Os membros da sub-famíla Toxoplasmatinae conhecidos são Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora hughesi, Neospora caninum e Hammondia heydorni. As duas primeiras espécies têm os felídeos como hospedeiro definitivo, enquanto as duas últimas têm desenvolvimento sexual em carnívoros da família dos canídeos. O ciclo biológico de N. hughesi é pouco conhecido. Foi estudado a variabilidade nucleotídica de seqüências intercaladas entre os genes codificadores das frações ribossômicas 18S, 5.8S (ITS-1). No entanto, como estas não permitem reconstruções filogenéticas com o uso de grupo externo, em virtude da inconsistência dos alinhamentos produzidos, pesquisamos uma seqüência codificadora de proteína sendo o marcador escolhido, o gene codificador da proteína de choque térmico HSP70 (heat shock protein 70KDa). Este gene é bastante utilizado para resolução de filogenias de outros organismos como, por exemplo, aqueles pertencentes ao gênero Cryptosporidium. No presente trabalho, amplificamos por PCR e seqüenciamos 951 pares de bases (pb) do gene codificador de HSP70 de oocistos T. gondii-like (oriundos de fezes gatos), de oocistos Neospora-like (de fezes de cães) e de taquizoitos de N. caninum, N. hughesi e T. gondii mantidos em laboratório. Os primers foram desenhados a partir de seqüências consenso obtidas em pesquisa de bancos de dados de seqüências EST de N. caninum e seqüências de RNAm de T. gondii. Seqüências ITS-1 destes oocistos também foram determinadas para a confirmação da espécie de parasito estudada. Os resultados mostram que os táxons H. hammondi e T. gondii são monofiléticos e geneticamente muito próximos, mas contrariando resultados anteriores, não foi demonstrada a monofilia entre os táxons H. heydorni e N. caninum. De fato, a análise de diversidade nucleotídica de gene codificador HSP70 mostra que a distância evolutiva entre H. heydorni e N. caninum é tão grande quanto a distância de cada uma destas espécies com T. gondii. Em adição, foi possível identificar dentre as amostras de oocistos, duas linhagens divergentes de H. heydorni. Paralelamente ao estudo filogenético também foi possível desenvolver um método diagnostico diferencial para oocistos tipo Hammondia. As seqüências de gene HSP70 obtidas foram alinhadas e dois pares de primers internos a estas seqüências foram desenhados. O primeiro par amplifica 771 pb de oocistos T. gondii-like e o segundo 400 pb de oocistos Neospora-like. A clivagem do fragmento de 771 pb com enzima de restrição Hin6I produz perfis eletroforéticos distintos para amostras de T. gondii e H. hammondi. A clivagem do fragmento de 400pb com a enzima de restrição MunI também produz perfis eletroforéticos distintos entre amostras de N. caninum e H. heydornii. A diferenciação dos perfis de restrição pode ser feita em eletroforese em gel de agarose a 2,5%. / Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora huguesi, Neospora caninum and Hammondia heydorni are the known members of the sub-family Toxoplasmatinae. H. heydorni and N. caninum use canids as definitive hosts whereas felids are the definitive hosts from T. gondii and H. hammondi. The definitive host of N. hughesi is unknown. Here, the nucleotide diversity at internal transcribed spacer (ITS-1) and heat shock protein (HSP70 kDa) loci in the subfamily toxoplasmatinae were studied. The HSP70 coding genes are widely used for phylogenetic studies in a number of other organisms specially within the genus Cryptosporidium. In the present study, it was amplified by PCR and sequenced 951 bases pairs (bp) from HSP70 coding gene from oocysts T.gondii-like (from cat), from oocysts N. caninum-like (from dog) and tachyzoites of N. hughesi grown on cell cultures. The primers were designed based on consensus sequences within EST sequences of N. caninum sequences and RNAm sequences of T. gondii. ITS-1 sequences amplified from oocysts were also obtained in order to confirm the species of the parasites. The results showed that T. gondii and H. hammondi are monophyletic and genetically very close, but the monophyletic status of H. heydorni N. caninum was not demonstrated. In fact, the nucleotide diversity at the HSP70 locus has shown that the evolutionary distance between H. heydorni and N. caninum is as high as that observed between either H. heydorni or N. caninum and T. gondii., In addition, it was possible to identify two distinct groups among the H. heydorni oocysts. Concomitantly to the phylogenetic study it was also possible to standardize a diagnostic test capable of differentiate the oocysts Hammondia-like was development a diagnostic method that differ oocysts T. gondii-like and N. caninum-like. The sequences obtained from HSP70 coding gene were aligned and two new pair of PCR primers was designed. The first pair amplifies 771bp from T. gondii-like oocysts, whereas the second pair amplifies 400 bp from N. caninum-like oocysts. The restriction enzyme Hin6I used to cleave the 771 bp amplicons generated distinct profiles with samples from H. hammondi and T. gondii. The same occurred with the restriction of the fragments of 400bp cleaved by the enzyme MunI used in N. caninum e H. heydorni samples. The profiles can be differentiated by 2.5% agarose gel electrophoresis.