99.93%) and endotoxin (60.6%) (both p<0.05), and it was responsible for the majority of the microbial reduction when compared with ICM. In conclusion the microbiota of root-filled canals with PAP is predominantly facultative Gram-positive even though fastidious Gram-negative bacteria were detected by PCR. Gram-negative bacterial endotoxins play a role in the PAP and are associated with periapical bone-destruction. Moreover CMP with 2% CHX gel + 17% EDTA was effective in reducing but not complete removing endotoxin and cultivable bacteria from persistent root canal infection. / Mestrado / Endodontia / Mestre em Clínica Odontológica

Orientador: Luis Alexandre Maffei Sartini Paulillo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-05T01:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeiteJunior_FernaoHeliodeCampos_D.pdf: 1914892 bytes, checksum: 9e016f7a5b89737fc1d4f4114e5ab871 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência da rugosidade superficial das resinas compostas de diferentes partículas de carga, sobre o acúmulo de placa bacteriana in situ, através da quantificação por meio de espectrofotometria e qualificação para o grupo mutans streptococci pela técnica da reação em cadeia da polimerase (¿polymerase chain reaction¿ - PCR). Assim, foram confeccionados corpos de prova cilíndricos com os compósitos: Durafill VS, Tetric Ceram e Filtek P60, apresentando duas superfícies produzidas pela fotoativação do compósito em contato com a tira matriz de poliéster - superfície lisa e pelos Discos Sof-Lex de granulação grossa - superfície rugosa. Da interação resina composta e textura superficial foram constituídos 6 grupos experimentais: Durafill VS/Superfície Lisa, Durafill VS/Superfície Rugosa, Tetric Ceram/Superfície Lisa, Tetric Ceram/Superfície Rugosa, Filtek P60/Superfície Lisa e Filtek P60/Superfície Rugosa. A rugosidade superficial dos corpos de prova foi avaliada pela leitura em rugosímetro (Ra). Para a avaliação do acúmulo de placa bacteriana in situ, foram selecionados dez voluntários, para os quais foram confeccionados dispositivos palatinos em acrílico, onde foram fixados seis corpos de prova correspondentes a cada grupo experimental. Os voluntários utilizaram o dispositivo com os corpos de prova por três dias na semana. No quarto dia das primeiras seis semanas, a placa formada sobre cada corpo de prova foi extraída em NaOH 1,0M e quantificada em espectrofotômetro. Os corpos de prova com superfície rugosa apresentaram maior acúmulo de placa bacteriana do que aqueles com superfície lisa, independente da resina composta utilizada. Entre os corpos de prova lisos, apesar de haver diferença estatística significativa entre a menor rugosidade superficial da resina composta de micropartículas (Durafill VS) e a maior rugosidade das outras duas resinas compostas (Filtek P60 e Tetric Ceram), não foi observada diferença no acúmulo de placa entre os materiais testados. Na sétima semana, o DNA da placa bacteriana acumulada sobre os corpos de prova foi extraído e comparado através de PCR utilizando primers universais para bactérias do grupo mutans streptococci, que amplificam genes de RNA ribossômico 16S e digestão do produto da amplificação com as enzimas de restrição HaeIII, CfoI e RsaI. Constatou-se a presença de bactérias do grupo mutans streptococci nos corpos de prova confeccionados com as três resinas compostas testadas. Verificou-se semelhança nos perfis gerados pela análise de PCR-RFLP das amostras dos voluntários, indicando que as resinas compostas, Tetric Ceram, Durafill VS ou Filtek P60 e o tipo de superfície, lisa ou rugosa, não afetaram significativamente a composição da placa bacteriana acumulada nos corpos de prova para o grupo mutans streptococci / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of surface roughness of different filled composites on in situ bacterial plaque retention, quantified by spectrophotometry and qualified for mutans streptococci group by polymerase chain reaction (PCR). Specimens were prepared with the composites Durafill VS, Tetric Ceram and Filtek P60, with smooth and rough surfaces, produced by phtotoactivation through Mylar strip or Sof-Lex discs, respectively. The interaction composite x texture surface generated six experimental groups: Durafill VS/smooth surface, Durafill VS/rough surface, Tetric Ceram/smooth surface, Tetric Ceram/rough surface, Filtek P60/smooth surface and Filtek P60/rough surface. Surface roughness of samples was evaluated by profilometer reading (Ra). For in situ experiment, ten subjects were chosen which wore acrylic palatal appliances containing samples of the six experimental groups. All subjects wore the appliances for three days a week. In the fourth day of the first six weeks, the amount of dental plaque formed on the samples were extracted in 1.0M NaOH and analyzed by spectrophotometry. Rough surface samples showed significantly greater amount of bacterial plaque than smooth surface samples, for the three composites tested. For the smooth samples, in spite of the significant difference between the lower roughness of Durafill VS composite and the higher roughness of both Filtek P60 and Tetric Ceram composites, no difference was observed in the amount of bacterial plaque among the tested materials. In the seventh week, DNA of the bacterial plaque formed on the samples was extracted and compared by PCR using universal primers for mutans streptococci group, which amplify ribossomal RNA 16S genes, and digestion of PCR products with the restriction enzymes HaeIII, CfoI e RsaI. Bacteria of mutans streptococci group were found in all composites samples. The profiles generated by the PCR-RFLP analysis of the volunteers' samples were similar, indicating that the composites Tetric Ceram, Durafill VS or Filtek P60 and the smooth or rough surfaces did not affect significantly the composition of the bacterial plate formed on the samples for mutans streptococci grou / Doutorado / Dentística / Doutor em Clínica Odontológica

