Orientador: Marion Burkhardt de Koivisto / Banca: Janaina Torres Carreira / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Maricy Apparicio Ferreira / Resumo: O estudo teve por objetivo avaliar o sêmen criopreservado de touros da raça Nelore de diferentes idades e verificar se a qualidade espermática declina com o avanço da idade e se geração espontânea intracelular de superóxido, peroxidação lipídica e danos no DNA estão envolvidos neste processo em decorrência da susceptibilidade ao estresse oxidativo durante o envelhecimento. Para isso, foram utilizados três ejaculados de 40 touros, subdivididos em três faixas etárias: Jovens de 1,8 a 2 anos (n= 27 partidas), Adultos de 3,5 a 7,0 anos (n= 52 partidas) e Senis de 8,0 a 14,3 anos (n= 34). Os touros jovens apresentaram altos valores de motilidade, integridade da membrana e acrossoma e de alto potencial mitocondrial comparado com touros adultos e senis (p<0,05). Houve correlação positiva entre a idade e os parâmetros considerados indesejáveis tais como baixo potencial mitocondrial, membrana lesada, acrossoma lesado e danos oxidativos no DNA (p<0,05) e negativa com alto potencial mitocondrial, membrana íntegra e acrossoma íntegro (p<0,05), indicando redução da qualidade espermática com o envelhecimento. A geração de superóxido, peroxidação lipídica (BodipyC11581/591) não apresentou diferença significativa entre a idade e os parâmetros referentes à qualidade espermática (p>0,05). A concentração de TBARS foi menor em touros jovens quando comparado aos adultos, mas diferenças não foram observadas em touros senis (p>0,05). Danos oxidativos no DNA correlacionaram negativamente com a variável membrana e acrossoma íntegro (r= 0,33, p<0,03) e positivamente com os valores de baixo potencial mitocondrial (r= 0,38, p<0,01). A qualidade espermática declina com o avanço da idade e não está relacionada com a geração de superóxido e peroxidação lipídica (TBARS e BodipyC11581/591) no sêmen criopreservado. No entanto, alta porcentagem de danos oxidativos no DNA no sêmen ... / Abstract: The aim of this study was to evaluate sperm quality of frozen-thawed semen samples of Nelore Bulls of different ages and verify if the quality declines with age and if it is associated with the spontaneous generation of intracellular superoxide, lipid peroxidation and DNA damage. 40 bulls were divided into three age groups: Young 1,8 to 2 years (n = 27 samples), Adults 3.5 to 7.0 years (n = 52 samples) and Senile , from 8 to 14.3 years (n = 34 samples). Young bulls showed higher values of motility, membrane integrity and acrosome and high mitochondrial potential compared to adults and senile bulls (P <0.05). There was a positive correlation between age and undesirable parameters such as low mitochondrial potential , damaged membrane, damaged acrosome and oxidative DNA damage (P<0.05). There was also a negative correlation with high potential mitochondrial, membrane integrity and acrosome integrity (P<0.05). These results indicate a reduction in sperm quality with aging. The generation of superoxide and lipid peroxidation (BodipyC11581/591) showed no significant differences between age and parameters related to sperm quality (P>0.05). The TBARS concentration was lower in young bulls compared to adults, but no differences were observed in senile bulls (P>0.05). Oxidative DNA damage correlated negatively with membrane and acrosome integrity (r = 0.33, P<0.03) and positively with low mitochondrial potential (r = 0.38, P<.01). The sperm quality declines with aging and is not related to superoxide generation and lipid peroxidation (TBARS and BodipyC11581/591) in frozen semen. However, high percentage of oxidative DNA damage indicates the involvement of other ROS (reactive oxygen species) which reduces sperm quality and increases susceptibility to oxidative stress during aging / Mestre

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-20. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:13:44Z : No. of bitstreams: 1 000866927.pdf: 585944 bytes, checksum: 976b997ede2e6fb1c664f9142a6fcbaf (MD5) / Muitos garanhões não respondem de forma satisfatória frente ao processo de criopreservação sendo vários os fatores envolvidos nessa intolerância. Visando elucidar resultados superiores de alguns animais aos processos de criopreservação espermática, foram realizados dois experimentos. No experimento I, o objetivo foi avaliar a ação do estresse oxidativo e as consequências no sêmen de garanhões resistentes e sensíveis ao processo de congelação espermática, verificando também a influência do fator racial frente ao processo de congelação espermática. No experimento II, o objetivo foi avaliar a influência da presença do plasma seminal sobre a resistência espermática no sêmen refrigerado