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Over the past few years, the involvement between oral pathogens and vascular disease has been investigated, with growing attention to the pathogenesis and progression of atherosclerosis. Oral bacteria have been detected in atherosclerotic plaques at a variable frequency; however, the connection between oral health and vascular and oral bacterial profiles of these patients is not clearly established. The aim of this study was to evaluate the presence of oral bacteria DNA in the mouth and atherosclerotic plaques, in addition to assess the patientâs caries and periodontal disease history. Thirty samples of supragingival and subgingival plaque, saliva and atherosclerotic plaques of 13 patients with carotid stenosis or aortic aneurysm were evaluated, through Real Time Polymerase Chain Reaction, for the presence/absence of Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola. For edentulous patients, the variables of supragingival and subgingival plaques were not considered. All patients were submitted to oral exams using the DMTF (decayed, missing and filled teeth) and PSR (Periodontal Screening and Recording) indexes for dental and periodontal evaluation, respectively, and histopathological analysis of the atherosclerotic plaques was performed. Most of the patients were edentulous (76.9%). Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola were detected in 100.0%, 92.0%, 15.3% and 30.7% of the oral samples, respectively. Streptococcus mutans was the most prevalent targeted bacteria in atherosclerotic plaques (p<0,05), detected in 100% of the samples, followed by Prevotella intermedia (7.1%), and the vascular samples were negative for Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola. There was a statistically significant difference (p<0,05) between the presence of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in the oral cavity and vascular samples. In conclusion, Streptococcus mutans was found at a high frequency in oral and vascular samples, even in edentulous patients, and its presence in atherosclerotic plaques suggests the possible involvement of this bacteria with the disease progression. / Nos Ãltimos anos, a relaÃÃo entre patÃgenos orais e doenÃa vascular tem sido investigada, com crescente atenÃÃo para a etiopatogÃnese e progressÃo da aterosclerose. BactÃrias orais tÃm sido detectadas em placas aterosclerÃticas, com variÃvel frequÃncia, porÃm, a relaÃÃo entre saÃde bucal e perfis bacterianos vasculares e orais dos pacientes nÃo està claramente estabelecida. Foi objetivo deste estudo avaliar a presenÃa de DNA de bactÃrias orais na boca e placas aterosclerÃticas, alÃm de avaliar histÃrico de cÃrie e doenÃa periodontal dos pacientes. Trinta amostras de placa dental supragengival, subgengival, saliva, e placas aterosclerÃticas de 13 pacientes com estenose de carÃtida ou aneurisma de aorta foram avaliadas, atravÃs de ReaÃÃo em Cadeia da Polimerase em Tempo Real, para presenÃa/ausÃncia de Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola. Para pacientes desdentados totais, nÃo foram consideradas as variÃveis de placa supragengival e subgengival. Todos os pacientes foram submetidos a exames de CPO-D (dentes permanentes cariados, perdidos e obturados) e PSR (registro periodontal simplificado) para avaliaÃÃo dentÃria e periodontal, respectivamente, bem como anÃlise histopatolÃgica das placas aterosclerÃticas. A maioria dos pacientes eram edÃntulos (76,9%). Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola foram detectados em 100,0%, 92,0%, 15,3% e 30,7% das amostras orais, respectivamente. O micro-organismo mais prevalente em placas aterosclerÃticas foi o Streptococcus mutans (p<0,05), presente em 100,0% das amostras, seguido de Prevotella intermedia (7,1%), e as amostras vasculares foram negativas para Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola. Observou-se diferenÃa estatisticamente significante (p<0,05) com relaÃÃo à presenÃa de Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola em cavidade oral e amostra vascular. Em conclusÃo, Streptococcus mutans foi encontrado em alta frequÃncia em amostras orais e vasculares, mesmo de pacientes desdentados, e sua presenÃa em placas aterosclerÃticas sugere o possÃvel envolvimento desse patÃgeno na progressÃo da doenÃa.