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-06T06:24:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stipp_RafaelNobrega_M.pdf: 1453482 bytes, checksum: 75a8c7b14bc2c1994765a8fd89ae2d9f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Streptococcus mutans são os principais patógenos da cárie dentária, pois são capazes de se acumular no biofilme dentário na presença de sacarose, e sob condições altamente acidogênicas, promovem a desmineralização dentária. As glucosiltransferases B (GtfB) e C (GtfC) produzidas por S. mutans são fundamentais neste processo, porque catalisam a síntese de glucanos extracelulares insolúveis, a partir da sacarose. A proteína ligante de glucano B (GbpB) parece também participar do acúmulo de S. mutans nos biofilmes, embora por processos ainda não compreendidos. Pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam a expressão dos genes que codificam essas proteínas de virulência (gtfB, gtfC e gbpB). Neste sentido, objetivamos caracterizar o padrão de expressão dos genes gtfB, gtfC e gbpB e de seus possíveis genes regulatórios (vicR, comE, ciaR e rr11) em genótipos distintos de S. mutans. Para isso, foram realizadas análises de transcrição reversa-PCR semi-quantitativa (RT-PCR) dos genes alvo em diferentes fases de curvas de crescimento planctônico, em meio Brain Heart Infusion, a 37°C, em condições de anaerobiose. RNAs das células nas diferentes fases de crescimento foram extraídos e submetidos a reações de transcriptase reversa com primers arbitrários, para obtenção dos cDNAs totais. Análises de PCR semi-quantitativas dos cDNAs foram então realizadas com primers específicos e normalizados pela expressão do gene housekeeping 16SRNA, cuja expressão foi constante nas condições experimentais estudas. Os padrões de transcrição de gtfB e gtfC foram específicos ao background genético da cepa estudada. Os níveis de transcritos de gtfB e de gtfC foram coordenados durante fases específicas de crescimento, mas divergências nas curvas expressão dos mesmos ocorreram em grande parte dos genótipos. Os níveis de transcritos de gbpB foram também variáveis entre cepas, mas assumiram padrão independente de genes gtf e foi caracterizado por menores variações entre as diferentes fases de crescimento. Os genes regulatórios demonstraram picos de expressão nas fases log e/ou estacionária de crescimento, de acordo com o genótipo testado. Os resultados indicam que o padrões de expressão dos genes estruturais (gtfB, gtfC e gbpB) e regulatórios são cepa-específicos e que gtfB e gtfC são regulados por sistemas independentes, os quais parecem ser ativados em fases distintas de crescimento / Abstract: Streptococcus mutans, the main pathogen of dental caries, have the capacity to accumulate in the dental biofilm in the presence of sucrose, under highly acidic conditions that are responsible for teeth demineralization. The glucosyltransferases B (GtfB) and C (GtfC) produced by S. mutans are essential in this process, because catalyze the synthesis of water-insoluble from sucrose. The Glucan-binding protein B (GbpB) appears to also participate in S. mutans accumulation, but under processes that are still unclear. Little is known about the mechanisms that regulate expression of genes encoding these proteins (gtfB, gtfC and gbpB). In this sense, we aimed to characterize the patterns of transcription of gtfB, gtfC and gbpB in distinct S. mutans genotypes. For that purpose, semi-quantitative analysis of reverse transcription¿PCR (RT-PCR) were performed in strains at different phases of the growth curves in Brain Heart Infusion broth bath cultures at 37°C, under anaerobiosis. RNAs were extracted from cells at different growth phases, and applied in reactions of reverse transcription with arbitrary primers to yield total cDNAs. Semi-quantitative PCR reactions were then performed with the cDNAs using specific primers to each target gene, and normalized by the expression of the housekeeping gene 16SRNA, whose expression remained constant at the experimental conditions. Patterns of expression of gtfB and gtfC were specific to the strain background. Transcriptions of gtfB e de gtfC were coordinated in specific phases of growth, but the curves of transcription diverged at different phases in the majority of the genotypes studied. The levels of gbpB transcripts were variable between strains and assumed an independent pattern when compared with gtf genes. The levels of gbpB transcripts were characterized by lesser variations between the different phases of growth. The regulatory genes have shown peaks of expression at log and/or stationary phases of growth and the curves of transcript levels were strain-dependent. The results indicate that patterns of expression of gtfB, gtfC and gbpB and regulatory genes are strain-specific, and that gtfB and gtfC are regulated by distinct systems that may be activated at distinct phases of growth / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:58:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aidar_Marisi_M.pdf: 336669 bytes, checksum: 37140ca0e23c258906c1b710bfdb5687 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Células bucais são fontes convenientes de DNA para diagnóstico e estudos epidemiológicos. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um método simples e prático para obter células epiteliais, através de bochechos, a fim de serem usadas como fonte de DNA, avaliar a estabilidade do DNA na solução de bochecho no decorrer do tempo e analisar a eficácia deste método na amplificação por PCR de fragmentos de diferentes comprimentos. Os procedimentos usados neste estudo evitam o uso de solventes orgânicos permitindo uma prática laboratorial mais segura. Isto é alcançado pela remoção das proteínas celulares por desidratação e precipitação com uma solução de acetato de amônio 8 M. Bochechos com 5 mL de dextrose 3% foram coletados de 65 indivíduos. Adicionados a cada amostra 3 mL de solução TNE [17 mM Tris-HCL (pH 8,0), 50 mM NaCl, 7 mM EDTA] diluído em etanol 66%. O conteúdo das amostras de bochechos de 20 indivíduos foi dividido em 4 tubos. Um tubo foi usado para extração imediata (igualmente às demais 45 amostras) e os três tubos restantes foram mantidos em temperatura ambiente por períodos de 2, 15 e 30 dias, seguidos pela extração do DNA. As células bucais foram centrifugadas e ressuspendidas em solução contendo 10 mM Tris (pH 8.0), 0.5% SDS, 5 mM EDTA e proteinase K (20 mg/mL). Após incubação a 55ºC durante toda a noite as proteínas foram removidas pela adição de acetato de amônio 8 M seguida por centrifugação. O DNA foi precipitado com isopropanol e ressuspendido em 10 mM Tris (pH 7.8) e 1 mM EDTA. Foram realizadas reações de PCR com primers específicos para fragmentos dos seguintes genes: PAX9 (202 pb); KLK (555 pb); MMP20 (1434 pb). Nossas análises fornecem evidências consistentes de que o produto de DNA extraído por esta metodologia é suficiente para diversas amplificações por PCR. Fragmentos grandes de DNA (1434 pb) puderam ser obtidos com sucesso. Além disso, com a adição de TNE/Etanol o DNA é eficientemente preservado na solução de bochecho, a qual pode ser estocada em temperatura ambiente por até trinta dias, o que possibilita a coleta em campo e contribui para o aumento da amostragem. Este protocolo permite a extração de maneira rápida, simples, econômica e garante o processamento de várias amostras ao mesmo tempo / Abstract: Buccal cells provide a convenient source of DNA for diagnosis and epidemiological studies. The goal of this study was to develop a convenient method to obtain buccal cells from mouthwash samples to be used as a source of DNA, and to evaluate the stability of the DNA in the mouthwash solution over time. Finally, we analysed if the methodology could be used for PCR amplification of high molecular mass fragments. The procedures used in this paper avoid the use of any organic solvent. This is achieved by salting out the cellular proteins by dehydration and precipitation with a 8 M ammonium acetate solution. A group of 65 consenting subjects undertook a mouthwash containing 5mL of 3% dextrose solution. Three mL of TNE solution [17 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl and 7 mM EDTA] diluted in 66% ethanol, was added to the tube. The mouthwash solution of 20 individuals was divided into 4 tubes. One tube was used for immediate extraction (equally to the others 45 samples) and the three remaining were kept at room temperature for periods of 2, 15 and 30 days, followed by DNA isolation. Buccal cells were pelleted and resuspended in a solution containing 10 mM Tris (pH 8.0), 0.5% SDS, 5 mM EDTA, and proteinase K (20 mg/mL). After overnight incubation at 55°C proteins were removed by adding 8 M ammonium acetate followed by centrifugation. DNA was precipitated with isopropanol and resuspended in 10 mM Tris (pH 7.8) and 1 mM EDTA. PCR amplifications were performed. Three pairs of primers were used: PAX9 (202 pb); KLK (555 pb); MMP20 (1434 pb). Our analyses provided consistent evidences that DNA yield extracted by this methodology is sufficient for several PCR amplifications. Large size products (1434 bp) could be successfully obtained. Additionally, dilution of the mouthwashes in TNE/ethanol prevented DNA degradation at room temperature for periods of up to 30 days, allowing safe storage and transport of field specimens collected in isolated communities, distant from the laboratory. On conclusion, the protocol described here is quick, simple to perform, sensitive, economical and several samples can be processed at the same time / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O presente trabalho teve como objetivos verificar os efeitos da radiação gama em grãos de milho contaminados artificialmente com Aspergillus flavus Link produtor de aflatoxinas; demonstrar a aplicação da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) no diagnóstico de A. flavus, bem como verificar o efeito da radiação no perfil das bandas de DNA. Vinte amostras de grãos de milho com 200 g cada foram irradiadas individualmente com 20 kGy, para eliminar a contaminação microbiana. Em seguida, as amostras foram inoculadas com A. flavus toxigênico (1 x 106 esporos / ml), incubadas por 15 dias a 25 °C em ambiente com umidade relativa ao redor de 97,5% e irradiadas com 0; 2; 5 e 10 kGy. As amostras, 5 para cada dose de irradiação, foram analisadas individualmente quanto ao número de células fúngicas, atividade de água, teste de viabilidade (diacetato de fluoresceína e brometo de etídio), PCR e detecção de aflatoxinas (AFB). Os resultados demonstraram que as doses utilizadas foram efetivas na redução do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g), principalmente as doses de 5 e 10 kGy. Em adição, o teste de viabilidade mostrou uma diminuição de células viáveis com o aumento das doses de irradiação. A redução de AFB1 e AFB2 foi mais eficiente com o emprego de 2 kGy, comparativamente à dose de 5 kGy, enquanto a dose de 10 kGy degradou totalmente as aflatoxinas. Além disso, observou-se que AFB2 apresentou-se mais radiosensível. O emprego da técnica de PCR revelou a presença de bandas de DNA em todas as amostras. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T01:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kitamura_TatianePedroso_M.pdf: 3832022 bytes, checksum: 173dd22fe017d7e26abc70190145ad5f (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A Aids é causada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1). A infecção por este vírus tem diminuído significativamente entre a população pediátrica nos últimos anos, devido à atenção especial do Governo Brasileiro a pacientes infectados pelo HIV-1, entre eles as gestantes. A transmissão perinatal do HIV-1 pode ocorrer durante a gestação, na hora do parto ou após o parto, através do aleitamento materno. O diagnóstico da infecção pelo HIV-1 em adultos e em crianças com idade superior a 18 meses é usualmente estabelecido por ensaios sorológicos que identificam anticorpos específicos contra o HIV-1. Entretanto, o recém - nato adquire os anticorpos maternos da classe IgG, durante a gestação, o que pode levar a um diagnóstico falso-positivo nessa criança. O Ministério da Saúde no Brasil recomenda que o diagnóstico em crianças com idade inferior a 18 meses, seja feito através de técnicas de biologia molecular, pois estes detectam partículas virais e não os anticorpos contra o HIV-1. Um teste bastante eficiente é a reação em cadeia da polimerase (PCR), por ser um método de diagnóstico precoce, rápido, sensível, e que pode ter sua sensibilidade e especificidade elevada ainda mais com a realização de uma segunda reação de amplificação ("Nested-PCR"). A PCR detecta fragmentos - alvo do genoma viral, porém, para que as realizações das amplificações sejam satisfatórias, é necessária uma quantidade de sangue considerada de grande volume para recém - natos. Com base na necessidade de um diagnóstico precoce do HIV-1 e de uma melhor qualidade da amostra em pequenos volumes sangüíneos, este projeto teve como objetivo principal, a padronização da técnica de extração do DNA através de amostras sangüíneas colhidas em papel filtro, com utilização do kit FTA Cards (Life Technologies). Para confirmação da eficácia do método proposto foi realizada a técnica da "Nested-PCR", já previamente padronizada no laboratório onde foi desenvolvida a pesquisa, a partir de sangue periférico colhido com EDTA. Para a realização da PCR e "Nested-PCR" foram utilizados quatro pares de "primers" externos (PCR) e internos ("Nested-PCR") para genes que flanqueiam regiões conservadas do HIV-1 (gene gag, gene pol e duas regiões do gene env). Foram analisados 71 pacientes, sendo: 43 crianças com suspeita de infecção perinatal pelo HIV-1, 11 crianças e 14 adultos soropositivos (para controle positivo da reação) e 03 crianças negativas para infecção pelo HIV-1 (controle negativo da reação). Os resultados obtidos mostraram concordância entre os dois métodos de extração estudados, confirmando dados da literatura, onde há a afirmação de que a extração de DNA colhido em papel filtro é uma técnica que pode ser aplicada com sucesso para a realização da "Nested-PCR" em diagnóstico de crianças com suspeita de infecção perinatal pelo HIV-1 / Abstract: AIDS is caused by the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The infection by this virus in significantly falling between pediatric patients in the last years, mainly because the special interest of the Brazilian Government to the HIV-1 infected patients, especially the pregnant woman. The perinatal HIV-1 transmission may occur during the pregnancy, at the time of the birth, or after the birth during breast feeding. The diagnosis of HIV-1 infection in adults and children older than 18 months is usually defined by serological assays, which identify specific antibodies against HIV-1. However, the newborn acquire the IgG maternal antibodies during the pregnancy, which can result in a false positive diagnosis. The Brazilian Department of Health suggests that the diagnosis in patients younger than 18 months old could be defined with molecular biology, because these tests usually detects viral particles and not the HIV-1 antibodies. A very efficient test, the polimerase chain reaction (PCR), can define the diagnosis precocious, quick and sensible, and, in addiction, the performance of a second amplification reaction ('Nested-PCR") may elevate the sensibility and specificity of this test. The PCR detects fragments of the viral genoma, however, to obtain satisfactory amplifications, it is necessary a large volume of blood of the newborn. Based on the necessity of precocious diagnosis of HIV-1 and better quality of small blood volume sample, this project aim to standardize the technique of DNA extraction of blood sample obtained with filter paper, with the utilization of FTA Card kits (Life Technologies). To confirm the accuracy of this proposed method, it was applied the "Nested-PCR" technique, previously standardized in our laboratory, based on peripheral blood