Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo68_1.pdf: 787941 bytes, checksum: b2a3fbfd839f7bc4c7e54c63ad2b5596 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A erliquiose é uma hemoparasitose distribuída mundialmente causada, geralmente, pela proteobactéria intracelular, Ehrlichia. spp, que infecta leucócitos e plaquetas, formando corpúsculos de inclusão denominados de mórulas. A identificação das inclusões em exame direto de esfregaço sanguíneo tem baixa sensibilidade diagnóstica devido ao pequeno número de células parasitadas. O sangue é a principal fonte de DNA utilizada para a reação em cadeia pela polimerase (PCR), não havendo avaliação da eficiência de frações celulares sanguíneas no diagnóstico apesar do patógeno infectar mais de um tipo celular. Desta forma, este trabalho teve como objetivo determinar a eficiência do sangue e de suas frações como fonte de DNA para a nested PCR (nPCR), além de indicar a frequência dos agentes etiológicos implicados na erliquiose canina em duas localidades da região Nordeste do Brasil. A amostra de 22 cães com sintomatologia clínica sugestiva de erliquiose foi proveniente da rotina médica dos Hospitais Veterinários da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e do Centro Médico Dr. Leonardo Torres, localizados nos municípios de Recife (PE) e Patos (PB). O DNA foi extraído de sangue total (ST), mononucleares (M), granulócitos, papa leucocitária (PL) e coágulo sanguíneo (CS). Na pesquisa direta de hematozoários, 36,4% apresentavam mórulas sugestivas de E. spp. Pela nPCR, a ocorrência foi de 46,6% (7/15) para E. canis e de 6,6% (1/15) A. platys. Co-infecção com A. platys e E. canis foi evidenciada em um animal. DNA do patógeno foi amplificado em 71,4% (15/21) das amostras de sangue total, 1,78% (3/19) de granulócitos, 31,57% (6/19) de mononucleares e 30% (6/20) de papa leucocitária. A nPCR das amostras de ST não apresentou diferença estatisticamente significativa (p<0,05) quando comparada com as amostras de M, PL,G e CS, indicando ser o ST a melhor fonte de DNA para a identificação de Ehrlichia. Vale salientar que essa é a primeira evidência molecular do envolvimento de A. platys em infecção em cães no Estado da Paraíba

A Lawsonia intracellularis é uma bactéria intracelular obrigatória que causa Enterite Proliferativa em vários animais, como suínos, cervos, ratos, hamsters, cobaios, coelhos, ovinos, eqüinos, raposas, cães, furões, primatas não humanos, emas e avestruzes. Atualmente não há relatos da ocorrência do agente ou dos sinais clínicos de sua infecção em aves comerciais (Gallus gallus domesticus). O presente estudo reporta a detecção através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) de Lawsonia intracellularis em matrizes pesadas de diferentes idades provenientes de quatro linhagens de aves comerciais. Dentre os 100 suabes de fezes colhidos a partir de fragmentos intestinais, 34% foram positivos para a detecção do agente pela PCR. O agente foi encontrado com maior freqüência em aves de 80 semanas de idade apresentando ou não quadro diarréico. Os fragmentos intestinais das aves cujas fezes foram positivas para detecção de Lawsonia intracellularis foram submetidos ao exame histopatológico e na maioria das lesões analisadas foi observada enterite necrótica crônica proliferativa. Apesar das lesões serem sugestivas de infecção por Lawsonia intracellularis pela coloração de Warthin-Starry, a presença do patógeno no interior dos enterócitos ou células glandulares não foi observada. Esses resultados poderiam levar a novas pesquisas sobre a importância da Lawsonia intacellularis na avicultura do Brasil e do mundo. / Lawsonia intracellularis is an obligate intracellular bacterium responsible for proliferative enteritis in many animals, such as swine, deers, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, ovine, horses, foxes, dogs, ferrets, no human primats, emus and ostrichs. Currently there is no reports about the occurrence of this agent or clinical signs of its infection in chickens (Gallus gallus domesticus). The present study reports the detection of Lawsonia intracellularis at different ages of broiler breeder in four avian commercials lineages by Polymerase Chain Reaction (PCR). Of 100 faecal swabs collected from intestinal fragments, 34% were positive for Lawsonia intracellularis detection by PCR. The agent was more frequently found in chickens of 80 weeks of age presenting or not diarrhea. The intestinal fragments which faeces were positive for Lawsonia intracellularis PCR detection were submitted to histopathological exam and in the most analysed lesions were observed proliferative necrotic cronic enteritis. Although the lesions were suggestive of L. intracellularis infection by Warthin-Starry staining, the presence of the pathogen inside of enterocytes or gland cells was not observed. This results could lead to new researches about the mean of Lawsonia intacellularis in broiler industry of Brazil and the world.