O objetivo deste estudo foi avaliar a plataforma OpenArray para testes genéticos em doadores de sangue e determinar as frequências genotípicas e alélicas de alterações pontuais (SNPs) associadas à trombose venosa (G1691A e G20210A), à hiperhomocisteinemia (C677T, A1298C), e à hemocromatose hereditária (C282Y, H63D e S65C) na população de doadores de sangue de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de outubro a novembro de 2011. A detecção dos SNPs foi realizada utilizando a tecnologia de microarray em superfície sólida OpenArray. As amostras também foram analisadas utilizando a técnica de PCR em Tempo Real sistema FRET para comparação dos resultados e determinação da acurácia do sistema OpenArray. Observamos que houve 100% de concordância de resultados entre ambas as técnicas para todas as amostras, em todas as variantes pesquisadas, com exceção da mutação C282Y no gene HFE, a qual apresentou 99,75% de concordância. O resultado da amostra em questão foi posteriormente confirmado por sequenciamento direto (Sanger), que confirmou o resultado fornecido pelo método OpenArray. As frequências calculadas para cada SNP foram: FV G1691A 98,8% (G/G), 1,2% (G/A); FII G2021A 99,5% (G/G), 0,5% (G/A); MTHFR C677T 45,5% (C/C), 44,8% (C/T), 9,8% (T/T); MTHFR A1298C 60,3% (A/A), 33,6% (A/C), 6,1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78,1%(C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/A), 1,9% (A/T). Esses resultados descrevem as frequências de SNPs associados a doenças e são importantes para aprimorar o conhecimento atual do perfil genético da população de doadores de sangue brasileiros, embora um estudo maior seja necessário para determinar com a maior acurácia a frequência das mutações pesquisadas. Além disso, observamos que a plataforma OpenArray, demonstrou alta taxa de concordância com o método de PCR em Tempo Real sistema FRET. / The aim of this study was to evaluate the OpenArray platform for genetic testing of blood donors and to assess the genotype frequencies of nucleotide-polymorphisms (SNPs) associated with venous thrombosis (G1691A and G20210A), hyperhomocysteinemia (C677T, A1298C), and hereditary hemochromatosis (C282Y, H63D and S65C) in blood donors from Sao Paulo, Brazil. We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. The blood samples were also examined using a real-time PCR-FRET system to compare the results and determine the accuracy of the OpenArray method. We observed 100% agreement in all assays tested, except HFE C282Y, which showed 99.75% agreement. The HFE C282Y assay was further confirmed through direct sequencing, and the results showed that OpenArray analysis was accurate. The calculated frequencies of each SNP were FV G1691A 98.8% (G/G), 1.2% (G/A); FII G2021A 99.5% (G/G), 0.5% (G/A); MTHFR C677T 45.5% (C/C), 44.8% (C/T), 9.8% (T/T); MTHFR A1298C 60.3% (A/A), 33.6% (A/C), 6.1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78.1%(C/C), 20.3% (C/G), 1.6% (G/G); and HFE S65C 98.1% (A/A), 1.9% (A/T).Taken together, these results describe the frequencies of SNPs associated with diseases and are important to enhance our current knowledge of the genetic profiles of Brazilian blood donors, although a larger study is needed for a more accurate determination of the frequency of the alleles. Furthermore, the OpenArray platform showed a high concordance rate with standard FRET RT-PCR

Orientador: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:13:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bitu_CarolinaCavalcante_M.pdf: 2697106 bytes, checksum: fa0aa1863121c0b931af7b4d2def776b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Genes homeobox, especialmente os da família HOX, exercem um papel importante no desenvolvimento por meio de um intenso controle da proliferação, diferenciação e morte celular. Os genes HOX também estão relacionados com o surgimento de diferentes tipos de neoplasias, incluindo os cânceres de próstata, ovário, rim, pulmão, pele e leucemias, sendo pouco estudados em câncer oral. O objetivo deste estudo foi quantificar os genes da família HOX, especificamente dos loci A e D, que são expressos em amostras orais de mucosa normal e carcinoma espinocelular (CEC) por meio de ensaios semi-quantitativos de transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) ¿duplex¿. Pares de amostras orais de mucosa normal e CEC do mesmo paciente e amostras de mucosa oral normal de indivíduos sem história de tabagismo ou alcoolismo foram utilizadas para este propósito. Adicionalmente, nós avaliamos o perfil de expressão destes genes em linhagens celulares de queratinócitos normais e CEC oral. Nossos resultados demonstraram que os membros HOXA1, HOXA3, HOXA4, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD1 e HOXD13 foram expressos em níveis elevados nas linhagens de CEC oral quando comparado com a linhagem de queratinócito normal. Os membros HOXA3, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD3, HOXD4 e HOXD12 não foram expressos por nenhuma das amostras de mucosa oral normal provenientes de pacientes não associados a fatores de risco para o CEC oral, enquanto que apenas o membro HOXD12 