Streptococcus thermophilus est la bactérie lactique la plus utilisée après Lactococcus lactis dans l'industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de fromages à pâte cuite (Emmental, gruyère), filée (Mozarella) ou pressée (Cheddar). Il s'agit du seul streptocoque à avoir le statut de bactérie GRAS (Generally Recognized As Safe). Dans un premier temps le potentiel probiotique de 30 souches de S. thermophilus de différentes origines a été testé par l'étude de leurs capacités à résister aux différentes conditions de stress rencontrées pendant leur passage dans le tractus gastro-intestinal (bas pH, sels biliaires et stress oxydant), de leur capacité à adhérer aux cellules épithéliales intestinales et de leurs propriétés immunomodulatrices. La majorité des souches réduit la production d'interleukine IL-8 (pro-inflammatoire) alors qu'elles induisent la production d'interleukine IL-10 (anti-inflammatoire) et l'IL-12 (pro-inflammatoire). Sur la base du rapport IL-10/IL-12, qui permet d'apprécier le potentiel anti-inflammatoire d'une souche, nous avons observé que certaines d'entre-elles pourraient avoir un fort potentiel anti-inflammatoire. L'Analyse en Composantes Principales (ACP) nous a permis de séparer les souches en 6 catégories différentes présentant des propriétés distinctes. A l'intérieur de chaque classe, une variabilité entre les souches a été observée et des caractéristiques intéressantes identifiées. Cependant, aucune des classes ne peut être considérée comme contenant le probiotique « parfait ». Suite à cette étude et sur la base de sa résistance aux stress gastriques et de ses capacités d'adhésion, et sachant que la séquence de son génome est disponible, la souche LMD-9 a été sélectionnée pour la deuxième partie de ce travail, à savoir la construction d'un outil basé sur la technologie R-IVET pour étudier l'état physiologique de S. thermophilus dans le tractus digestif. L'outil R-IVET mis au point se compose de deux éléments: un vecteur plasmidique portant le gène cre codant une recombinase spécifique dépourvu de son promoteur et une cassette chromosomique composée d'un gène de résistance à la spectinomycine flanqué par des sites loxP, reconnus par la recombinase Cre. La fonctionnalité de l'outil R-IVET a ensuite été testée par le clonage de trois promoteurs différents de S. thermophilus (PprtS, Pshsp and Plac) en amont de cre. Le système a été valide in vitro avec les trois promoteurs et in vivo avec le promoteur Plac / Streptococcus thermophilus is a lactic acid bacterium used after Lactococcus lactis in the dairy industry for the production of yogurt and cheeses like Emmental, Gruyere, Mozarella and Cheddar. It is the only streptococcus to have the GRAS (Generally Recognized As Safe) status. In this work, the probiotic potential of 30 S. thermophilus strains from different origins was tested by studying their ability to resist different stress conditions encountered during their passage through the GIT (low pH, bile salts and oxidative stress), their ability to adhere to intestinal epithelial cells and their immunomodulatory properties. Majority of the strains reduced the production of interleukin IL-8 (pro-inflammatory) and induced the production of interleukin IL-10 (anti-inflammatory) and IL-12 (pro-inflammatory). On the basis of the ratio IL-10/IL-12 which allows to evaluate the anti-inflammatory potential of a probiotic, several strains appeared to have a high the anti-inflammatory potential. Principal Component Analysis (PCA) allowed us to classify strains in 6 different categories with different properties. Within each class, variability and interesting features were observed, but none of the classes could be considered as containing the perfect probiotic. Following this study and on the basis of its resistance to gastric stress and its adhesion capacity and knowing that its genome sequence is available, the strain LMD-9 was selected for the second part of this work, namely the construction of a tool based on R-IVET to study the physiological state of S. thermophilus in the digestive tract. This tool is composed of two elements: a plasmid vector (pULNcreB), carrying the gene cre encoding a site-specific recombinase without its promoter and a chromosomal cassette composed of a gene of resistance to spectinomycin flanked by loxP sites which are recognized by the recombinase Cre. The functionality of the tool R-IVET was then tested by cloning three different promoters of S. thermophilus (PprtS, Pshsp and Plac) upstream of cre. System was valid in vitro with all the three promoters and in vivo by using the lactose operon promoter Plac