obtained with EDTA. To perform the PCR and "Nested-PCR", there were utilized four pairs of external (PCR) and internal ("Nested-PCR") primers to genes which flank conserved regions of HIV-1 (gag gene, pol gene and two regions of the env gene). There were studied 71 patients: 43 children with suspicious HIV-1 perinatal infection, 11 children and 14 adults, who were HIV-1 seropositive, and three children HIV-1 negative (control group). The results showed concordance between the two extraction methods studied, corroborating with the literature, which affirms that the DNA extraction obtained with filter paper is a technique that could be applied with success to perform "Nested-PCR" to the diagnosis of children with suspicious HIV-1 perinatal infection / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Ana Paula de Souza Pardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-14T23:49:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_NailaFrancisPaulode_D.pdf: 4618139 bytes, checksum: 5b6009780de9c20dba293517d2d3eb6c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A doença periodontal crônica é caracterizada pela inflamação e destruição dos tecidos periodontais, podendo levar à perda dos dentes. Está claro que a periodontite é influenciada pela genética do hospedeiro, constituição do biofilme bucal e o hábito de fumar. Sabe-se que a interleucina 8 (IL-8) é a principal molécula atrativa de neutrófilos. Essas células são as primeiras a chegar aos locais inflamados e além de realizar fagocitose, participam também da destruição do tecido periodontal. Sabe-se também que os patógenos que causam a periodontite são reconhecidos por proteínas receptoras de membrana denominadas receptores Toll-like (TLR), que uma vez acionados iniciam a resposta imune inata. IL8 e TLRs são expressos constitutivamente por células bucais e estão superexpressos na periodontite. Em particular, a IL-8 está ainda aumentada em indivíduos com periodontite crônica fumantes. A expressão gênica é controlada por diferentes mecanismos, incluindo a metilação de DNA. A metilação em dinucleotídeos CpG presentes em promotores de genes inibe a expressão do gene, podendo silenciar por completo a expressão gênica. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o padrão de metilação no DNA nas regiões promotoras dos genes IL8, TLR2 e TLR4 em células bucais e sanguíneas de indivíduos com periodontite crônica fumantes e não fumantes. Também, analisar os níveis de transcritos destes genes quando encontrado diferença no padrão de metilação entre os grupos, a fim de associar o padrão de metilação com a transcrição gênica. Amostras de DNA foram purificadas de células da mucosa bucal, de tecido gengival e tecido sanguíneo de indivíduos saudáveis e com periodontite crônica fumantes e não fumantes. A metilação no gene IL8 foi investigada pela transformação com bissulfito de sódio seguida pela técnica de PCR Específica para Metilação. A análise de metilação nos genes TLR2 e TLR4 foi realizada utilizando o método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação. Após o tratamento pelo bissulfito de sódio (IL8) ou digestão enzimática (TLRs), DNA foi amplificado por PCR, submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida 10% corado pelo SYBR Gold. Os níveis de transcritos foram analisados utilizando PCR Quantitativo. A análise estatística foi realizada pelo teste de x2 e Kruskal-Wallis para metilação e expressão gênica, respectivamente. A correlação entre metilação versus expressão foi realizada a partir do teste de coeficiente não linear de Spearman. Os resultados indicam que para células epiteliais da mucosa bucal, a frequência de desmetilação no gene da IL8 é maior no grupo periodontite crônica, independente do hábito de fumar, em comparação ao grupo saudável (p<0,0001). Não foram detectadas diferenças no padrão de metilação no tecido gengival e sanguíneo entre os grupos. Foram encontrados maiores níveis de transcritos de IL-8 no grupo periodontite em comparação ao grupo saudável (p=0,007), entretanto, não há relação entre o padrão de metilação e expressão gênica (p>0,05). Para o gene TLR2, não foram detectadas diferenças no padrão de metilação entre os grupos em nenhum tecido estudado (p>0,05). Para o gene TLR4, foi encontrada massiva desmetilação na mucosa bucal e para tecido gengival a desmetilação foi ainda maior, principalmente dentro do grupo periodontite (p=0,03). / Abstract: Chronic periodontal disease is characterized by inflammation and destruction of periodontal tissues, culminating in teeth loss. It is clear that periodontitis is influenced by host genetic, biofilm, and smoking habit. There are some important molecules involved on the pathogenesis of periodontitis. Interleukin (IL-8) is responsible for inducing chemotaxis, which is the directed migration of neutrophil to a site of inflammation. Neutrophil contributes to the elimination of the infecting bacteria and tissue destruction. Infecting bacteria are recognized by transmembrane receptors called Toll-like receptors (TLR), which recognized molecular pattern of microorganisms. The recognition of a variety of microorganisms components by individual TLRs induces innate immune responses. IL8 and TLRs are constitutively expressed by buccal cells and they are upregulated during periodontitis. Genetic transcription is regulated by different pathways, including DNA methylation. Methylation in CpG dinucleotides of gene promoters downregulates the levels of transcription and may even silence the