de garanhões considerados bad e good coolers. Para avaliação das amostras seminais foi realizada análise computadorizada de cinética espermática (CASA, Thorne Research - HTMA IVOS), análise e quantificação do estresse oxidativo pela mensuração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), análise da fragmentação do DNA espermático (HALOMAX) e análises de translocação de fosfolipídios da membrana, índice de caspase ativada e quantificação de espécies reativas de oxigênio pela citometria de fluxo. No experimento I, não houve influência racial com relação à qualidade espermática, além disso, os garanhões bad freezer, que apresentaram maior perda de qualidade seminal após a congelação espermática, revelaram maiores níveis de estresse oxidativo e fragmentação do DNA espermático. No experimento II, os garanhões sensíveis à refrigeração apresentaram melhora da qualidade espermática ao retirarmos o plasma seminal. Já nos good coolers houve uma manutenção da qualidade espermática na presença do plasma seminal e uma diminuição da qualidade sem o plasma seminal. Além disso, observamos ao submeter as amostras ao teste-desafio, que as análises espermáticas se tornam mais confiáveis... / A significant number of stallions do not respond in a satisfactory way to the cryopreservation process and that there are many factors involved. In order to elucidate the reasons why some animals have superior results in the spermatic cryopreservation processes, two experiments were conducted. In experiment I, the goal was to evaluate the action of oxidative stress and the consequences in the semen of stallions that were resistant and susceptible to the spermatic freezing process. The influence of the racial factor to the spermatic freezing process was also verified. In experiment II, the goal was to evaluate the influence of the seminal plasma presence on spermatic resistance in cooled semen of stallions considered as bad and good coolers. To evaluate seminal samples, computer analysis of the spermatic cinetic was done (CASA, Thorne Research - HTM IVOS), oxidative stress levels were assessed by thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), sperm DNA fragmentation (HALOMAX) and analysis of the translocation of membrane phospholipids, activated caspase indices and quantification of ROS with flow cytometry were done. In experiment I, there was no influence of the breed factor in relation to the sperm quality of the analyses that were done. Furthermore, the bad freezers stallions, that showed the most loss of seminal quality after spermatic freezing, presented higher rates of oxidative stress and spermatic DNA fragmentation. In experiment II, the stallions that were considered sensitive showed improvement of the sperm quality as the SP was removed. Furthermore, in the good coolers we observed the preservation of sperm quality in the presence of SP and a quality decrease in the samples without the SP. Additionally, we also observed the importance of the test challenge for the evaluation of the sperm analysis, because when submitted to stressful situations, the differences were evident. Keywords: Semen, cryopreservation, oxidative stress...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-12Bitstream added on 2014-06-13T20:19:12Z : No. of bitstreams: 1 000735365.pdf: 900905 bytes, checksum: af6d064cd3611688a062c81bbd0f9510 (MD5) / O estudo teve por objetivo avaliar o sêmen criopreservado de touros da raça Nelore de diferentes idades e verificar se a qualidade espermática declina com o avanço da idade e se geração espontânea intracelular de superóxido, peroxidação lipídica e danos no DNA estão envolvidos neste processo em decorrência da susceptibilidade ao estresse oxidativo durante o envelhecimento. Para isso, foram utilizados três ejaculados de 40 touros, subdivididos em três faixas etárias: Jovens de 1,8 a 2 anos (n= 27 partidas), Adultos de 3,5 a 7,0 anos (n= 52 partidas) e Senis de 8,0 a 14,3 anos (n= 34). Os touros jovens apresentaram altos valores de motilidade, integridade da membrana e acrossoma e de alto potencial mitocondrial comparado com touros adultos e senis (p<0,05). Houve correlação positiva entre a idade e os parâmetros considerados indesejáveis tais como baixo potencial mitocondrial, membrana lesada, acrossoma lesado e danos oxidativos no DNA (p<0,05) e negativa com alto potencial mitocondrial, membrana íntegra e acrossoma íntegro (p<0,05), indicando redução da qualidade espermática com o envelhecimento. A geração de superóxido, peroxidação lipídica (BodipyC11581/591) não apresentou diferença significativa entre a idade e os parâmetros referentes à qualidade espermática (p>0,05). A concentração de TBARS foi menor em touros jovens quando comparado aos adultos, mas diferenças não foram