não foi expresso pelas amostras de mucosa morfologicamente normal proveniente de pacientes portadores de CEC. Comparado às amostras de mucosa normal proveniente de pacientes com e sem fator de risco para CEC oral, nós observamos que as expressões de HOXA1, HOXA2 e HOXD8 foram estatisticamente maiores nas amostras oriundas de indivíduos com história de tabagismo e etilismo. A expressão dos genes HOXA4, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXD9, HOXD10, HOXD11 e HOXD13 foi significantemente maior nas amostras de CEC oral comparado com mucosa normal, independente da associação com fatores de risco. Interessantemente, os membros HOXA6 e HOXA9 não foram expressos por nenhuma das amostras deste estudo. Estes resultados sugerem que uma expressão desregulada dos membros da família HOX de genes homeobox dos loci A e D foi identificada no desenvolvimento e/ou progressão do CEC oral. / Abstract: Homeobox genes, specifically the HOX family, play an important role in the development by controlling cellular proliferation, differentiation and apoptosis. Expression of HOX genes is associated with many cancers including those of the prostate, ovary, kidney, lung, skin and leukemia, but still there is little understanding of their roles in oral cancer. The aim of this study was to quantify the HOX genes from loci A and D expressed in oral samples from normal mucosa and squamous cell carcinoma (SCC) by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) duplex method. Normal oral mucosa and oral SCC obtained from the same patient, and normal oral mucosa from patients without history of exposition to risk factors related to oral SCC (smoking habit and alcohol consumption) were included in this study. Additionally, we analyzed the expression profile of those genes in normal keratinocyte and oral SCC cell lines. Our results demonstrated that HOXA1, HOXA3, HOXA4, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD1 and HOXD13 were expressed in higher levels in oral SCC cell lines compared with normal keratinocyte cell line. None of the normal oral mucosa samples from patients without risk factors related to oral SCC expressed HOXA3, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD3, HOXD4 and HOXD12, whereas only HOXD12 was not expressed by the normal mucosa samples from patients with oral SCC. Comparing the two groups of normal oral mucosa, we found that HOXA1, HOXA2 and HOXD8 had statistically significant higher expression levels in samples from patients with history of smoking habit and alcohol consumption. The expression of HOXA4, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXD9, HOXD10, HOXD11 e HOXD13 was statistically higher in oral SCC samples when compared with those from normal oral mucosa, regardless of the risk factor association. Interestingly, HOXA6 and HOXA9 were not expressed by either the cell lines or tissue samples. The results of our study suggest that a dysregulated expression of specific members of the loci A and D of the HOX family of homeobox genes may be related to the tumorigenesis and/or tumor progression of oral SCCs. / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia

Introdução: Dos arbovírus transmitidos no Brasil, os Flavivirus apresentam destaque por causarem o maior número de infecções e doenças no homem e pela gravidade das doenças que provocam. A cidade de São Paulo possui áreas verdes, representadas por parques municipais em que existem lagos, aves e mamíferos. Esses locais são frequentados pela população e podem servir de refúgio para mosquitos que infestam a área urbana. Alguns trabalhos revelam a ocorrência de espécies de mosquitos conhecidas como vetoras de Flavivirus em tal cidade, o que pode favorecer o aparecimento de casos e transmissão de doenças causadas por este tipo de vírus. No entanto, a presença de Flavivirus infectando tais artrópodes não é conhecida. Objetivo: Identificar presença de Flavivirus em mosquitos (Diptera: Culicidae) provenientes de áreas verdes da cidade de São Paulo. Método: Sete parques municipais localizados em diferentes regiões da cidade foram selecionados para o estudo. Foram realizadas coletas de mosquitos mensais em cada parque no período de março de 2011 e fevereiro de 2012. As armadilhas utilizadas foram: aspirador, Shannon e CDC-CO2. Os mosquitos foram transportados para o laboratório em gelo seco, identificados em mesa fria e agrupados em \"pools\" de até 10 fêmeas não ingurgitadas, segundo espécie, data e local de coleta. Fêmeas ingurgitadas foram armazenadas individualmente. As amostras foram submetidas à extração de ácidos nucleicos, seguida de RT-PCR em tempo real para amplificação de fragmento de aproximadamente 200pb do gene NS5 de Flavivirus. Amostras positivas foram encaminhadas para sequenciamento e análises filogenéticas. Resultados: Dentre as 5.213 fêmeas não ingurgitadas (818 pools) e as 778 fêmeas ingurgitadas coletadas, ocorreu presença de onze gêneros de Culicídeos, sendo mais frequentes Culex e Aedes. Dezenove pools de fêmeas não ingurgitadas obtiveram resultado positivo para Flavivirus. Análises filogenéticas mostraram presença de RNA relacionado à Aedes