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

Os membros da sub-famíla Toxoplasmatinae conhecidos são Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora hughesi, Neospora caninum e Hammondia heydorni. As duas primeiras espécies têm os felídeos como hospedeiro definitivo, enquanto as duas últimas têm desenvolvimento sexual em carnívoros da família dos canídeos. O ciclo biológico de N. hughesi é pouco conhecido. Foi estudado a variabilidade nucleotídica de seqüências intercaladas entre os genes codificadores das frações ribossômicas 18S, 5.8S (ITS-1). No entanto, como estas não permitem reconstruções filogenéticas com o uso de grupo externo, em virtude da inconsistência dos alinhamentos produzidos, pesquisamos uma seqüência codificadora de proteína sendo o marcador escolhido, o gene codificador da proteína de choque térmico HSP70 (heat shock protein 70KDa). Este gene é bastante utilizado para resolução de filogenias de outros organismos como, por exemplo, aqueles pertencentes ao gênero Cryptosporidium. No presente trabalho, amplificamos por PCR e seqüenciamos 951 pares de bases (pb) do gene codificador de HSP70 de oocistos T. gondii-like (oriundos de fezes gatos), de oocistos Neospora-like (de fezes de cães) e de taquizoitos de N. caninum, N. hughesi e T. gondii mantidos em laboratório. Os primers foram desenhados a partir de seqüências consenso obtidas em pesquisa de bancos de dados de seqüências EST de N. caninum e seqüências de RNAm de T. gondii. Seqüências ITS-1 destes oocistos também foram determinadas para a confirmação da espécie de parasito estudada. Os resultados mostram que os táxons H. hammondi e T. gondii são monofiléticos e geneticamente muito próximos, mas contrariando resultados anteriores, não foi demonstrada a monofilia entre os táxons H. heydorni e N. caninum. De fato, a análise de diversidade nucleotídica de gene codificador HSP70 mostra que a distância evolutiva entre H. heydorni e N. caninum é tão grande quanto a distância de cada uma destas espécies com T. gondii. Em adição, foi possível identificar dentre as amostras de oocistos, duas linhagens divergentes de H. heydorni. Paralelamente ao estudo filogenético também foi possível desenvolver um método diagnostico diferencial para oocistos tipo Hammondia. As seqüências de gene HSP70 obtidas foram alinhadas e dois pares de primers internos a estas seqüências foram desenhados. O primeiro par amplifica 771 pb de oocistos T. gondii-like e o segundo 400 pb de oocistos Neospora-like. A clivagem do fragmento de 771 pb com enzima de restrição Hin6I produz perfis eletroforéticos distintos para amostras de T. gondii e H. hammondi. A clivagem do fragmento de 400pb com a enzima de restrição MunI também produz perfis eletroforéticos distintos entre amostras de N. caninum e H. heydornii. A diferenciação dos perfis de restrição pode ser feita em eletroforese em gel de agarose a 2,5%. / Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora huguesi, Neospora caninum and Hammondia heydorni are the known members of the sub-family Toxoplasmatinae. H. heydorni and N. caninum use canids as definitive hosts whereas felids are the definitive hosts from T. gondii and H. hammondi. The definitive host of N. hughesi is unknown. Here, the nucleotide diversity at internal transcribed spacer (ITS-1) and heat shock protein (HSP70 kDa) loci in the subfamily toxoplasmatinae were studied. The HSP70 coding genes are widely used for phylogenetic studies in a number of other organisms specially within the genus Cryptosporidium. In the present study, it was amplified by PCR and sequenced 951 bases pairs (bp) from HSP70 coding gene from oocysts T.gondii-like (from cat), from oocysts N. caninum-like (from dog) and tachyzoites of N. hughesi grown on cell cultures. The primers were designed based on consensus sequences within EST sequences of N. caninum sequences and RNAm sequences of T. gondii. ITS-1 sequences amplified from oocysts were also obtained in order to confirm the species of the parasites. The results showed that T. gondii and H. hammondi are monophyletic and genetically very close, but the monophyletic status of H. heydorni N. caninum was not demonstrated. In fact, the nucleotide diversity at the HSP70 locus has shown that the evolutionary distance between H. heydorni and N. caninum is as high as that observed between either H. heydorni or N. caninum and T. gondii., In addition, it was possible to identify two distinct groups among the H. heydorni oocysts. Concomitantly to the phylogenetic study it was also possible to standardize a diagnostic test capable of differentiate the oocysts Hammondia-like was development a diagnostic method that differ oocysts T. gondii-like and N. caninum-like. The sequences obtained from HSP70 coding gene were aligned and two new pair of PCR primers was designed. The first pair amplifies 771bp from T. gondii-like oocysts, whereas the second pair amplifies 400 bp from N. caninum-like oocysts. The restriction enzyme Hin6I used to cleave the 771 bp amplicons generated distinct profiles with samples from H. hammondi and T. gondii. The same occurred with the restriction of the fragments of 400bp cleaved by the enzyme MunI used in N. caninum e H. heydorni samples. The profiles can be differentiated by 2.5% agarose gel electrophoresis.

Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis are the causative agents of feline mycoplasmosis, these agents are gram-negative, pleomorphic, small and that adhere to the surface of erythrocytes of the animal involved. Clinical signs of feline mycoplasmosis are manifestations of acute or chronic anemia, occurring weight loss, anorexia, depression, pale mucous membranes, weakness, joint pain, soreness and occasionally splenomegaly and jaundice, the animal may come to death in severe cases. The diagnosis is based on detection of the parasite in blood smears and also in molecular diagnostics using PCR. Aiming to determine the occurrence of Mycoplasma spp. in domestic cats in a region of Belém, Pará, and hematological changes of animals naturally infected by these parasites were collected 201 blood samples with EDTA for Count Blood Cells (CBC) analysis and extraction of DNA for performing the Polymerase Chain Reaction (PCR) as well as blood smears ear tip for detection of the parasite on the surface of erythrocyte. Found 5.47% (11/201) of positive examination of blood smears, being 1.47% (1/68) of males and 7.51% (10/133) than females. The DNA of Candidatus Mycoplasma haemominutum was found in 7.96% (16/201) where 16.17 % (11/68) were males and 3.75% (5/133) females, was detected Mycoplasma haemofelis in 1.49% (3/201) of samples totaling 2.94% (2/68) of males and 0.75% (1/133) of females. The CBC showed changes in erythrocytes, hematocrit and hemoglobin only in those animals with DNA of Mycoplasma haemofelis. / Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis são os agentes causadores da micoplasmose felina, estes agentes são bactérias gram-negativas, pleomórficas, pequenas e que se aderem à superfície dos eritrócitos do animal acometido. Os sinais clínicos da micoplasmose felina são manifestações de anemia aguda ou crônica, ocorrendo perda de peso, anorexia, depressão, membranas mucosas pálidas, fraqueza, dores articulares, hiperestesia e, ocasionalmente esplenomegalia e icterícia, podendo o animal vir a óbito nos casos mais graves. O diagnóstico é baseado na detecção do parasita em esfregaços sanguíneos e também no diagnóstico molecular pela PCR. Objetivando determinar a ocorrência de Mycoplasma spp. em felinos domésticos da região de Belém-Pará, e as alterações hematológicas dos animais naturalmente infectados por estes parasitos, foram coletadas 201 amostras de sangue com EDTA para análise de hemograma e extração de DNA para realização de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) bem como esfregaços sanguíneos de ponta de orelha para detecção do parasita na superfície do eritrócito. Foram encontrados 5,47% (11/201) de positividade no exame de esfregaço sanguíneo, sendo 1,47% (1/68) de machos e 7,51% (10/133) de fêmeas. O DNA de Candidatus Mycoplasma haemominutum foi encontrado em 7,96% (16/201) dos animais onde 16,17% (11/68) eram machos e 3,75% (5/133) eram fêmeas, já Mycoplasma haemofelis foi detectado em 1,49% (3/201) das amostras, totalizando 2,94% (2/68) de machos e 0,75% (1/133) de fêmeas. O hemograma mostrou alterações em eritrócitos, volume globular e hemoglobina apenas nos animais em que foi detectado DNA de Mycoplasma haemofelis.