gene transcription completely. So, the objective of this study was to analyze the pattern of DNA methylation in the promoter region of IL8, TLR2 and TLR4 genes in oral cells and blood tissue from healthy subjects and subjects with chronic periodontitis smokers and non-smokers. We also investigated the levels of mRNA expressed when different methylation status were found amoung groups. DNA samples were purified from buccal mucosa, gingival tissue and blood tissue of healthy subjects and subjects with chronic periodontitis smokers and non-smokers. Methylation of IL8 gene was investigated using sodium bisulphite modification followed by Methylation Specific PCR. Methylation analysis of TLRs genes were performed using Specific Methylation-Sensitive Restriction Enzymes. After sodium bisulphate modification (IL8) or enzymatic digestion (TLR2 and TLR4), DNA was amplified by PCR and the results were visualized after electrophoresis on 10% polyacrylamide gels stained by SYBR Gold. Levels of mRNA were analised using Real Time PCR. The statistical analysis was performed using the test of x2 and Kruskal-Wallis test for methylation status and gene expression, respectively. The correlation among methylation status versus gene expression was performed using no linear coefficient test of Spearman. The results indicate that frequency of IL8 gene demethylation is higher in individuals with chronic periodontitis, independent of smoking habit, than healthy group (p<0.0001). Differences were not detected in the methylation status in gingival tissue and blood tissue among the groups. Higher levels of IL-8 mRNA are expressed in periodontitis group than healthy group (p=0.007), however, we did not observe a relationship between IL8 gene methylation and gene expression. No significant difference was observed for TLR2 gene promoter among groups in all studied tissues (p>0.05). TLR4 gene promoter showed massive demethylation in oral mucosa and for gingival tissue it was even higher, mainly in periodontitis group (p=0.03). / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T19:48:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sampaio_AnaMaria_M.pdf: 6064318 bytes, checksum: 48e117e585e9ab62265d2b877c289d84 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O Herpesvirus Humano 5 (HHV-5), Herpesvirus Humano 6 (HHV-6) e o Herpesvírus Humano 7 (HHV-7), são vírus universais pertencentes à subfamília betaherpesvirinae, e apresentam alta prevalência na população brasileira. Em adultos saudáveis, após infecção primária, esses vírus permanecem latentes, podendo ser reativados em um período de imunossupressão, como acontece em pacientes submetidos a transplantes, o que pode causar complicações graves, que vão desde rejeição de enxertos ao óbito. Esse estudo visou a monitorização da co-infecção pelo HHV-5, HHV-6 e HHV-7 em pacientes submetidos a transplante hepático no Hospital das Clínicas da UNICAMP e a correlação dos dados obtidos com o impacto clínico nesse grupo de pacientes para compreender melhor os aspectos que envolvem a infecção ativa pelo HHV-5, HHV-6, HHV-7 e suas inter-relações, utilizando técnicas laboratoriais que fazem diagnóstico precoce de infecção ativa, avaliação da terapia antiviral específica e prevenção da doença causada por esses vírus. Foram monitorizados 53 pacientes transplantados hepáticos através de testes de antigenemia e NESTED-PCR (N-PCR) em sangue periférico para a detecção do HHV-5, NESTED-PCR em sangue periférico para a detecção do HHV-6, NESTED-PCR em soro para detecção do HHV-7, que foram realizadas no pré-operatório e periodicamente no pós-operatório. Com essa metodologia 33/53 (62,3%) dos pacientes apresentaram infecção ativa por HHV-5, 21/53 (39,6%) por HHV-6 e 23/53 (43,4%) por HHV-7. A co-infecção ocorreu em 8/53 (15,1%) para HHV-5/HHV-6, e 5/53 (9,4%) para HHV-5/HHV-7, 2/53 (3,8%) por HHV-6/HHV-7, e 1/5 (1,9%) pelos três vírus estudados (HHV-5/HHV-6/HHV-7). Apresentaram infecções oportunistas 31/53 (58,5%) dos pacientes estudados, e destes 21/31 (39,6%) tiveram infecção ativa isoladamente por HHV-5, 14/31 (26,4%) tiveram infecção ativa isoladamente por HHV-6, e 11/31 (20,8%) tiveram infecção ativa isoladamente por HHV-7. Os resultados obtidos e os inúmeros estudos sobre o impacto clínico da detecção e tratamento desses betaherpsvírus em pacientes transplantados hepáticos mostram a importância de estudarmos sua prevalência, métodos diagnósticos e seu impacto clínico em nosso meio / Abstract: The human herpesvirus 5, human herpesvirus 6 e human herpesvirus 7 to the ß-herpesvirus subfamily of the Herpesviridae family. They show a hight prevalence in the population. Many times the infection remains assintomatic in healthy adults and can be reactivated from immunosuppression period especially after organ transplantation, as it happens to patients that underwent an organ transplantation, though it can cause several complication that are since allograft rejection to mortality. This study shows the monitoring of concurrent infection by HHV-5, HHV-6 and HHV-7 in patients that had been undergone to liver transplantation and the results among them with the clinic impact in this infection by HHV-5, HHV-6 and HHV-7 and its concurrent, using lab tecnique that present an early diagnostic of the active infection, management of specific therapy antiviral and prevention of the deseases caused by these virus. Fifty three patients posttranplanted were assisted though antigenemia and nested-pcr tests in peripheral blood to detection of HHV-5, and N-pcr in peripheral blood to detection of HHV-6 and N-pcr in serum to detection of HHV-7 that were done during before transplantation and always in the posttransplantation in these patients and its medical record analysis. The antigenemia to the HHV-6 and HHV-7 was (standard) for the first part of the test and the part is in the standard time. With this methodological, 62,3% of the patients showed active infection by HHV-5, 39,6% by HHV-6 and 43,4% by HHV-7, 15,1% of the patients, showed ( co-infection) HHV-5 and HHV-6, 9,4% by HHV-5/HHV-7, 3,8% by HHV-6/HHV-7 and 1,9% by three virus (HHV-5/HHV-6/HHV-7). 