flavivirus (AEFV) em dois pools de Aedes e à Culex flavivirus (CxFV) nos demais pools, todos de Culex. Conclusões: CxFV e AEFV estão presentes em mosquitos dos gêneros Culex e Aedes, respectivamente, coletados em parques municipais da cidade de São Paulo. Embora flavivírus patogênicos ao homem não tenham sido encontrados no presente trabalho, recomenda-se vigilância de flavivírus nas áreas estudas, visto que elas possuem presença de mosquitos vetores e hospedeiros vertebrados, ou seja, elementos necessários para a transmissão destes vírus. / Introduction: Among the arboviruses transmitted in Brazil, Flavivirus are noteworthy once they cause the largest number of infections and diseases in humans and also because they can cause serious illnesses. In the city of São Paulo there are green spaces, represented by city parks in which lakes, birds and mammals are found. The population visits those places, which can also be a refuge for mosquitoes that infect the urban area. Some studies reveal the occurrence of mosquitoes species known to be vectors of Flavivirus in this city, what can contribute to the emergence of cases and transmission of diseases caused by this kind of virus. However, the presence of Flavivirus infecting those arthropods is not known. Objective: To Identify infection by Flavivirus in mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in São Paulo\'s city parks. Method: Seven city parks located in different places of the city were selected for the study. Monthly mosquito collections were carried out in each park from March 2011 to February 2012. The traps employed were aspirator, Shannon and CDC-CO2. The mosquitoes were transported to the laboratory on dry ice. Identification was performed in a chill table. Up to 10 non-engorged females were pooled according to specie, date and place of collection. Engorged females were stored individually. Nucleic acids were extracted and submitted to real time RT-PCR that amplifies a 200pb fragment of NS5 gene of Flavivirus. Positive samples were sequenced and phylogenetic analyses were performed. Results: Eleven genus of Culicidae were found among the 5,213 non engorged females (818 pools) and the 778 engorged females. Culex and Aedes were the most frequent collected genus. Nineteen non engorged female pools had positive results for the presence of Flavivirus RNA. Phylogenetic analyses showed the RNA found was related to Aedes flavivirus (AEFV) in two pools of Aedes and to Culex flavivirus (CxFV) in the other pools, all of them consisting of Culex. Conclusion: CxFV and AEFV are present in mosquitoes Culex and Aedes, respectively, collected in São Paulo\'s city parks. Flavivirus of medical importance were not detected. Although, once there are species of mosquitoes that can act as vectors of pathogenic Flavivirus and vertebrate hosts, which are required for the transmission cycle of those virus, surveillance is recommended in the studied areas.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

Strongyloides venezuelensis é um parasita intestinal de ratos frequentemente utilizado como modelo para o estudo da estrongiloidíase humana e animal. O objetivo deste estudo foi comparar os métodos parasitológicos, sorológico e molecular no diagnóstico da infecção experimental por S. venezuelensis em ratos (Rattus norvegicus). Amostras de fezes e soro foram colhidas e analisadas até o 60º dia pós-infecção (d.p.i.). Os métodos parasitológicos (contagem de ovos por gramas de fezes e cultura em carvão) foram positivos do 5º ao 45º d.p.i. Utilizando o teste sorológico (imunoenzimático, ELISA), os níveis séricos de anticorpos IgG aumentaram até o 28º d.p.i., e posteriormente reduziram até o 60º d.p.i. A reação em cadeia da polimerase (PCR) detectou DNA específico de S. venezuelensis nas amostras de fezes do 5º até 21º d.p.i. e do 2º até o 8º d.p.i. nas amostras de soro. Conclui-se que a detecção de DNA de S. venezuelensis, a partir de amostras de soro, é uma ferramenta diagnóstica promissora. Portanto, o presente estudo apresenta uma importante contribuição na melhoria do diagnóstico da estrongiloidíase experimental. / Strongyloides venezuelensis is an intestinal parasite of rats frequently used as a model for studying animal and human strongyloidiasis. The aim of this study was to evaluate the parasitological, serological and molecular methods for the diagnosis of experimental S. venezuelensis in rats (Rattus norvegicus). Stool and serum samples were collected and analyzed up to 60 days post-infection (d.p.i.). The parasitological methods (eggs per gram of feces and charcoal culture) were positive from 5 to 45 d.p.i. Using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) serum levels of IgG antibodies increased up to 28 d.p.i. and thereafter decreasing by 60 d.p.i. Polymerase chain reaction (PCR) assays detected S. venezuelensis DNA in stool samples of rats from 5 to 21 d.p.i. and in serum samples from 2 to 8 d.p.i. In conclusion, detection of S. venezuelensis DNA from serum samples is a promising diagnostic tool. The present study presents an important contribution to improve the diagnosis of experimental strongyloidiasis.