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca:Juliana Peloi Vides / Banca:Heito Flávio Ferrari / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca:Cáris Maroni Nunes / Resumo: O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium em amostras fecais de cães e gatos, bem como o desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para detecção específica de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. Trezentas amostras fecais de gatos e 367 amostras fecais de cães foram colhidas nas cidades de Araçatuba e Jaboticabal (SP) e submetidas aos processos de purificação e extração de DNA. "Nested" PCR (nPCR) para o gene 18S do rRNA foi realizada para identificação de Cryptosporidium spp., seguido de seqüenciamento dos fragmentos amplificados. Uma reação de PCR em tempo real para um fragmento parcial do gene HSP70 foi padronizada para a detecção de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. A positividade para Cryptosporidium spp. pela nPCR em amostras de gatos foi de 11,33% (34/300), e em amostras cães foi de 10,4% (38/367). A PCR em tempo real resultou em 15,3% (58/367) de amostras positivas para C. canis. Foi possível a identificação por meio de seqüenciamento de três amostras positivas para C. felis e seis amostras positivas para C. canis. Foi observada uma maior positividade em filhotes quando comparados a cães adultos. A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi de uma cópia de DNA de C. canis por reação e não foi observada amplificação inespecífica de DNA de outras espécies de Cryptosporidium. Conclui-se que cães e gatos das regiões estudad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:This study aimed the identification and molecular characterization of Cryptosporidium isolate s in stool samples from dogs and cats, as well as the development of a polymerase chain reaction (PCR) in real time to specific detection of Cryptosporidium canis in fecal samples from dogs. Three hundred fecal samples from cats and 367 fecal samples from dogs were collected in the cities of Araçatuba and Jaboticabal (SP) and subjected to the processes of purification and DNA extraction. Nested PCR (nPCR) for the 18S rRNA gene was performed for identification of Cryptosporidium spp., f ollowed by sequencing of the amplified fragments. A real time PCR to a partial fragment of the HSP70 gene was standardized for detection of Cryptosporidium canis in dogs fecal samples. The positivity for Cryptosporidium spp. by nPCR in cats samples was 11.33% (34/300), and in d og samples was 10.4% (38/367). The real - time PCR resulted in 15.3% (58/367) of samples positive for C. canis . The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of three samples positive for Cryptosporidium felis and six samples positive for C. canis . A higher positivity was observed in pup pie s and kittens when compared to adult animals . The analytical sensitivity of real - time PCR was 1 copy of DNA of C. canis and was not observed DNA amplification for other species of Cryptosporidium . We c oncluded that dogs and cats n of the investigated regions can present infected for zoonotic species of Cryptosporidium and the real - time PCR developed in this work is a sensitive and specific method for detection of C. canis in fecal samples from dogs / Doutor

Os membros da sub-famíla Toxoplasmatinae conhecidos são Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora hughesi, Neospora caninum e Hammondia heydorni. As duas primeiras espécies têm os felídeos como hospedeiro definitivo, enquanto as duas últimas têm desenvolvimento sexual em carnívoros da família dos canídeos. O ciclo biológico de N. hughesi é pouco conhecido. Foi estudado a variabilidade nucleotídica de seqüências intercaladas entre os genes codificadores das frações ribossômicas 18S, 5.8S (ITS-1). No entanto, como estas não permitem reconstruções filogenéticas com o uso de grupo externo, em virtude da inconsistência dos alinhamentos produzidos, pesquisamos uma seqüência codificadora de proteína sendo o marcador escolhido, o gene codificador da proteína de choque térmico HSP70 (heat shock protein 70KDa). Este gene é bastante utilizado para resolução de filogenias de outros organismos como, por exemplo, aqueles pertencentes ao gênero Cryptosporidium. No presente trabalho, amplificamos por PCR e seqüenciamos 951 pares de bases (pb) do gene codificador de HSP70 de oocistos T. gondii-like (oriundos de fezes gatos), de oocistos Neospora-like (de fezes de cães) e de taquizoitos de N. caninum, N. hughesi e T. gondii mantidos em laboratório. Os primers foram desenhados a partir de seqüências consenso obtidas em pesquisa de bancos de dados de seqüências EST de N. caninum e seqüências de RNAm de T. gondii. Seqüências ITS-1 destes oocistos também foram determinadas para a confirmação da espécie de parasito estudada. Os resultados mostram que os táxons H. hammondi e T. gondii são monofiléticos e geneticamente muito próximos, mas contrariando resultados anteriores, não foi demonstrada a monofilia entre os táxons H. heydorni e N. caninum. De fato, a análise de diversidade nucleotídica de gene codificador HSP70 mostra que a distância evolutiva entre H. heydorni e N. caninum é tão grande quanto a distância de cada uma destas espécies com T. gondii. Em adição, foi possível identificar dentre as amostras de oocistos, duas linhagens divergentes de H. heydorni. Paralelamente ao estudo filogenético também foi possível desenvolver um método diagnostico diferencial para oocistos tipo Hammondia. As seqüências de gene HSP70 obtidas foram alinhadas e dois pares de primers internos a estas seqüências foram desenhados. O primeiro par