observadas em touros senis (p>0,05). Danos oxidativos no DNA correlacionaram negativamente com a variável membrana e acrossoma íntegro (r= 0,33, p<0,03) e positivamente com os valores de baixo potencial mitocondrial (r= 0,38, p<0,01). A qualidade espermática declina com o avanço da idade e não está relacionada com a geração de superóxido e peroxidação lipídica (TBARS e BodipyC11581/591) no sêmen criopreservado. No entanto, alta porcentagem de danos oxidativos no DNA no sêmen... / The aim of this study was to evaluate sperm quality of frozen-thawed semen samples of Nelore Bulls of different ages and verify if the quality declines with age and if it is associated with the spontaneous generation of intracellular superoxide, lipid peroxidation and DNA damage. 40 bulls were divided into three age groups: Young 1,8 to 2 years (n = 27 samples), Adults 3.5 to 7.0 years (n = 52 samples) and Senile , from 8 to 14.3 years (n = 34 samples). Young bulls showed higher values of motility, membrane integrity and acrosome and high mitochondrial potential compared to adults and senile bulls (P <0.05). There was a positive correlation between age and undesirable parameters such as low mitochondrial potential , damaged membrane, damaged acrosome and oxidative DNA damage (P<0.05). There was also a negative correlation with high potential mitochondrial, membrane integrity and acrosome integrity (P<0.05). These results indicate a reduction in sperm quality with aging. The generation of superoxide and lipid peroxidation (BodipyC11581/591) showed no significant differences between age and parameters related to sperm quality (P>0.05). The TBARS concentration was lower in young bulls compared to adults, but no differences were observed in senile bulls (P>0.05). Oxidative DNA damage correlated negatively with membrane and acrosome integrity (r = 0.33, P<0.03) and positively with low mitochondrial potential (r = 0.38, P<.01). The sperm quality declines with aging and is not related to superoxide generation and lipid peroxidation (TBARS and BodipyC11581/591) in frozen semen. However, high percentage of oxidative DNA damage indicates the involvement of other ROS (reactive oxygen species) which reduces sperm quality and increases susceptibility to oxidative stress during aging

Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Coorientador: Eliandra Antônia Pires Büttler / Coorientador: Juliana Côrrea Borges / Coorientador: Maria Emília Franco / Banca: Giuliano Queiroz Mostachio / Banca: Fabiana Azevedo Voorwald / Banca: Tathiana Ferguson Motheo / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Resumo: O objetivo foi verificar se a suplementação do meio diluente Tris-gema com Trolox, N-acetilcisteína (NAC) ou a associação de ambos, em três concentrações distintas (0,15; 0,25 e 0,35mM), possibilitaria ou não a melhora na qualidade da preservação das células espermáticas nos processos de refrigeração e congelação. Foram utilizadas 15 unidades experimentais (UE), cada qual constituído pelo recuperado espermático de cinco cães hígidos (n=75) submetidos à orquiectomia eletiva. Estes, por sua vez, foram igualmente divididos em três grupos experimentais: grupo I (GI), II (GII) e III (GIII), os quais tiveram a adição de antioxidantes nas concentrações de 0,35, 0,25 e 0,15mM, respectivamente. Cada UE foi dividido em três partes, uma foi avaliada a In Natura, outra após a refrigeração por 48 horas, e a terceira após a congelação/ descongelação. Ato continuo, cada parte foi subdividida em quatro amostras de igual volume, que foram centrifugadas e o sobrenadante armazenado. O concentrado de espermatozoides foi ressuspendido em meio diluente Tris-gema, puro, ou acrescido de Trolox, NAC ou de ambas. Os espermatozoides foram avaliados quanto à motilidade, vigor, teste vital, índice de atividade citoquímica, integridade de membrana, mensuração do total das espécies reativas de oxigênio e radical hidroxila. Os dados obtidos foram submetidos à análise de regressão logística Proc Glimmix e teste de correlação de Pearson (p<0,05). Após a criopreservação foi observado que adição dos antioxidant... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of the present study was to evaluate whether the supplementation of the Tris egg-yolk extender with three different concentrations (0,15; 0,25 and 0,35mM) of N-acetyl cysteine (NAC), Trolox or the association of both, would improve the quality of sperm cells after chilling and freezing. Fifteen experimental units (EU), each one consisted by epidydimal sperm recovered from five healthy dogs (n=75) after elective orchiectomy were used in this study. The EU were equally divided into three experimental groups. Group I (GI), II (GII) and III (GIII) had the addition of 0.35, 0.25 and 0.15mM of antioxidants, respectively. Each group was divided into three aliquots, the first one was evaluated at the moment of the collection, the second aliquot was chilled for 48 h and the third was frozen. Subsequently, each EU was divided into four aliquots of equal volume and immediately centrifuged, the supernatant was discarded and the concentrated sperm resuspended in TRIS extender supplemented with Trolox and/or N-acetyl cysteine. Sperm total and progressive motility, vital test, cytochemical activity indexes membrane integrity, and measurement of reactive oxygen species (ROS) by TBARS and TAC were performed. Data were statistically analyzed by logistic regression analysis Proc GLIMMIX and Pearson correlation test (P <0.05). After cryopreservation the addition of antioxidants reduced total production of ROS. The concentrations and antioxidants chosen in this study were sufficient to ma... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: José Antônio Dell'Aqua Junior / Banca: Frederico Ozanan Papa / Banca: André Maciel Crespilho / Resumo: A biotécnica mais utilizada em equinos no Brasil é a inseminação artificial com sêmen refrigerado. Apesar dos avanços, ainda há uma grande variação nos resultados de fertilidade em programas reprodutivos. A carnitina é um composto vitamínico que desempenha um papel importante no metabolismo energético, já que ela garante a produção de energia pelo espermatozoide através do estímulo de vias metabólicas. Além disso, ascarnitinas apresentam potente poder antioxidante, conferindo maior proteção durante o armazenamento.No entanto, sua utilização pós-ejaculação é pouco estudada, já que existem poucos relatos deste tipo de aplicação, sendo nenhum deles em equinos. Devido a isso, este trabalho foi dividido em dois experimentos. O objetivo do experimento 1 foi determinar a concentração ideal l-carnitina (LC) e acetil-l-carnitina (AC) na refrigeração de sêmen equino a 5ºC. No experimento 2, o objetivo foi avaliar os efeitos da melhor dose de LC e AC e sua associação sobre a viabilidade espermática através da citometria de fluxo. No experimento 1 foram utilizados dois ejaculados de 12 garanhões. Após a diluição com Botu-Sêmen® na concentração de 50 x 106 espermatozoides/mL, os ejaculados foram divididos em sete grupos: controle (C), tratado com 5 mmol/L (LC-1), 10 mmol/L (LC-2), 15 mmol/L (LC-3)de LC, tratado com 5 mmol/L (AC-1), 10 mmol/L (AC-2) e 15 mmol/L (AC-3) de AC e após foram refrigerados a 5ºC por 48 horas. Para o experimento 2 foram utilizados os mesmos animais e manipulação dos experimentos anteriores, entretanto, os grupos testados foram: Controle (C), tratado com 10 mmol/L de LC (LC), tratado com 10 mmol/L de AC (AC) e 10 mmol/L de LC + 10 mmol/L AC (LC+AC). A cinética espermática foi avaliada por análise computadorizada do movimento espermático e a integridade de membrana plasmática (IMP) por microscopia de epifluorescência no experimento 1 e 2, entretanto, ... / Abstract: Over the years, technology for cooling semen has developed. However, despite progress, pregnancy rates are still variable between reproductive programs.Carnitine is a vitamin compound which plays an important role in energy metabolism, since it guarantees the sperm energy production by stimulating metabolic pathways. Furthermore, carnitine has a powerful antioxidant effect, providing greater protection to plasma membrane during storage.However, post-ejaculation use is poorly studied, being none in horses. The aim of experiment 1 was determine optimal concentration of lcarnitine (LC) and acetyl-l-carnitine (AC) in equine semen cooled at 5°C. In experiment 2, the objective was evaluate dose effects between LC, AC and their association on sperm viability by flow citometry. Two ejaculates from 12 stallions were used in both experiments. After dilution with Botu-Semen®to 50 x 106 spermatozoa/ml, each ejaculate was split into seven groups: control (C), treated with 5 mmol/L (LC-1), 10 mmol/L (LC -2), 15 mmol/L (LC-3) of LC, treated with 5 mmol /L (AC-1), 10 mmol/L (AC-2) and 15 mmol/L (AC-3) of ACand then cooled at 5°C for 48 hours. In second experiment, groups were divided in: control (C), treated with 10 mmol /l of LC (LC), treated with 10 mmol /L of AC (AC) and 10 mmol/L of LC + 10 mmol/L of AC (LC+AC).In both experiments,sperm kinetics was evaluated by computerized analysis (CASA) and plasma membrane integrity (IMP) by epifluorescence microscopy.Moreover, in experiment 2 were assessed DNA, ROS and Lipid Peroxidation (PEROX) by flow cytometry.All analysis were performed before cooling (T0), 24 (T24) and 48 hours (T48) after. According to the results of first experiment, LC groups had higher IMP and better values of kinetic than control. Groups treated with AC showed higher results of sperm kinetics after 24 hours of refrigeration and IMP in all analysed times. In second experiment, treated groups were ... / Mestre