Si les modifications dans l’expression et les propriétés des mucines ont été largement décrites dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, la caractérisation structurale et fonctionnelle de la barrière de mucus reste parcellaire dans le contexte micro-inflammatoire du syndrome de l’intestin irritable (SII). Par ailleurs, certains traitements probiotiques préviennent la rupture de l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale, provoquée en conditions de stress mais peu de travaux décrivent leur influence sur les modifications de la structure du mucus, induites par le stress. Cette étude a comme objectifs d’évaluer chez le rat (i) si un stress chronique modifie le nombre de cellules à mucus et l’expression de la mucine Muc2, ainsi que la nature biochimique des mucines secrétées au niveau de l’iléon et du côlon, et plus particulièrement les O-glycanes, (ii) si un traitement probiotique (Lactobacillus farciminis) prévient les modifications du mucus potentiellement induites, (iii) si les effets observés sont en lien avec la capacité de colonisation in vivo de L. farciminis.Méthodes. Des rats Wistar mâles ont reçu L. farciminis ou une solution saline. Les animaux ont été soumis au stress d’évitement passif de l’eau (WAS) pendant 1h/jour ou à un stress fictif (contrôle), pendant les 4 derniers jours des traitements. Différents prélèvements ont été effectués au niveau de l’iléon et du côlon pour (i) des analyses sur coupes (immuno-marquage, nombre de cellules à mucus) et (ii) la détermination du profil de O-glycosylation des mucines. La morphologie de la couche de mucus a été évaluée par microscopie à force atomique (AFM). L. farciminis a été visualisé par "Fluorescence in situ Hybridization", confirmée par qPCR et son adhésion à la muqueuse a été déterminée par une méthode ex situ. La perméabilité paracellulaire et la sensibilité viscérale ont été évaluées.Résultats. Le WAS ne modifie pas le nombre de cellules à mucus ni l’expression de la mucine Muc2 aux niveaux iléal et colique. L’analyse par spectrométrie de masse a révélé que le stress induit des altérations de la O-glycosylation des mucines. Une augmentation marquée du degré de complexité des structures glycaniques a été observée, se traduisant par l’apparition de chaînes polylactosaminiques, sans modification toutefois du taux de sialylation et de sulfatation des mucines. La couche de mucus en condition de stress, observée par AFM, présente une morphologie aplatie et moins cohésive. L'hypothèse serait que les modifications structurales des O-glycanes influencent les interactions physico-chimiques entre les fibres de mucines, impactant de manière négative l’intégrité de la barrière de mucus. Cette altération de la couche de mucus s'accompagne d'un défaut de la barrière épithéliale et d'une hypersensibilité viscérale. L’administration de la souche probiotique prévient ces changements provoqués par le WAS. L. farciminis a été retrouvé au sein de l’iléon et du côlon. Par ailleurs, la présence de "Segmented Filamentous Bacteria" (SFB) a été mise en évidence, par FISH et microscopie électronique, au niveau de l’iléon sur l'ensemble des animaux testés. Le traitement par L. farciminis induit une diminution de la population des SFB aussi bien chez les animaux contrôles que stressés. Conclusion. Nous avons montré qu’un stress chronique chez le rat, outre les modifications fonctionnelles de l'épithélium intestinal (hyperperméabilité intestinale et hypersensibilité viscérale), altère la structure O-glycanique des mucines sans affecter l’expression de Muc2. Ces altérations se traduisent par une perte des propriétés cohésives de la couche de mucus. La souche probiotique