amplifica 771 pb de oocistos T. gondii-like e o segundo 400 pb de oocistos Neospora-like. A clivagem do fragmento de 771 pb com enzima de restrição Hin6I produz perfis eletroforéticos distintos para amostras de T. gondii e H. hammondi. A clivagem do fragmento de 400pb com a enzima de restrição MunI também produz perfis eletroforéticos distintos entre amostras de N. caninum e H. heydornii. A diferenciação dos perfis de restrição pode ser feita em eletroforese em gel de agarose a 2,5%. / Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora huguesi, Neospora caninum and Hammondia heydorni are the known members of the sub-family Toxoplasmatinae. H. heydorni and N. caninum use canids as definitive hosts whereas felids are the definitive hosts from T. gondii and H. hammondi. The definitive host of N. hughesi is unknown. Here, the nucleotide diversity at internal transcribed spacer (ITS-1) and heat shock protein (HSP70 kDa) loci in the subfamily toxoplasmatinae were studied. The HSP70 coding genes are widely used for phylogenetic studies in a number of other organisms specially within the genus Cryptosporidium. In the present study, it was amplified by PCR and sequenced 951 bases pairs (bp) from HSP70 coding gene from oocysts T.gondii-like (from cat), from oocysts N. caninum-like (from dog) and tachyzoites of N. hughesi grown on cell cultures. The primers were designed based on consensus sequences within EST sequences of N. caninum sequences and RNAm sequences of T. gondii. ITS-1 sequences amplified from oocysts were also obtained in order to confirm the species of the parasites. The results showed that T. gondii and H. hammondi are monophyletic and genetically very close, but the monophyletic status of H. heydorni N. caninum was not demonstrated. In fact, the nucleotide diversity at the HSP70 locus has shown that the evolutionary distance between H. heydorni and N. caninum is as high as that observed between either H. heydorni or N. caninum and T. gondii., In addition, it was possible to identify two distinct groups among the H. heydorni oocysts. Concomitantly to the phylogenetic study it was also possible to standardize a diagnostic test capable of differentiate the oocysts Hammondia-like was development a diagnostic method that differ oocysts T. gondii-like and N. caninum-like. The sequences obtained from HSP70 coding gene were aligned and two new pair of PCR primers was designed. The first pair amplifies 771bp from T. gondii-like oocysts, whereas the second pair amplifies 400 bp from N. caninum-like oocysts. The restriction enzyme Hin6I used to cleave the 771 bp amplicons generated distinct profiles with samples from H. hammondi and T. gondii. The same occurred with the restriction of the fragments of 400bp cleaved by the enzyme MunI used in N. caninum e H. heydorni samples. The profiles can be differentiated by 2.5% agarose gel electrophoresis.

A Lawsonia intracellularis é uma bactéria intracelular obrigatória que causa Enterite Proliferativa em vários animais, como suínos, cervos, ratos, hamsters, cobaios, coelhos, ovinos, eqüinos, raposas, cães, furões, primatas não humanos, emas e avestruzes. Atualmente não há relatos da ocorrência do agente ou dos sinais clínicos de sua infecção em aves comerciais (Gallus gallus domesticus). O presente estudo reporta a detecção através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) de Lawsonia intracellularis em matrizes pesadas de diferentes idades provenientes de quatro linhagens de aves comerciais. Dentre os 100 suabes de fezes colhidos a partir de fragmentos intestinais, 34% foram positivos para a detecção do agente pela PCR. O agente foi encontrado com maior freqüência em aves de 80 semanas de idade apresentando ou não quadro diarréico. Os fragmentos intestinais das aves cujas fezes foram positivas para detecção de Lawsonia intracellularis foram submetidos ao exame histopatológico e na maioria das lesões analisadas foi observada enterite necrótica crônica proliferativa. Apesar das lesões serem sugestivas de infecção por Lawsonia intracellularis pela coloração de Warthin-Starry, a presença do patógeno no interior dos enterócitos ou células glandulares não foi observada. Esses resultados poderiam levar a novas pesquisas sobre a importância da Lawsonia intacellularis na avicultura do Brasil e do mundo. / Lawsonia intracellularis is an obligate intracellular bacterium responsible for proliferative enteritis in many animals, such as swine, deers, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, ovine, horses, foxes, dogs, ferrets, no human primats, emus and ostrichs. Currently there is no reports about the occurrence of this agent or clinical signs of its infection in chickens (Gallus gallus domesticus). The present study reports the detection of Lawsonia intracellularis at different ages of broiler breeder in four avian commercials lineages by Polymerase Chain Reaction (PCR). Of 100 faecal swabs collected from intestinal fragments, 34% were positive for Lawsonia intracellularis detection by PCR. The agent was more frequently found in chickens of 80 weeks of age presenting or not diarrhea. The intestinal fragments which faeces were positive for Lawsonia intracellularis PCR detection were submitted to histopathological exam and in the most analysed lesions were observed proliferative necrotic cronic enteritis. Although the lesions were suggestive of L. intracellularis infection by Warthin-Starry staining, the presence of the pathogen inside of enterocytes or gland cells was not observed. This results could lead to new researches about the mean of Lawsonia intacellularis in broiler industry of Brazil and the world.