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: André Maciel Crespilho / Banca: Rubens Paes de Arruda / Banca: José Antonio Dell'aqua Junior / Banca: Fabíola Soares Zahn / Resumo: Apesar dos benefícios proporcionados pelo plasma seminal durante a cobertura, quando biotecnologias são utilizadas, como a inseminação artificial, sua função é questionável, visto que trabalhos utilizando espermatozoides da cauda do epidídimo acrescido ou não do plasma seminal não apresentaram diferença nas taxas de concepção. Além disso, estudos relataram efeito deletério das secreções das glândulas anexas sobre a viabilidade espermática e taxa de concepção, principalmente em garanhões com baixa qualidade seminal. Neste sentido, o objetivo do presente estudo é: 1) comparar os parâmetros de cinética espermática, viabilidade estrutural e fertilidade dos espermatozoides recuperados do ejaculado e da cauda do epidídimo de garanhões subférteis; 2) avaliar diferenças na composição eletrolítica do plasma seminal de animais com alta e baixa fertilidade. 3) comparar o efeito da adição de plasma seminal de garanhões de alta e baixa fertilidade sobre a congelabilidade e viabilidade dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo de garanhões subférteis. As avaliações das amostras seminais consistiram na análise computadorizada das características da motilidade (CASA, Thorne Research - HTM IVOS) e nas análises de citometria de fluxo da integridade da membrana plasmática, da integridade acrossomal, da peroxidação das membranas espermáticas, da fragmentação do DNA, da capacitação espermática, da translocação de fosfatidilserina da membrana e da ativação de caspase. Os espermatozoides do epidídimo após descongelação apresentaram superioridade nos parâmetros de cinética e viabilidade espermática, além de melhor fertilidade, demonstrando que estes espermatozoides são mais resistentes ao processo de congelação quando comparado aos espermatozoides do ejaculado. O plasma seminal de garanhões subférteis apresentou maiores concentrações de sódio ... / Abstract: Despite the benefits provided by seminal plasma during natural cover when biotechnology are used as artificial insemination, its function is questionable, since studies using spermatozoa from cauda epididymis with or without the addition of seminal plasma showed no difference in conception rates. Furthermore, studies have reported deleterious effects of secretions from accessory glands on sperm viability and conception rate, especially in stallions with poor semen quality. Thus the aims of this study were: 1) compare the kinetic parameters, structural viability and fertility of sperm recovered from ejaculate and cauda epididymis of subfertile stallions. 2) evaluate differences in electrolyte composition in the seminal plasma of animals with high and low fertility. 3) compare the effect of seminal plasma addition from stallions with high and low fertility on freezability and viability of sperm from the ejaculate and cauda epididymis of subfertile stallions. The assessment of each samples was determined by computer-assisted sperm analyses of motility (CASA, Thorne Research - HTM IVOS) and flow cytometry analyses of plasma membrane integrity, acrosome integrity, peroxidation of sperm membranes, DNA fragmentation index, degree of protein tyrosine phosphorylation in sperm surface and caspase activity. The epididymal sperm after thawing showed superiority in kinetic parameters and sperm viability, as well as better fertility, demonstrating that these spermatozoa are more resistant to freezing process when compared to sperm from the ejaculate. The seminal plasma of subfertile stallions has higher sodium concentrations in the seminal plasma than fertile stallions, what makes this finding a possible way to explain the deleterious effect of seminal plasma in these animals. Moreover, it was found that this deleterious effect is dose-dependent since the addition of 20% of seminal plasma from fertile and ... / Doutor

Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Coorientador: Maricy Apparício Ferreira / Banca: Eliandra Antonia Pires Buttler / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Resumo: Este estudo foi conduzido com o objetivo de o uso do meio diluente Botu-crio associado a vitamina E, em diferentes concentrações, que se demonstrem efetivas para a criopreservação de sêmen obtido de recuperado epididimário em felinos domésticos. Cinquenta e quatro gatos domésticos foram utilizados no experimento após serem submetidos à orquiectomia eletiva e os espermatozóides obtidos diretamente da cauda e ducto deferente do epidídimo. Foram constituídos 18 "pools", com o material de três animais cada e estes, divididos em quatro grupos experimentais. No grupo controle (G0) o sêmen foi congelado com o diluente Botu-Crio®. Nos grupos G 0,3, G 0,6 e G 0,9, ao diluente Botu-Crio® foi acrescido vitamina E em três concentrações, 0,3, 0,6 e 0,9mM, respectivamente. Para cada grupo, as amostras de sêmen fresco foram inicialmente avaliadas quanto à motilidade, vigor, morfologia supravital e teste hiposmótico, para verificar a qualidade mínima exigida para a congelação (motilidade ≥70% e vigor ≥3). Os mesmos parâmetros foram reavaliados após a descongelação também para o TBARS. Na avaliação da motilidade e vigor, não foi observado diferença estatística entre o grupo controle e as concentrações de vitamina E. Nos testes supravital, hiposmótico, morfológico e teste TBARS, também não houve significância entre as três diferentes concentrações de vitamina E e o grupo controle. Pode-se concluir que as três concentrações de vitamina E, não ofereceram proteção antioxidante ao recuperado de epidídimo de felinos domésticos / Abstract: This study was conducted with the objective of using the medium Botu-crio®, associated vitamin E, at different concentrations, which demonstrate effective for cryopreservation of epididymal semen obtained recovered from domestic cats. Fifty-four domestic cats were used in the experiment after undergoing elective orchiectomy and sperm obtained directly from the tail of the epididymis and vas deferens. 18 " pools " were made with the material of three animals each and these were divided into four experimental groups. In the control group (G0) semen was frozen with Botu-crio®. In the groups G 0.3, G 0.6 to G 0.9, the diluent was added at three concentrations of vitamina E, 0.3, 0.6 and 0.9 mM, respectively. For each group, the fresh semen samples were initially evaluated for motility, viability, morphology and supravital and hypoosmotic test to verify minimum quality required for freezing (≥ 70 % motility and vigor ≥ 3). The same parameters were reassessed after thawing also for TBARS. In the evaluation of motility and vigor, no statistical difference was observed between the control group and the concentrations of vitamin E. In supravital tests, hyposmotic, morphological and TBARS assay, there was no significance between the different concentrations of vitamin E and the control group. It can be concluded that the three concentrations of vitamin E, antioxidant protection not offered recovered from epididymis of domestic cats / Mestre

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Coorientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: Elizabeth Romagosa / Banca: Sergio Fonseca Zaiden / Banca: George Shigueki Yasui / Banca: Paulo Sérgio Ceccarelli / Resumo: A Tese de Doutorado foi estruturada em três capítulos, além da "Introdução Geral", que abrange uma revisão bibliográfica das espécies em estudo e dos temas abordados, e das "Considerações Finais". Os três capítulos darão origem a artigos científicos em revistas indexadas. O primeiro artigo (Capítulo I) descreve os parâmetros seminais e a ultraestrutura dos espermatozoides de Brycon vermelha, "vermelha" (Characiformes, Characidae). O sêmen da B. vermelha possuiu consistência viscosa, e concentração espermática média de 4,34 ± 0,75x1010 espermatozoides.mL-1. O tempo de motilidade espermática, quando ativado com água destilada, foi curto, sendo necessários 46,48 ± 0,07 segundos para perda da motilidade de 100% dos espermatozoides. A análise dos espermatozoides por MEV revelou três regiões distintas: cabeça, peça intermediária e flagelo, sendo cada região caracterizada detalhadamente em MET. Tais características sugerem que os espermatozoides de B. vermelha apresentam características ancestrais próprias de peixes com fecundação externa classificando-os como "espermatozoides aquáticos uniflagelados anacrossomais", ou seja, aquasperm do Tipo I. Estas informações são as primeiras em relação ao sêmen e espermatozoides de B. vermelha, podendo ser uma referência para futuros estudos, embasando especialmente pesquisas que adotem biotécnicas, como a criopreservação e androgênese. O segundo artigo (Capítulo II) descreve, ultraestruturalmente, as alterações dos espermatozoides da Brycon orbignyanus, "piracanjuba" (Characiformes, Characidae) durante o processo de criopreservação. O exame ultraestrutural dos espermatozoides descongelados criopreservados em soluções contendo DMSO, metilglicol e metanol, em três tempos de armazenamento (1 dia, 1 mês e 1 ano), revelou a presença de alterações no espermatozoide, variando desde ... / Abstract: The doctoral thesis consisted of three main chapters besides the "General Introduction", which includes a bibliographic review of the species