L. farciminis, en prévenant l’ensemble des modifications induites par le stress, contribue au renforcement de la fonction barrière de l'intestin. Cette étude fournit un argumentaire complémentaire pour l’utilisation de cette souche dans le traitement du SII. / Background. Despite a large body of literature incriminating mucus alterations in the pathogenesis of Intestinal Bowel Diseases (IBD), structural and physical changes in the mucus layer remain poorly understood in the micro-inflammatory context of Irritable Bowel Syndrome (IBS). Moreover, some probiotic treatments prevent stress-induced intestinal epithelial barrier impairment but little is known about their influence on intestinal mucin structural modifications and mucus properties induced by stress. Thereby, this study aimed at evaluating whether (i) a chronic stress modified the number of gut goblet cells and Muc2 expression, nature of secreted mucins in both ileum and colon and more particularly mucin O-glycosylation, (ii) L. farciminis treatment prevented these alterations and (iii) observed effects were related to the in vivo colonization capacity of L. farciminis.Methods. Wistar rats received orally L. farciminis (1011 UFC/day) or vehicle (NaCl 0.9% (w/v)) for 14 days. From day 10 to day 14, they were submitted either to sham (control) or 4-day Water Avoidance Stress (WAS) during 1 hour per day. After sacrifice, different samples (tissues, mucosa) were collected in both ileal and colonic regions for (i) histological analyses (Muc 2 immunohistochemistry, number of goblet cells by Periodic Acid Schiff/Hemalun) and (ii) O-glycosylation profile by mass spectrometry after mucin extraction and purification. In parallel, the morphology of the mucus layer was evaluated by atomic force microscopy. Spatial localization of L. farciminis was assessed by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), confirmed by qPCR. Mucosal adhesion of L. farciminis was determined by an ex situ method. In complement, intestinal paracellular permeability and visceral sensitivity were measured.Results. WAS did not modify neither the number of intestinal goblet cells nor Muc2 expression in both ileum and colon. In contrast, the mass spectrometry analysis demonstrated that O-glycosylation of mucins was strongly affected by WAS. Indeed, a strongly increase in the complexity degree of O-glycan structures was observed in both ileum and colon, with the appearance of elongated polylactosaminic chains (repetition of the disaccharidic unit composed of galactose and N-acetylglucosamine), without modifications of mucin sialylation and sulfation. Under stress conditions, the mucus layer, observed by atomic force microscopy, showed a flattened morphology, probably indicative of a loss in its cohesive properties. We hypothesized that O-glycan structural modifications influence physico-chemical interactions between mucins fibers. Stress also induced intestinal hyperpermeability and visceral hypersensitivity. The mucus layer alteration was, thus, in relation with epithelial barrier impairment and visceral hypersensitivity. L. farciminis administration prevented WAS-induced functional, biochemical and physical changes of mucus. The presence of L. farciminis in the ileum and colon was detected by FISH and qPCR, albeit with quantitative and qualitative differences in the colonization capacity within these two intestinal compartments. Furthermore, the presence of Segmented Filamentous Bacteria (SFB) was shown in the ileum whatever the conditions under study. L. farciminis reduced the SFB population level in both control and stressed animals.Conclusion. Chronic stress induced functional changes (intestinal hyperpermeability and visceral hypersensitivity) in rats, as well as a shift in mucin O-glycosylation rather than changes in mucin expression. Intestinal mucin O-glycan modifications resulted in a loss of mucus layer cohesive properties. L. farciminis treatment prevented impairment of both intestinal epithelial and mucus barriers, reflecting an enhancement of the protective barrier function. These results confirm that L. farciminis is a valuable probiotic in the IBS management.

Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 (Pf) est une bactérie bénéfique utilisée comme levain fromager. Elle présente en outre de nombreuses potentialités probiotiques souche-dépendantes, dont la modulation de l’inflammation. Cette propriété résulte de la production de divers métabolites. Les protéines de surface S-layer (Slps), dont la protéine majoritaire SlpB, y jouent également un rôle immunomodulateur. Les propriétés « 2-en-1 », c’est-à-dire à la fois fermentaires et probiotiques, font de Pf un bon candidat pour développer des fromages fonctionnels, afin de prévenir les maladies inflammatoires intestinales. L’objectif de cette thèse était d’étudier l’impact de la matrice fromagère sur les propriétés immunomodulatrices de Pf, via ses protéines Slps, par comparaison à une culture sur ultrafiltrat de lait (UF). Les études conduites in vitro suggèrent que les bactéries provenant du fromage auraient une meilleure capacité de tolérance aux stress gastriques et duodénaux, mais elleauraient une moindre capacité de survie dans le côlon, par comparaison à des bactéries provenant d’une culture sur UF. De plus, la protéolyse digestive des protéines de surface améliore la survie de Pf dans le côlon. Parallèlement, l’étude de digestion in vitro a montré que la protéolyse des protéines de surface a seulement été réduite par la matrice fromagère. Cette protéolyse conduit à l’abolition des effets anti-inflammatoires des protéines Slps, qui ne sont pas exprimées de novo dans l’environnement colique. Ces résultats obtenus in vitro étaient cohérents avec l’étude in vivo qui a mont / Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 (Pf) is a beneficial bacterium used as a cheese starter. It moreover displays versatile strain-dependent probiotic properties, including the modulation of inflammation. This property results from the production of various metabolites. S-layer surface proteins (Slps), including the major SlpB protein, also play an immunomodulatory role. The "2-in-1" properties, i.e. both fermentative and probiotic properties, make Pf a suitable candidate to develop functional cheeses, in order to prevent inflammatory bowel diseases. The aim of this thesis was to study the impact of the cheese matrix on the immunomodulatory properties of Pf, mediated by its Slps proteins, compared to a culture on milk ultrafiltrate (MUF). In vitro studies suggest that the bacteria from the cheese would have a better ability to tolerate gastric and duodenal stresses, but would have less ability to survive in the colon, compared to bacteria from a MUF culture. In addition, thethe digestive proteolysis of surface proteins improves survival of Pf in the colon. In parallel, the in vitro digestion study showed that proteolysis of surface proteins was only limited by the cheese matrix. This proteolysis leads to the abolition of the anti-inflammatory effects of Slps proteins, which are not de novo expressed in the colonic environment. These results, obtained in vitro, were consistent with the in vivo study, which showed that MUF culture and cheese delivered similar amounts of metabolically active bacteria to the piglets’ colon. This in vivo study showed, however, that t

Les diarrhées post-sevrages causées par des infections à Escherichia coli entérotoxinogène positif pour le fimbriae F4 (ETEC F4), entraînent des pertes économiques importantes chez les producteurs de porc. Depuis quelques années, l’utilisation de probiotiques, comme additif alimentaire pour prévenir ce type d’infection entérique et réduire les traitements aux antimicrobiens, suscite un intérêt grandissant en production porcine. Le but du présent travail est de déterminer l’influence de l’administration des probiotiques Pediococcus acidilactici (PA) et Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) sur la colonisation et l’attachement des ETEC F4, l’accumulation de fluide intestinal et l’expression de cytokines dans l’iléon de porcelets sevrés. Dès la naissance, différentes portées de porcelets ont été affectées aux traitements suivants : PA, SCB, PA + SCB, témoin et témoin avec antibiotiques (ATB). Une dose quotidienne de probiotiques (1 × 109 UFC) a été administrée aux porcelets des groupes probiotiques durant la lactation et après le sevrage. Sept jours après le sevrage, à 28 jours d’âge, des porcelets positifs pour le récepteur intestinal spécifique pour F4 ont été infectés oralement avec une souche ETEC F4. Les porcelets ont été euthanasiés 24 heures après l’infection (jour 29) et différents échantillons intestinaux ont été prélevés. Chez les porcelets recevant des probiotiques, l’attachement des ETEC F4 à la muqueuse iléale était significativement diminué chez les groupes PA ou SCB en comparaison avec le groupe ATB. Finalement, l’expression de cytokines intestinales était plus élevée chez les porcs du groupe PA + SCB en comparaison avec les porcelets témoins. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que l’administration de probiotiques pourrait être une alternative pour limiter les infections à ETEC F4 chez le porc. / Postweaning diarrhea (PWD) associated with F4-positive enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC F4) causes important economic losses in swine production. Since a couple of years, the use of probiotics as feed additives to prevent such enteric infections and reduce the use of antimicrobial treatments, has gained in interest. The aim of the present study is to evaluate the effects of Pediococcus acidilactici (PA) and Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB), on ETEC F4 colonization and attachment, accumulation of intestinal fluid and cytokines expression in weaned pig’s ileum. At birth, different litters of pigs were allocated to the following treatments: PA, SCB, PA + SCB, control (CTRL) and control with antibiotics (ATB). Probiotics (1 × 109 CFU) were administered daily to probiotics group during the lactation period and after weaning. One week after weaning, at 28 days of age, all F4-receptor-positive pigs were orally challenged with an ETEC F4 strain. Pigs were slaughter 24 hours later (day 29) and different intestinal samples were collected. In pigs treated with PA or SCB, the attachment of ETEC F4 to the ileal mucosa was significantly reduced in comparison with the ATB group. Finally, intestinal cytokines were upregulated in PA + SCB group in comparison with the CTRL group. In conclusion, these results suggest that administration of probiotics could be an alternative to attenuate ETEC F4 infection in pigs.