Os antígenos plaquetários humanos são estruturas imunogênicas resultantes de alterações pontuais (SNP) que levam a substituição de um aminoácido a nível proteico. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência alélica e genotípica do sistema HPA-1 a -5 e -15 em doadores de plaquetas do Estado do RS e comparar as frequências alélicas encontradas com as observadas em outras populações. A genotipagem HPA foi realizada através do método de PCR-SSP. Um total de 201 doadores de plaquetas foram incluídos no estudo sendo 167 caucasoides e 34 não caucasoides. O alelo “a” foi o mais frequente nos sistemas HPA-1 a -5 em ambos grupos. O genótipo HPA-15AB foi predominante sobre os genótipos homozigotos para este sistema. O teste exato de Fisher revelou diferença estatisticamente significativa para o sistema HPA-5. Houve maior prevalência do alelo HPA-5B no grupo não caucasoide. Para o grupo caucasoide, o método de neighbor-joining e a PCA revelaram proximidade genética entre este grupo e as populações europeias. De um modo geral, concluímos que as frequências alélicas para os sistemas HPA-1 a -5 e -15 encontradas em nosso grupo caucasoide são similares às descritas em populações europeias. Estes dados corroboram a formação étnica da população do RS. A maior frequência do alelo HPA-5b encontrada no grupo não caucasoide de nosso estudo indica a possibilidade de alosensibilização para pacientes que recebem transfusões de plaquetas não compatibilizadas geneticamente. / Human platelet antigens are immunogenic structures that result from single nucleotide polymorphisms (SNPs) leading to single amino acid substitutions. The present study sought to determine the allele and genotype frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 in platelet donors from the state of Rio Grande do Sul, Brazil, and compare their allele frequencies to those observed in other populations. HPA genotyping was performed via the single specific primer-polymerase chain reaction (PCR-SSP) method. The study sample comprised 201 platelet donors (167 Caucasians and 34 non-Caucasians). Allele “a” was that most commonly found for HPA-1 through 5 in both groups. The HPA-15AB genotype predominated over homozygous genotypes of this system. Fisher’s exact test revealed statistically significant differences for the HPA-5 system, with a greater prevalence of the HPA- 5B allele in non-Caucasians. The neighbor-joining method and principal components analysis (PCA) revealed genetic proximity between the Caucasian group and European populations. We conclude that the allele frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 found in our Caucasian sample are similar to those reported for European populations. These findings corroborate the ethnic makeup of the population of Rio Grande do Sul. The higher frequency of the HPA-5b allele found in the non-Caucasian group of our sample suggests the possibility of allosensitization in patients who receive platelet transfusions from genetically incompatible donors.

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albuquerque_DulcineiaMartinsde_M.pdf: 5471882 bytes, checksum: d76b070e587d57837f8b747721f15926 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O Citomegalovírus Humano (HCMV) é um dos mais importantes agentes infecciosos que acometem pacientes imunocomprometidos, causando significante morbidade e mortalidade nesse grupo. A detecção do genoma do HCMV pela PCR (Reação em cadeia da polimerase) é específica e sensível e pode servir como uma poderosa ferramenta para o diagnóstico precoce da infecção causada por esse vírus. Variações em regiões funcionalmente relevantes do genoma do HCMV têm sido usadas como marcadores' genéticos em numerosos estudos clínicos para diferenciar as linhagens e associá-las a pato gênese viral e manifestação clínica no paciente. As glicoproteínas do envelope do citomegalovírus são provavelmente essenciais para a entrada e disseminação viral nas células hospedeiras; são também imp9rtantes alvos da resposta imune humana que induz a formação de anticorpos de neutralização do vírus. A PCR, combinada com análise de restrição de regiões polimórficas de produtos amplificados (PCR-RFLP), é eficaz para identificação dos genotipos de HCMV, sendo possível a distinção de pelo menos 4 padrões eletroforéticos. Por outro lado, a determinação da carga viral em pacientes comprometidos imunologicamente, tem sido associada como marcador ou preditor para o desenvolvimento de doença órgão-específica pelo HCMV, sendo de fundamental importância para a monitorização da terapêutica. Além disso, o valor da carga viral está relacionado com o grupo de paciente e/ou tipo de transplante, pato gênese do HCMV e níveis de imunossupressão e pode indicar o inicio da terapia antiviral. Sabendo-se da importância da identificação das linhagens de HCMV em pacientes imunocomprometidos, sua possível relação com a infectividade e apresentação clínica, e a relevância da determinação da carga viral nos diversos grupos, este trabalho, avaliando diferentes populações imunologicamente comprometidas atendidas no HC-UNICAMP, teve como objetivos principais: determinar a prevalência dos genotipos de HCMV e avaliar uma possível associação do subtipo com IV o quadro clínico apresentado pelos diferentes grupos estudados; padronizar métodos de determinação da carga viral com a finalidade de avaliar a aplicabilidade no monitoramento da terapia antiviral e como valor preditivo de doença pelo HCMV. Para a genotipagem, 122 amostras clínicas (sangue e urina) de 104 pacientes foram avaliadas retrospectivamente. Os grupos de pacientes, infectados pelo HCMV, eram basicamente os seguintes: recém-nascidos com infecção congênita, transplantados de medula óssea, transplantados hepáticos e renais, e portadores do HIV. Os resultados foram analisados estatisticamente. Para a quantificação, foram avaliadas 2 metodologias: uma baseada no princípio de captura híbrida onde foram analisadas 93 amostras e a outra PCR diluição limitante, alguns exemplares foram avaliados, já que a qualidade do DNA é fundamental para o prosseguimento da metodologia. Como resultados, pudemos caracterizar em nosso grupo de pacientes, os 4 genotipos descritos em literatura. Observamos a maior prevalência do genotipo gB2, embora os subtipos gBI e gB3 estivessem bem representados. Dados estatísticos não comprovaram a associação de uma determinada linhagem do vírus com a gravidade da manifestação clínica, bem como um grupo específico de pacientes. As metodologias de quantificação avaliadas possuem alta sensibilidade e especificidade, compatíveis com a Antigenemia. A principal vantagem das metodologias em relação à essa última, é em relação ao processamento da amostra, que não necessita ser imediata à coleta pois não dependem da viabilidade do vírus. Enfim, acreditamos que a determinação da linhagem do HCMV e da carga viral sejam metodologias complementares e de fundamental importância no entendimento e monitoramento da infecção pelo HCMV em pacientes imunocomprometidos / Abstract: Human Cytomegalovirus (HCMV) is one of the most important infectious agents that attack immunocompromised patients causing significant morbidity and mortality in this group. The detection of the HCMV genome by the PCR (polymerase Chain Reaction) is specific and sensitive; and it can be used as a powerful tool for the early diagnoses of the infection caused by this virus. Variations in functionally relevant areas of the HCMV genome have been used as genetic markers in numerous clinical studies to differentiate the strains and to associate them with the viral pathogenesis and the clinical manifestation in the patient. The glycoproteins of the envelope of the human cytomegalovirus are probably essential to the entrance and the viral dissemination in the host cells; they are also important targets of the human immune response that induce the formation of the antibodies of the virus neutrality. The PCR, combined with the analysis of restriction of the polymorphic areas of the amplified products (PCR-RFLP), is elective for the identification of the HCMV genotypes, becoming possible the distinction ofat least 4 (four) electrophoretic pattems. On the other hand, the determination of the viralload in patients immunologically atlected has been associated as marker or predictor for the development of the organ specific disease by the HCMV, being of fundamental importance to the management of the therapy. Besides, the value of the viral load is related to the group of patients and/or the type of transplant, the pathogenesis of the HCMV, and the levels of the immune-suppression; and it can indicate the beginning of the antiviral therapy. Knowing the importance of the identification of the strains of the HCMV in immunocompromised patients, its possible relation with the infection and clinical presentation, and the relevance of the determination of the viral load in several groups, this study, evaluating different immunocompromised people followed at HC-UNICAMP, had as main targets: to determine the prevalence of the HCMV genotypes and evaluate a possible association of the subtype with the clinical table presented by different groups studied; standardize determination methods of the viral load with the finality of evaluating the applicability in the management of the antiviral therapy, and as predictable value of the disease by the HCMV. A hundred and twenty-two (122) clinical samples (blood and urine) of 104 patients were evaluated retrospectively to the genotipage. The groups of HCMV infected patients were basically the following: newborn children with congenital infection, bone marrow transplanted patients, hepatic and renal transplanted patients, and HIV infected individuals. The results were statistically analyzed. Two methodologies were evaluated for the quantification: one based on the principle of the hybrid capture, where 93 samples were analyzed; and another one on the PCR limiting dilution, where some exemplars were. evaluated, since the quality of the DNA is fundamental to the continuation of the methodology. We could characterize, in our group of patients, the four genotypes described in literature as results. We observed the largest prevalence of the gB2 genotype, although the gB 1 and