studied and the topics discussed, and the "Final Remarks". Scientific research articles will be published from the data of the three chapters in the scientific journals listed in the index. The first scientific article (Chapter I) describes the seminal parameters and the spermatozoa structure of Brycon vermelha, "vermelha" (Characiformes, Characidae). The semen of the Brycon vermelha is viscous and contains, in average, 4.34 ± 0.75x1010 spermatozoa.mL-1. Spermatozoa motility was of short duration when activated with distilled water, 46.48 ± 0.07 seconds until 100% of spermatozoa lost their motility. Scanning transmission electron microscopy (STEM) of spermatozoa revealed three distinctive parts: head, middle piece and tail (flagellum). Each part was analysed in detail by transmission electron microscopy (TEM). The characteristics observed suggest that the spermatozoa of B. vermelha posses ancestral characteristics of fish that reproduce by external fertilization, and can thus be classified as "uniflagellate anacrosomal aquasperms", or aquasperms Type I. These are the first reports on B. vermelha semen and spermatozoa and, therefore, could be used as a reference and benchmark for research studies using biotechniques such as cryopreservation and androgenesis. The second scientific article (Chapter II) describes the ultrastructural alterations of Brycon orbignyanus, "piracanjuba" (Characiformes, Characidae) spermatozoa after cryopreservation. Spermatozoa were cryopreserved for 1 day, 1 month or 1 year in solutions containing DMSO, methyl glycol and methanol. The ultrastructural analysis of the frozen-thawed spermatozoa revealed alterations varying from small damages to the different parts of the cell to total destruction of spermatozoa ... / Doutor

Orientador: José Antônio Dell'Aqua Junior / Coorientador: / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Fabiana Ferreira Souza / Banca: Marcio Teoro do Carmo / Banca: André Maciel Crespilho / Resumo: Muitos garanhões não respondem de forma satisfatória frente ao processo de criopreservação sendo vários os fatores envolvidos nessa intolerância. Visando elucidar resultados superiores de alguns animais aos processos de criopreservação espermática, foram realizados dois experimentos. No experimento I, o objetivo foi avaliar a ação do estresse oxidativo e as consequências no sêmen de garanhões resistentes e sensíveis ao processo de congelação espermática, verificando também a influência do fator racial frente ao processo de congelação espermática. No experimento II, o objetivo foi avaliar a influência da presença do plasma seminal sobre a resistência espermática no sêmen refrigerado de garanhões considerados bad e good coolers. Para avaliação das amostras seminais foi realizada análise computadorizada de cinética espermática (CASA, Thorne Research - HTMA IVOS), análise e quantificação do estresse oxidativo pela mensuração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), análise da fragmentação do DNA espermático (HALOMAX) e análises de translocação de fosfolipídios da membrana, índice de caspase ativada e quantificação de espécies reativas de oxigênio pela citometria de fluxo. No experimento I, não houve influência racial com relação à qualidade espermática, além disso, os garanhões bad freezer, que apresentaram maior perda de qualidade seminal após a congelação espermática, revelaram maiores níveis de estresse oxidativo e fragmentação do DNA espermático. No experimento II, os garanhões sensíveis à refrigeração apresentaram melhora da qualidade espermática ao retirarmos o plasma seminal. Já nos good coolers houve uma manutenção da qualidade espermática na presença do plasma seminal e uma diminuição da qualidade sem o plasma seminal. Além disso, observamos ao submeter as amostras ao teste-desafio, que as análises espermáticas se tornam mais confiáveis... / Abstract: A significant number of stallions do not respond in a satisfactory way to the cryopreservation process and that there are many factors involved. In order to elucidate the reasons why some animals have superior results in the spermatic cryopreservation processes, two experiments were conducted. In experiment I, the goal was to evaluate the action of oxidative stress and the consequences in the semen of stallions that were resistant and susceptible to the spermatic freezing process. The influence of the racial factor to the spermatic freezing process was also verified. In experiment II, the goal was to evaluate the influence of the seminal plasma presence on spermatic resistance in cooled semen of stallions considered as bad and good coolers. To evaluate seminal samples, computer analysis of the spermatic cinetic was done (CASA, Thorne Research - HTM IVOS), oxidative stress levels