58,5% of the patients studied showed opportunistics infections, and 39,6% showed isoled active infection by HHV-5, (26,4%) showed isoled active infection by HHV-6 and (20,8%) showed isoled active infection by HHV-7. (58,5%) showed oportunites infection , 29% showed any kind of allograft rejection, 44,4% showed active infection by HHV-5, 44,4% showed active infection by HHV-6 and 33,3% by HHV-7. Human herpesvírus (HHV) 6 and 7 are novel members of the ß-herpesvirus family that maintain latency in the human host after primary infection. Reactivation from latency and/or increased degree of viral replication occurs during periods of immune dysfunction. The clinical effect of HHV-6 and HHV-7 reactivation in recipients of liver transplats is now being reconized. A gronving body of evidence suggests that the more important effect of HHV-6 and HHV-7 reactivation on the outcomes of liver transplantation may be mediated indirectly by their interactions with the other ß-herpesvirus - cytomegalovirus (HHV-5) we conducted a prospective study in fifthy three liver transplant patients to detect active infection by HHV-5, 6 and 7, using Nested PCR and antigenemia tests. Active infection with HHV-5 was detected in 62,3% by HHV-6 in 39,6% and 43,4% by HHV-7. Co- infection by HHV-5/HHV-6 occured in 15,1% of the patients, by HHV-5/HHV-7 in 9,4%, by HHV-6/HHV-7 in 3,8% and by HV-5/HHV-6/HHV-7 in 1,9%. Fivety eigth percent of the patients studied showed opportunistics infections, of this 39,6% had isolated active infection by HHV-5, 26,4% isolated active infection by HHV-6 and 20,8% isolated active infection by HHV-7. In conclusion, HHV-5, HHV-6 and HHV-7 active infection, are frequent in liver transplant patients and early diagnose to prevent clinical impact are necessary / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Valeria Maia de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:04:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Crespim_Elaine_M.pdf: 1613061 bytes, checksum: 0510cf7cad319e1cd26f150b983f83bd (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A abordagem tradicional empregada em estudos de Microbiologia Ambiental, baseada em métodos de isolamento seletivo e cultivo de microrganismos em laboratório, embora seja útil para a determinação do potencial fisiológico dos organismos isolados, é inadequada para a realização de uma caracterização abrangente da comunidade microbiana destes ambientes ou para detectar microrganismos de difícil cultivo ou que vivem em consórcios. O emprego de técnicas moleculares em estudos de comunidades microbianas, as quais envolvem o isolamento direto de DNA a partir de amostras ambientais, a amplificação de genes conservados pela técnica de PCR e a análise de seqüências de rDNA 165, tem demonstrado resultados promissores em Ecologia Microbiana, uma vez que permite identificar organismos de ambientes naturais sem a necessidade de cultivo dos mesmos. A detecção de microrganismos com potencial para biodeterioração, biodegradação e biocorrosão encontrados em depósitos petrolíferos é de grande importância na medida em que estes organismos podem estar relacionados com a perda da qualidade do petróleo nos reservatórios e etapas subseqüentes de exploração (extração, . armazenamento e refino). O presente trabalho teve como objetivos desenvolver um método molecular para a detecção rápida de grupos específicos de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos e avaliar a sua distribuição e abundância em diferentes amostras de óleo e água de formação provenientes de depósitos petrolíferos da bacia de Campos (RJ). Nossos resultados revelaram a presença dos grupos Bacíllus spp., Streptomyces spp., Achromobacter xy/osoxidans, Bacíllus pumilus, Micrococcus spp. e Dietzia spp. nas amostras de petróleo estudadas. Alguns destes microrganismos apresentaram ampla ocorrência, embora em baixa abundância, nas amostras dos cinco poços avaliados, independentemente do grau de biodegradação dos óleos e condições de pro{undidade e temperatura dos reservatórios. O desenvolvimento de um método molecular para a rápida detecção de grupos de microrganismos potencialmente biodegradadores em amostras ambientais seria extremamente útil como uma ferramenta de apoio para a avaliação da qualidade do óleo em reservatórios de produção / Abstract: The traditional approach used in Environmental Microbiology studies, based on selective isolation and cultivation methods, although very useful for determination of the physiological potential of the isolated organisms, is inadequate for a broad characterization of the microbial community in these environments, since it does not allow the recovery of fastidious microorganisms or the ones that live in consortia. The use of molecular techniques in microbial community studies, which involve the direct DNA isolation from environmental samples, amplification of conserved genes