gB3 genotypes were well represented. Statistical data did not prove the association of a determined strain of the virus with the sevevity of the clinical manifestation, as well as a specific group of patients. The methodologies of quantification evaluated have high sensitivity and specificity, compatible with the Antigenemia. The main advantage of the methodologies regarding the former one is in relation to the processing of the sample that does not need to be just after the collection because it does not depend on the viability of the virus. inally, we believe that the determination of the HCMV strain and viral load are complementary methodologies and of fundamental importance for the understanding and management of the HCMV infection in immunocompromised patients. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Luis Otávio Zanatta Sarian / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paleari_RenataGasparotto_M.pdf: 1524393 bytes, checksum: 5d2b405ce97d9adb743a2ea6763aac00 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Objetivo: Avaliar a prevalência do polimorfismo C825T em mulheres com e sem câncer de mama e associá-lo ao índice de massa corpórea (IMC), ao risco individual para o câncer e características clínicas e reprodutivas. Sujeitos e métodos: Foram incluídas 134 mulheres com câncer de mama e um grupo controle de 129 de mulheres sem a doença. O grupo com câncer de mama respondeu a um questionário sobre estilo de vida, fatores reprodutivos e história familiar. Os dados clínicos do tumor também foram avaliados. A partir destes dados foi calculado o escore de risco individual para câncer de mama com o software IBIS Breast Cancer Risk Evaluation Tool. O DNA das pacientes foi extraído e realizada uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a detecção do polimorfismo C825T. A análise estatística foi realizada através do pacote R Environment, com intervalos de confiança de 95% e nível de significância de 5% (p<0,05). Resultados: A prevalência do genótipo TT se mostrou significativamente maior para as mulheres do grupo controle (30,2%) do que para as mulheres com câncer de mama (14,9%) (p=0,02). O SNP não esteve associado a características clínicas do tumor (tamanho p=0,91, grau histológico p=0,54, receptor de estrógeno p=0,73, receptor de progesterona p=0,46, HER-2 p=0,9, estado da axila p=0,29, estágio da doença p=0,41), a idade ao diagnóstico (p=0,07), idade da menarca (p=0,17) e idade da menopausa p=0,60). O genótipo TT não se mostrou em maior prevalência nas pacientes com alto IMC (p=0,98). O risco para o câncer não mostrou ter relação com a presença do polimorfismo (em 10 anos p=0,72 e durante toda a vida p=0,84). Conclusões: Coletivamente, os nossos dados indicam que o polimorfismo C825T, embora possivelmente associado a diversas vias metabólicas e carcinogênicas, não tem relação importante quer com o risco para o câncer de mama, quer com a apresentação das características da doença. Estes resultados expandem achados anteriores sobre a relação entre o polimorfismo C825T e o câncer de mama / Abstract: Objective: To evaluate the prevalence of the C825T polymorphism in women with and without breast cancer and associate it with the body mass index (BMI), the individual risk for cancer and clinical and reproductive characteristics. Subjects and methods: We included 134 women with breast cancer and a control group of 129 women without the disease. The group with breast cancer responded to a questionnaire on lifestyle, reproductive factors and family history. Clinical data of the tumor were also evaluated. From these data we calculated the score of individual risk for breast cancer with the software IBIS Breast Cancer Risk Evaluation Tool. The DNA was extracted from patients and performed a Polymerase Chain Reaction (PCR) for detection of the C825T polymorphism. Statistical analysis was performed using the package R Environment, with intervals of 95% and a significance level of 5% (p<0.05). Results: The prevalence of TT genotype was significantly greater for women in the control group (30.2%) than for women with breast cancer (14.9%) (p=0.02). The SNP was not associated with clinical features of the tumor (size p=0.91, histologic grade p=0.54, estrogen receptor p=0.73, progesterone receptor p=0.46, HER-2 p=0.90, status of the axilla p=0.29, stage of disease p=0.41), age at diagnosis (p=0.07), age at menarche (p=0.17) and age at menopause (p=0.60). The TT genotype was not at a higher prevalence in patients with high BMI (p=0.98). The risk for cancer showed no correlation with the presence of the polymorphism (in 10 years p=0.72 and for life p=0.84). Conclusions: Collectively, our data indicate that the C825T polymorphism, although possibly associated with various metabolic pathways and carcinogenetics, has no significant relationship with either the risk for breast cancer, or with the presentation of the characteristics of the disease. These findings expand previous findings on the relationship between the C825T polymorphism and breast cancer / Mestrado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Mestre em Ciências da Saúde