were assessed by thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), sperm DNA fragmentation (HALOMAX) and analysis of the translocation of membrane phospholipids, activated caspase indices and quantification of ROS with flow cytometry were done. In experiment I, there was no influence of the breed factor in relation to the sperm quality of the analyses that were done. Furthermore, the bad freezers stallions, that showed the most loss of seminal quality after spermatic freezing, presented higher rates of oxidative stress and spermatic DNA fragmentation. In experiment II, the stallions that were considered sensitive showed improvement of the sperm quality as the SP was removed. Furthermore, in the good coolers we observed the preservation of sperm quality in the presence of SP and a quality decrease in the samples without the SP. Additionally, we also observed the importance of the test challenge for the evaluation of the sperm analysis, because when submitted to stressful situations, the differences were evident. Keywords: Semen, cryopreservation, oxidative stress... / Doutor

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: José Antônio Dell'Aqua Júnio / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a adição do plasma seminal autólogo ao sêmen criopreservado de jumentos, aliado a lavagem uterina pós-inseminação artificial influencia nos índices de fertilidade em jumentas. Para isso, dois experimentos foram realizados: No experimento I foram analisados os parâmetros de cinética espermática pelo método computer assisted sperm analysis (CASA), análise da integridade de membrana plasmática e acrossomal (MPAI), peroxidação lipídica (PERO) e teor de espécie reativa de oxigênio intracelular (EROS) pela técnica de citometria de fluxo, de 15 ejaculados de 3 jumentos, diluídos em INRA-96®(IC - INRA, IMV Technologies, France) - Rota et al., (2012) ou em BotuCrio® (BC - Botupharma, Botucatu, Brasil), com e sem adição de plasma seminal (PS) após a descongelação. Os resultados do CASA foram semelhantes para os 2 diluentes (P>0,05), no entanto o BC proporcionou uma maior integridade de MPAI além da PERO menor que o IC, resultando em menor EROS (P<0,05). A adição do PS reduziu os parâmetros do CASA (p<0,05), porém sem ação na MPAI e PERO (p>0,05). No experimento II, avaliou-se a influência da adição do PS autólogo na pós-descongelação e sua associação à lavagem uterina (L) pós-inseminação artificial (IA), na fertilidade de jumentas. Foram utilizados 86 ciclos de 33 jumentas, divididas em 8 grupos: G1) BC + PS + L e G2) IC + PS + L foram testados mediante inseminações em 14 ciclos cada; G3) BC + L e G4) IC + L foram testadas em 11 ciclos cada, todas as L foram feitas 10 horas após a IA; G5) BC + PS e G6) IC + PS foram empregados em 8 ciclos cada, e o G7) BC e G8) IC foram avaliados em 10 ciclos cada. Verificou-se que o PS não influiu na fertilidade de jumentas (p = 0,6582) contudo a L,10 h pós-IA, interferiu positivamente na taxa de prenhez (p = 0,0097) elevando de 0% (G7 e G8) para 42,9% (G1 e G2) / Abstract: The aim of this study was to evaluate whether the addition of autologous seminal plasma to frozen donkey semen, coupled uterine flushing after artificial insemination influence on fertility rates in jennies. Two experiments were conducted: experiment I, the parameters of sperm kinetics were analyzed by using computer assisted sperm analysis (CASA), analysis of plasma membrane integrity and acrosome (MPAI), lipid peroxidation (PERO) and reactive species content intracellular oxygen (ROS) by the technique of flow cytometry, 15 ejaculated 3 donkeys, diluted in INRA-96® (IC - INRA, IMV Technologies, France) -. Rota et al, (2012) or BotuCrio® (BC - Botupharma, Botucatu, Brazil), with and without addition of seminal plasma (SP) after thawing. The results were similar for CASA to 2 extenders (P> 0.05), however BC provided greater MPAI integrity beyond smaller PERO than the IC, resulting in lower EROS (P <0.05). The addition of PS reduced the parameters of CASA (P <0.05), but no action on the MPAI and Pero (P> 0.05). Experiment II, evaluated the influence of the addition of autologous SP in post-thaw and its association with uterine lavage (L) pos-IA, in the fertility jennies. 86 cycles of 33 jennies were used, divided into 8 groups: G1) BC + SP + Land G2) IC + SP + L, were tested by 14 cycles each; G3) BC+L and G4) IC+ L, were tested on each 11 cycles, all L were made 10 hours after AI; G5) BC + SP and G6) IC + SP were used in 8 cycles each, and the G7) BC and G8) IC were evaluated in 10 cycles each. It was found that the SP, had no effect on fertility jennies (p = 0.6582) however L 10 h post-IA, increased pregnancy rate (p = 0.0097) increasing from 0% (G7 and G8) to 42.9% (G1 and G2) / Mestre