A Brucella canis é a espécie de Brucella que acomete os cães, acarretando problemas reprodutivos e prejuízos econômicos aos proprietários de canis comericias, além do risco que representa para os manipuladores e os proprietários dos cães, os quais podem adquirir a infecção pelo contato com os animais infectados e/ou materiais contaminados por B. canis. Vários métodos de diagnósticos foram desenvolvidos com o intuito de diagnosticar a brucelose nos cães, no entanto cada teste apresenta um desempenho diferente em relação à sensibilidade, especificidade, rapidez e praticidade na identificação dos cães acometidos. Estudos indicam que a PCR em tempo real tende a apresentar maior sensibilidade e especificidade, além da rapidez na execução. Diante disso o objetivo deste trabalho foi desenvolver, padronizar e validar a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para diagnóstico da brucelose canina causada por B. canis utilizando amostras de sangue total de cães. Um total de 56 cães de canis comercias e animais domiciliados, foram submetidos à hemocultura, sorodiagnóstico, PCR convencional (PCRc) e PCR em tempo real (PCRtr) e posteriormente os resultados obtidos em cada teste foram comparados por meio do coeficiente Kappa. Na padronização das reações de PCRtr foram testados três conjuntos de primers e sondas (PCRtr-A, B e C), utilizando-se diferentes temperaturas de annealing e concentrações de primers. A PCRtr-B teve melhor desempenho sob temperatura de annealing de 59&deg; C, utilizando 900 nM de primers tendo detectado um maior número de cães positivos em relação à hemocultura e PCRc. Porém o teste não se apresentou confiável, uma vez que ocorreram reações inespecíficas em amostras provenientes de cães não infectados, sugerindo uma baixa especificidade do teste. Portanto, as técnicas de hemocultura e PCRc apresentaram melhor desempenho do que a PCRtr avaliada para o diagnóstico de B. canis. / Brucella canis is the species that affects dogs, causing reproductive problems and economic losses mainly for the owners of commercial kennels, besides the risk that it represents for the manipulators and the owners of dogs that can acquire the infection by the contact with infected animals or contaminated materials. Several diagnostic methods have been developed for the diagnosis of the infection in dogs. However, the performance of the tests vary regarding sensitivity, specificity, speed and practicality for the identification of infected dogs. Studies indicated that the real-time PCR (rtPCR) might show higher sensitivity and specificity, as well as speed of execution. Therefore, the objective of this study was to develop, standardize and validate a rtPCR assay for the diagnosis of canine brucellosis caused by B. canis using whole blood samples from dogs. A total of 56 dogs from commercial kennels and domiciled animals were tested through blood culturing, serological test, conventional PCR (cPCR) and rtPCR, and subsequently the results obtained in each test were compared using the Kappa coefficient. During the standardization of the rtPCR, three sets of primers and probes (rtPCR-A, B and C) were tested using different annealing temperatures and primer concentrations. rtPCR-B showed better performance under the annealing temperature of 59&deg; C and using 900 nM of primers having detected a higher number of positive dogs when compared to blood culturing and PCRc. However, the test was considered not reliable to be used in canine brucellosis diagnosis, since non-specific reactions occurred in samples from uninfected dogs, suggesting a low specificity of the test. Therefore, the blood culturing and cPCR techniques showed a better performance than the developed rtPCR assay to be used in the diagnosis of B. canis infection in dogs.