Les diarrhées post-sevrages causées par des infections à Escherichia coli entérotoxinogène positif pour le fimbriae F4 (ETEC F4), entraînent des pertes économiques importantes chez les producteurs de porc. Depuis quelques années, l’utilisation de probiotiques, comme additif alimentaire pour prévenir ce type d’infection entérique et réduire les traitements aux antimicrobiens, suscite un intérêt grandissant en production porcine. Le but du présent travail est de déterminer l’influence de l’administration des probiotiques Pediococcus acidilactici (PA) et Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) sur la colonisation et l’attachement des ETEC F4, l’accumulation de fluide intestinal et l’expression de cytokines dans l’iléon de porcelets sevrés. Dès la naissance, différentes portées de porcelets ont été affectées aux traitements suivants : PA, SCB, PA + SCB, témoin et témoin avec antibiotiques (ATB). Une dose quotidienne de probiotiques (1 × 109 UFC) a été administrée aux porcelets des groupes probiotiques durant la lactation et après le sevrage. Sept jours après le sevrage, à 28 jours d’âge, des porcelets positifs pour le récepteur intestinal spécifique pour F4 ont été infectés oralement avec une souche ETEC F4. Les porcelets ont été euthanasiés 24 heures après l’infection (jour 29) et différents échantillons intestinaux ont été prélevés. Chez les porcelets recevant des probiotiques, l’attachement des ETEC F4 à la muqueuse iléale était significativement diminué chez les groupes PA ou SCB en comparaison avec le groupe ATB. Finalement, l’expression de cytokines intestinales était plus élevée chez les porcs du groupe PA + SCB en comparaison avec les porcelets témoins. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que l’administration de probiotiques pourrait être une alternative pour limiter les infections à ETEC F4 chez le porc. / Postweaning diarrhea (PWD) associated with F4-positive enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC F4) causes important economic losses in swine production. Since a couple of years, the use of probiotics as feed additives to prevent such enteric infections and reduce the use of antimicrobial treatments, has gained in interest. The aim of the present study is to evaluate the effects of Pediococcus acidilactici (PA) and Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB), on ETEC F4 colonization and attachment, accumulation of intestinal fluid and cytokines expression in weaned pig’s ileum. At birth, different litters of pigs were allocated to the following treatments: PA, SCB, PA + SCB, control (CTRL) and control with antibiotics (ATB). Probiotics (1 × 109 CFU) were administered daily to probiotics group during the lactation period and after weaning. One week after weaning, at 28 days of age, all F4-receptor-positive pigs were orally challenged with an ETEC F4 strain. Pigs were slaughter 24 hours later (day 29) and different intestinal samples were collected. In pigs treated with PA or SCB, the attachment of ETEC F4 to the ileal mucosa was significantly reduced in comparison with the ATB group. Finally, intestinal cytokines were upregulated in PA + SCB group in comparison with the CTRL group. In conclusion, these results suggest that administration of probiotics could be an alternative to attenuate ETEC F4 infection in pigs.