by PCR and sequence analysis, has shown promising results in Microbial Ecology, as it allows the identification of organisms trom natural environments without the need of cultivation. The detection of microorganisms with potential for biodeterioration, biodegradation and biocorrosion in petroleum deposits is of great importance, as these organisms may be related to a decrease in petroleum quality in the reservoirs and subsequent exploration steps (extraction, storage and refining). The present work aimed at developing a molecular method for the rapid detection of specific groups of hydrocarbondegrading microorganisms and evaluating their distribution and abundance in different oil and formation water samples originated trom petroleum reservoirs in the Campos basin (RJ). Our results revealed the presence of the target groups Bacillus spp., Streptomyces spp., Achromobacter xylosoxidans, Bacillus pumilus, Micrococcus spp. and Dietzia spp. in the environmental samples under study. Some of these microorganisms were of broad occurrence, although in low abundance, in ali the five samples trom the petroleum wells analyzed, in spite of the oil biodegradation levei and depth and temperature conditions. The development of a molecular method for the rapid detectión of specific groups of biodegrading microorganisms in environmental samples would be extremely useful as a supporting toei for the evaluation of oil. quality in the production reservoirs / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Sergio Tadeu Martins Marba / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T12:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kallas_SheiladeLima_M.pdf: 1394129 bytes, checksum: 6a73ee8e82058acb673cea32eee2b643 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os objetivos do estudo foram determinar a prevalência da infecção congênita por citomegalovírus em recém-nascidos internados na unidade de internação neonatal do CAISM-UNICAMP, avaliar a eficácia da Nested-PCR para citomegalovírus em sangue estocado em papel filtro e descrever variáveis epidemiológicas da população estudada. Foi realizado um estudo epidemiológico transversal, onde foram selecionados recém-nascidos internados na unidade de internação neonatal durante o período de 01 de Abril de 2005 a 30 de Junho de 2006. Foram coletadas amostras de urina dos recém-nascidos e calculada a prevalência da infecção congênita por CMV pelo método diagnóstico da Nested PCR. Para validação do teste diagnóstico, foram coletados, concomitantemente com a urina, amostras de sangue dos recém-nascidos, estocados em papel filtro, e realizada a Nested-PCR. Os resultados da Nested-PCR em papel filtro foram comparados com os da urina e foram calculados sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo. Dados epidemiológicos da população foram colhidos pela revisão de prontuários. Foram obtidos os seguintes resultados: sensibilidade 75% , especificidade 99,4%, valores preditivos positivo 60,0% e negativo 99,7%. A prevalência da infecção congênita por CMV foi de 1,2%. A média de idade materna foi de 25,5 anos. A maior parte das mães, 40,9%, foram procedentes de Campinas; 86,3% delas realizaram pré-natal, 96,2% das que realizaram o pré-natal não realizaram sorologia para CMV, 65,3% dos partos foram por cirurgia cesariana, sendo que em 46% das cesáreas a indicação foi sofrimento fetal agudo. Sobre os recém-nascidos, 74,3% deles eram pré-termos, 57% pesavam menos que 2 kg, sendo a média de idade gestacional de 34,2 semanas. Concluimos que a prevalência da infecção congênita foi baixa e que o método diagnóstico Nested-PCR em sangue estocado em papel filtro teve alta especificidade e moderada sensibilidade / Abstract: The aims of this study were: to determine the prevalence of congenital infection by cytomegalovirus in newborn patients of the intensive neonatal care unit of the CAISM-UNICAMP Hospital; to evaluate the efficacy of Nested PCR diagnostic test in blood stored on filter paper and to describe epidemiological characteristics of this population. A cross section study was made including newborns admitted in the intensive care unit from April first, 2005 to June 30, 2006. Urine samples were collected from newborns and the prevalence was determined by Nested-PCR. To evaluate the efficacy of Nested PCR in blood stored on filter paper, the Nested-PCR in urine samples were compared to those in blood samples. Sensibility, specificity, positive and negative predictive values were calculated. Epidemiological characteristics of the population were described. The following results were observed: sensibility: 75%; specificity: 99, 4%; positive predictive values: 60, 0% and negative predictive values: 99,7%. The prevalence of congenital cytomegalovirus infection, calculated by Nested-PCR in urine samples was 1,2% in this period. The average of mother age was 25,5 years old.The most of mothers (40,9%) were from Campinas; 86,3% of them had prenatal care; 96,2% of the mothers who had prenatal care didn¿t had CMV serology; 65,3% of the delivery were by caesarean, and the reason of caesarean was acute fetal suffering in 46%. The newborn characters were: 74,3% were premature babies, 57% had weight less than 2 kilograms and the average of birth age was 34,2 weeks. We concluded that the prevalence of the congenital infection by CMV was low and that Nested PCR diagnostic test in blood stored on filter paper is highly specific and moderately sensible / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente