Connue pour son rôle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protéase à sérine, peut également agir par l’intermédiaire de PAR1, un récepteur activé par protéase et couplé aux protéines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive l’extrémité N-terminale du PAR1 entre l’Arg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrémité terminale qui agit elle-même comme un ligand. La thrombine et une séquence peptidique de cinq acides aminés, composée des résidus Ser42 à Arg46, nommée PAR1-AP, déclenchent dans diverses cellules de mammifères une réponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette étude, le système d’expression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le récepteur PAR1 du rat à la surface de ces cellules et de réaliser son couplage fonctionnel à leur signalisation intracellulaire (modèle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en réponse au PAR1-AP, a ensuite été étudiée en détail à l’aide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres éléments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP déclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi d’un plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. À l’aide d’inhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifédipine et le D-600, l'entrée du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibée, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. L’inhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la réponse au PAR1-AP après épuisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de façon discordante quant à l’inhibition de la libération de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La réponse à PAR1-AP n’est pas affectée par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase β. L’inhibition de la protéine kinase C (PKC) par le bisindolylmaléimide induit des oscillations en présence de Ca2+ extracellulaire et atténue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En présence de Ca2+ extracellulaire, l’activation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la réponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protéine kinase A (PKA), cause une prolongation de la durée du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la réponse à PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dépourvu de Ca2+. Les résultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rôle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modèle rPAR1-Sf9. / Thrombin’s serine protease activity allows for it to have a role in both the coagulation cascade as well as through a GTP- binding protein coupled receptor (GPCR) known as the protease-activated receptor-1 (PAR1). Thrombin binds to PAR1 at the N-terminal, cleaving between Arg41 and Ser42, and unmasking a new N-terminal which acts as a tethered ligand. Thrombin and a five amino acid peptide composed of the sequence of residues Ser42 to Arg46, known as PAR 1-AP, has been shown to mediate a number of signalling mechanisms in mammalian cells, including a calcium signalling pathway. In the present study, the Sf9-baculovirus system allowed us to express the rat PAR1 (rPAR1-Sf9) on the cell surface and study its intracellular signalling. The calcium (Ca2+) signal was studied using the fluorescent probe Fura-2, and several Ca2+ channel inhibitors and calcium signal modulators were used to study the signal induced by PAR1-AP. In the presence of extracellular calcium [Ca2+]e, thrombin and PAR1-AP produced a Ca2+ signal which consisted of an initial spike in [Ca2+]i followed by a relatively maintained plateau and a slow return towards baseline. In the absence of Ca2+ in the extracellular space, the initial Ca2+ increase is followed by a quick return to baseline [Ca2+]i. Ca2+ channel inhibitors, lanthanum, nifedipine and D-600, inhibited the entry of Ca2+ from the extracellular space and abolished the plateau phase of the response to PAR1-AP. Inhibition of the Ca2+-ATPase with thapsigargin abolished the response to PAR1-AP after having depleted the Ca2+ stores involved in the initial spike in [Ca2+]i. TMB-8, expected to inhibit the release of Ca2+ from internal stores, inconsistently inhibited the [Ca2+]i response to PAR1-AP. The response elicited by PAR1-AP was not affected by D-609, an inhibitor of phospholipase Cβ. Inhibition of protein kinase C (PKC) with bisindolylmaleimide induced oscillations in the [Ca2+]i levels in the presence of extracellular Ca2+ while it significantly blunted the response in the absence of extracellular Ca2+. PDBu activation of PKC truncated the [Ca2+]i surge in Ca2+-rich conditions while abolishing it altogether in the absence of extracellular Ca2+. H-89 inhibition of protein kinase A (PKA) prolonged the plateau duration in Ca2+-rich medium while inhibiting the response to PAR1-AP in a Ca2+-deficient environment. Taken together, our results suggest that PKC and possibly PKA play a critical role in the mobilisation of Ca2+ in rPAR1-Sf9 by PAR1-AP.

Les mécanismes moléculaires contrôlant les rythmes circadiens sont conservés parmi les organismes des différents règnes (plantes, animaux et champignons). Ils se composent de boucles de rétroaction où un complexe d’activation transcriptionnelle, l’hétérodimère CLK/CYC chez la drosophile, entraîne l'expression des répresseurs de son activité, les gènes et protéines PER et TIM chez la mouche. De manière importante, la période de l'oscillateur dépend en grande partie par des mécanismes post-transcriptionnels qui régulent l’accumulation et l'activité des composantes positifs et négatifs de la boucle. Bien que de nombreux partenaires d'interaction modifiant les composants d'horloge de base ont déjà pu être isolés, le schéma reste encore incomplet. Dans le cadre de la recherche de nouveaux composants de cette horloge, nous avons réalisé un crible comportemental basé sur l'expression ciblée de transgènes ARNi dirigés contre la moitié du génome de Drosophila melanogaster. Cinquante-quatre nouveaux gènes putatifs ont pu être identifiés. Au cours de ce travail, j'ai étudié le rôle de deux d’entre eux, sélectionnés pour les forts défauts comportementaux de l'expression de leur transgène ARNi. Le gène CG12082 de la drosophile est l’orthologue de l’Ubiquitin-specific protéase 5 (USP5) chez l’homme. La dérégulation d’Usp5 retarde les oscillations de la protéine PER dans les neurones d'horloge et allonge la période d'activité locomotrice des mouches. Chez les mouches ARNi Usp5, des formes à haut poids moléculaire des protéines PER et TIM s'accumulent pendant le matin, alors qu’elles sont normalement dégradées chez les contrôles. On a pu montrer que Usp5 participe directement à la dégradation de la protéine PER, indépendamment de TIM. En accord avec le rôle décrit pour l’orthologue humaine, Usp5 serait susceptible de contrôler la dégradation des protéines par son activité de démontage des chaînes libres de polyubiquitine présents dans la cellule, qui peuvent entrer en compétition avec les protéines ubiquitinylées pour la reconnaissance au niveau du protéasome, bloquant leur dégradation. La majorité des travaux ont porté sur un gène isolé au cours de notre crible, Strip, dont les fonctions étaient encore inconnues. Strip interagit avec Cka, une nouvelle sous-unité régulatrice de l’enzyme phosphatase PP2A. La dérégulation à la fois de Strip et/ou de Cka amène à des phénotypes comportementaux de période longue. D’un point de vue moléculaire, des formes hyper-phosphorylées de la protéine CLK s’accumulent dans la matinée quand Cka et/ou Strip sont perturbées. La dérégulation des activités générales de PP2A produit également une hyper-phosphorylation de CLK le matin, indiquant que, grâce à Cka/Strip, les complexes PP2A contrôlent la déphosphorylation de CLK à la fin du cycle. Il est connu que les formes hyper-phosphorylés de CLK sont transcriptionnellement inactives. En effet, la transcription des gènes tim et vrille, cibles de CLK, est fortement réduite dans les mouches ARNi Cka. En plus de PP2A/Cka, des complexes PP2A contenant une autre sous-unité régulatrice, Wdb, ont été montré pour déstabiliser CLK en culture des cellules (Kim et Edery, 2006). Nous montrons que la dérégulation de Wdb affecte la stabilité du CLK également dans la mouche adulte, sans toutefois induire aucun effet apparent sur sa phosphorylation. En conclusion, deux complexes PP2A différents agissent sur la protéine CLK : le complexe PP2A/Cka/Strip contrôle la déphosphorylation de CLK et sa réactivation, tandis que PP2A/Wdb affecte la stabilité de CLK indépendamment ou après PP2A/Cka. Ces résultats enrichissent l’étude de la régulation post-traductionnelle de la protéine CLK, qui était largement mal connue.Pour conclure, cette étude a permis de décrire deux nouveaux composants de la boucle moléculaire qui contrôle les rythmes circadiens chez la mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster. / The molecular mechanism underlying circadian rhythms is conserved among organisms and consists of feedback loops where a transcriptional activating complex (the CLOCK (CLK)/CYCLE (CYC) heterodimer in Drosophila) drives the expression of the repressors of its activity (the period (per) and timeless (tim) genes and proteins in Drosophila). Importantly, the pace of the oscillator largely depends on post-transcriptional mechanisms that regulate the accumulation and activity of both the positive and negative components of the loop. A number of interacting partners that modify core clock components have already been isolated, but more are expected. Looking for new clock components, we set up a behavioral screen based on targeted expression of RNAi transgenes directed to half of the Drosophila genome. 54 putative new clock genes have been identified. Among them, some were independently reported to function within the fruit fly molecular clock, thus validating the screen. In this work, I investigated the circadian role of additional “positive” genes, selected for the strong behavioral defect induced by the expression of the corresponding RNAi. The CG12082 gene codes for the fruit fly ortholog of the human Ubiquitin-specific protease 5 (USP5). Downregulation of USP5 in clock cells lengthens the period of locomotor activity of flies as well as PER protein oscillations in clock neurons. High molecular weight forms of PER and TIM proteins accumulate during the morning after USP5 knockdown, while these forms are degraded in controls. In addition, TIM is not stabilized in the absence of PER, while PER still accumulate in the absence of TIM. Therefore, USP5 directly participates in the degradation of the PER protein and, later, of the TIM protein at the end of the cycle. Being a deubiquitinylase enzyme, USP5 may directly deubiquitinate PER. However, accordingly to the role described for the human ortholog, USP5 likely controls protein degradation through the disassembling of the unanchored polyubiquitin chains present in the cell that could compete with ubiquitinated-PER for proteasome recognition and subsequent breakdown.The majority of the work has focused on an unknown gene isolated in the screen, that, accordingly to the human homolog, we named STRIP. We show that STRIP interacts with Connector of Kinase to AP-1 (CKA), a novel regulatory subunit for the PP2A phosphatase holoenzyme, both in insect S2 cells and in fly head extracts. Downregulation of both STRIP and/or CKA causes long-period behavioral phenotypes and high molecular weight forms of the CLK protein to accumulate in the morning. Perturbation of general PP2A activities also produces hyper-phosphorylated CLK in the morning indicating that, through CKA/STRIP, PP2A complexes controls CLK dephosphorylation at the end of the cycle. Hyper-phosphorylated CLK forms are transcriptionally inactive. Accordingly, transcription of the tim and vrille (vri) CLK targets is strongly reduced in Cka-RNAi fly head extracts. PP2A complexes containing the Widerborst (WDB) regulatory subunits were already shown to affect CLK stability in insect S2 cells (Kim and Edery, 2006). We show that WDB downregulation also affects the stability of CLK in fly head extracts, but has no apparent effects on CLK phosphorylation. Therefore, we could describe two different PP2A complexes acting on the CLK protein: PP2A/CKA/STRIP complex controls CLK dephosphorylation and reactivation, while PP2A/WDB affects CLK stability independently or after PP2A/CKA functions. Moreover, STRIP, but not CKA, downregulation affects the stability of PER, indicating that STRIP possesses some functions unrelated to CKA. In conclusion, this work has allowed the isolation of new components of the Drosophila molecular clock. In particular, we give evidence for a double role for the PP2A phosphatase in modulating the activity and stability of the CLK protein, the regulation of which is not well understood yet.

Les colicines sont des toxines antibactériennes d’Escherichia coli qui sont relâchées par les cellules productrices (colicinogènes) dans le milieu extracellulaire en réponse à des conditions de stress environnementaux. Les colicines D et E3 sont des RNases qui clivent respectivement les tRNAArg et le 16S RNA ribosomique. Les deux colicines parvenues au cytoplasme de la cellule cible provoquent ainsi la mort par inactivation de la machinerie de biosynthèse des protéines. L’import de ces deux colicines nécessite d’abord le détournement de deux systèmes cellulaires différents (FepA/TonB ou BtuB/Tol) de leur fonction physiologique, permettant leur translocation à travers la membrane externe. L’idée que par la suite la translocation à travers la membrane interne nécessite au préalable une étape de processing des colicines nucléases est ancienne, mais elle n’a jamais été démontrée formellement. Nos travaux ont permis de montrer qu’une coupure endoprotéolytique des deux colicines constitue une étape de « processing » essentielle de leur action toxique. Nous avons détecté la présence du domaine C-terminal catalytique des deux colicines dans le cytoplasme des cellules cibles préalablement exposées à la toxine. Les mêmes fragments processés (PF) ont été identifiés dans les cellules sensibles et dans les cellules immunes contre ces colicines, qui sont protégées par une protéine d’immunité spécifique, formant un complexe neutre avec le domaine catalytique. Nous avons démontré que la protéase essentielle de la membrane interne, FtsH, est nécessaire au processing des deux colicines pendant leur import. Nous avons montré aussi que la signal-peptidase LepB, une autre enzyme essentielle de la membrane interne, interagit directement avec le domaine central de la colicine D in vitro et ainsi elle est un facteur protéique spécifiquement nécessaire au processing de la colicine D. Cependant ce n’est pas l’activité catalytique de LepB qui est impliquée dans la toxicité de la colicine D, mais elle jouerait un rôle structural. LepB ainsi faciliterait probablement l’association de la colicine D avec la membrane interne en vue de la reconnaissance de la toxine par FtsH. Nous avons aussi montré que la protéase OmpT de la membrane externe est responsable d’une coupure endoprotéolytique alternative, qui refléte probablement son rôle bien connu dans le système de défense des bactéries contre les peptides anti-microbiens. Même si cette coupure in vitro permet de libérer le domaine catalytique des colicines D et E3, il est établit maintenant que la protéase OmpT n’est pas impliquée dans le processing des colicines durant leur import dans le cytoplasme. / Colicins are antibacterial toxins of Escherichia coli that are released into the extracellular medium in response to environmental stress conditions. Colicin D is an RNase that cleaves the anticodon loop of all four isoaccepting tRNAArg. Colicin E3 cleaves 16 S ribosomal RNA. Both colicins provoke cell death by inactivating the protein biosynthetic machinery. Colicin producer cells are protected against both endogenous and exogenous toxin molecules by the constitutive expression of a cognate immunity protein, which forms a tight heterodimer complex with the nuclease domain of the colicin. The import of both colicins first requires the “hijack” of some distinct functions of the target cell (namely the BtuB/Tol and FepA/TonB systems, respectively), this allowing their translocation across the outer membrane. It has long been suggested that the import of nuclease colicins requires protein processing during the translocation across the inner membrane; however it had never been formally demonstrated. Our work shows that the two different RNase colicins E3 and D undergo a processing step inside the cell that is essential to their killing action. We have detected the presence of the C-terminal catalytic domains of these colicins in the cytoplasm of target bacteria. The same processed forms (PF) were identified in both colicin-sensitive cells and in cells immune to colicins, because of the expression of the cognate immunity protein. We demonstrate that the inner membrane protease FtsH is necessary for the processing of colicins D and E3 during their import. We also show that the signal peptidase LepB interacts directly with the central domain of colicin D in vitro and that it is a specific but not a catalytic requirement for in vivo processing of colicin D. The interaction of colicin D with LepB may ensure a stable association with the inner membrane that in turn allows the colicin recognition by FtsH. We have also shown that the outer membrane protease OmpT is responsible for alternative and distinct endoproteolytic cleavages of colicins D and E3 in vitro, presumably reflecting its known role in the bacterial defense against antimicrobial peptides. Even though the OmpT-catalyzed in vitro cleavage also liberates the catalytic domain from colicins D and E3, it is not involved in the processing of nuclease colicins during their import into the cytoplasm

Récemment Franzetti et al. ont découvert un nouveau type de protéases auto-compartimentées indépendantes d'énergie dans les archaeas. Les particules ont été appelées TET pour leurs structures tridimensionnelles tétraédriques. Les TETs forment de grands complexes d'un poids moléculaire d'environ 500kDa. Leur rôle dans l'organisme est pourtant inconnu. Dans P. horikoshii, une Archaea hyperthermophile de la mer profonde, trois protéases TET ont été identifiées (PhTET1, 2 et 3). Nous avons exprimé et purifié PhTET3 recombinante. L'enzyme a été caractérisée biochimiquement et nous avons déterminé la structure d'un complexe de PhTET3 de 12 sous-unités par cristallographie aux rayons X. Afin de mieux comprendre son rôle physiologique potentiel et de s'assurer pourquoi il y a trois protéases TET dans P. horikoshii, la structure et les propriétés enzymatiques de PhTET3 ont été comparées à celles de deux autres protéases TET déjà caractérisées. Puisque l'auto-compartimentage joue un rôle important dans le fonctionnement et la régulation des protéases, les facteurs commandant l'oligomérisation de PhTET3 in vitro ont été étudiés par ultracentrifugation analytique et diffusion de neutrons aux petits angles. Finalement, dans des états physiologiques de mer profonde, l'enzyme est exposée à la haute température (jusqu'à 100°C) et à la haute pression. Afin d'étudier les limites de la stabilité de grands assemblages macromoléculaires, la structure à basse résolution et l'activité enzymatique de PhTET3 ont été mesurées à hautes pressions et à hautes températures en utilisant la diffusion des rayons X aux petits angles et la spectrophotométrie à haute pression. Au total, ces études ont indiqué que les protéases TET de P. horikoshii forment un système intégré de dégradation de peptides et que PhTET3 montre une stabilité exceptionnelle à haute pression et à haute température aussi bien que des propriétés enzymatiques associées aux conditions environnementales.

Le dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau. Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus. Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes. Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2. "Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2. Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2. En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire. Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire. / During the recent years the existing statements that G – protein coupled receptors (GPCRs) are relaying signals only from the plasma membrane have been challenged. It has become clear that some GPCRs can also signal from intracellular compartments and the nucleus. The role and the function of these nuclear GPCRs are subject of intensive investigations. Protease - activated receptors (PAR) are members of the GPCR family. PARs are activated by the cleavage of the N – terminus of the receptor followed by binding of the tethered ligand on to the receptor. Four PARs have been described: PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4. PAR2 can induce mitogenic effects and participate in processes such as angiogenesis and inflammation. While many of the intracellular effects of PAR2 can be explained with its plasma membrane signalling pathway, intracrine effects of PAR2 have also been proposed. However the mechanisms by which PAR2 can induce its target gene expressions are still unknown. The purpose of our study was to investigate whether a distinct nuclear population of PAR2 exists. We hypothesized that the roles of PAR2 at different cellular compartments are different since signalling pathways depend on subcellular context. Using confocal microscopy and Western blot techniques we were able to demonstrate the presence of a nuclear population of PAR2. Upon stimulation of the cell membrane PAR2, we observed significant translocation of the receptor from the plasma membrane to the nucleus. Using RT – PCR technique we detected diverse roles of cell surface and nuclear PAR2 on triggered gene expression. In the current study we have attempted to reveal the mechanisms responsible for PAR2 nuclear translocation. We tested the hypothesis that members of the Sorting Nexin (SNX) family are involved in PAR2 nuclear translocation. Sorting Nexins are a new, large group of proteins with well established cargo functions. SNX1 and SNX2 have been demonstrated to be responsible for lysosomal sorting of PAR1. SNX11 has not been studied yet, and we hypothesized that it may be another SNX involved in PAR2 signalling. We developed stable knockdowns for SNX1, SNX2 and SNX11 in HEK293 cells. Using immunofluorescence, Western Blot analysis and FACS assays, we determined that all three members of SNX group are interaction partners of PAR2. However only SNX11 co-localized with its partner in the nucleus and is responsible for its nuclear translocation. RT – PCR experiments on SNXs knockdowns cell lines demonstrated that PAR2 nucleus function is mostly dependent on SNX11; nevertheless SNX1 and SNX2 knockdowns can also attenuate it, suggesting that they are part of PAR2 signalling network. In conclusion, PAR2 is being translocated from the plasma membrane to the nuclear membrane after its stimulation with SLIGKV. PAR2 nucleus translocation triggers intracellular effects different from its cell membrane signalling. SNX11 is the major factor responsible for PAR2 nuclear sorting. Keywords: G – protein coupled receptors, Sorting Nexins, Protease - activated receptors, nuclear translocation, nuclear membrane, nuclear signalling

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire. / Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic cancer with a five-year survival rate of 30-40% in patients diagnosed with high-grade invasive disease (TOV). This is in stark contrast to the 95% five-year survival in patients diagnosed with low malignant potential (LMP) disease. It is therefore important to understand the biological differences between LMP and TOV. We have previously identified differential expression of SERPINA1 between serous LMP and TOV tumors through gene expression analysis using Affymetrix U133 DNA microarrays. Expression of this protease inhibitor in the majority of LMP tumors was confirmed and validated by Q-PCR. To study the effects of its overexpression on the invasive potential of ovarian cancer cell lines, SERPINA1 was cloned in the pcDNA3.1+ plasmid and stable clones were derived from two invasive ovarian cancer cell lines, TOV 112D and TOV 1946. Comparisons between clones and controls have shown no SERPINA1-dependent difference in cellular growth or spheroid formation. However, effects on cellular migration and invasion are observed in cells overexpressing SERPINA1. Results from an in vivo xenograft study in SCID mice will allow us to determine if SERPINA1 overexpression affects ovarian tumorigenesis. SERPINA1 remains an interesting candidate gene whose further characterization may lead to insights into its role, and the role of proteases and their inhibitors, in ovarian cancer disease progression.

Clostridium difficile est une bactérie pathogène responsable de diarrhées nosocomiales et de la plupart des colites pseudomembraneuses. Le principal facteur de risque est la prise d'antibiotiques qui altère la composition du microbiote intestinal, et favorise ainsi l'implantation de la bactérie au niveau colique. Après une étape de colonisation, la bactérie produit ses principaux facteurs de virulence, les toxines A et B. La colonisation est un processus multifactoriel, qui met en jeu différentes protéines de surface dont des adhésines et une cystéine protéase Cwp84.Dans une première partie, nous avons analysé le processus de maturation de la protéase Cwp84, ainsi que sa localisation dans la bactérie, afin de mieux comprendre son rôle dans la virulence de C. difficile. La protéase recombinante, purifiée sous forme de zymogène, présente un processus de maturation particulier comprenant des clivages successifs, qui aboutissent à la forme mature de 47 KDa. La protéase ainsi activée présente une activité protéolytique sur la fibronectine. Dans la bactérie, Cwp84 existe sous deux formes majoritaires, associées à la surface de la bactérie : une première forme, d'environ 80 KDa, associée aux protéines de la couche S, dont le rôle serait de cliver le précurseur des protéines de la couche S en deux protéines matures ; une deuxième forme, d'environ 50 KDa correspondant vraisemblablement à la forme mature de la protéase recombinante de 47 KDa, est retrouvée à la fois dans la fraction extracellulaire et associée à la surface de la bactérie. Nous avons montré que la protéase rélarguée est capable de se ré-associer sous sa forme mature de manière spécifique à la surface de C. difficile. Dans une deuxième partie, nous avons analysé l'impact de conditions environnementales mimant celles rencontrées par la bactérie au cours de son transit dans le tractus digestif de l'hôte, sur la modulation de facteurs de colonisation, dont la protéase. Nous avons montré qu'un pH acide favorise à la fois l'expression et le processus de maturation de la protéase vers sa forme mature de 47 KDa. Des analyses protéomiques et transcriptomiques ont montré que d'autres protéines impliquées dans colonisation sont surexprimées dans un milieu avec glucose, cette régulation étant vraisemblablement liée à la diminution du pH résultant de la fermentation du glucose plutôt qu'à un effet direct de ce sucre. Cette régulation des facteurs de virulence par le pH acide est probablement un élément favorable au processus de colonisation de l'hôte. Ces différentes analyses ont également permis l'identification de facteurs de virulence potentiels, qui devront être caractérisés par la suite.

La malignité des astrocytomes est établie sur base de critères morphologiques définis au sein de la classification de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Ce système de gradation, qui s’échelonne de I à IV, constitue actuellement l’outil pronostique le plus fiable. Par facilité, les cliniciens regroupent les astrocytomes de grade I (astrocytomes pilocytiques) et les astrocytomes diffus de grade II sous le terme d’« Astrocytomes de bas-grade » par opposition aux astrocytomes de haut-grade, constitués des astrocytomes anaplasiques (grade III) et des glioblastomes (GBM ;grade IV). Cette terminologie conduit à des prises en charge cliniques inadéquates car elle englobe des tumeurs très différentes en terme d’agressivité :les astrocytomes de grade I, majoritairement non infiltrants, non évolutifs et indolents et les astrocytomes diffus de grade II, toujours infiltrants et évolutifs, progressant systématiquement en astrocytomes de haut-grade et entraînant le plus souvent le décès prématuré du patient. Bien que ces tumeurs soient définies par la classification de l’OMS comme des entités clinicopathologiques distinctes, peu de données sont disponibles dans la littérature pour expliquer leurs particularités biologiques et la pratique quotidienne montre que les différencier peut être difficile. <p><p>Le but des études entreprises au cours de ce travail de thèse est d’apporter une contribution à la compréhension des mécanismes de tumorigenèse qui différencient l’astrocytome de grade I des astrocytomes diffus (grade II-IV), de manière à identifier des voies biologiques qui permettraient, au moins en partie, d’expliquer ces différences de comportement. <p><p>Au cours de la première partie de ce travail, nous avons caractérisé les profils d’expression génomique des astrocytomes de grade I et de grade II, en comparant les données d’expression de gènes (évaluées par des technologies de micropuces d’ADN) de travaux publiés entre 2000 et 2005. L’expression des gènes identifiés a été validée par des analyses de RT-PCR quantitative sur une série indépendante d’astrocytomes de grade I, II et IV. Les fonctions biologiques des protéines codées par chacun de ces gènes ont fait l’objet de recherches bibliographiques détaillées afin de proposer un modèle permettant d’approcher les différences de comportement de ces tumeurs. Cette analyse nous a permis d’identifier TIMP4 (tissue inhibitor of metalloproteinases 4) et IGFBP2 (insulin-like growth factor binding protein 2) comme gènes candidats pour améliorer la caractérisation biologique et clinique des astrocytomes de grade I par rapport aux astrocytomes diffus. TIMP4 et IGFBP2 codent respectivement pour un inhibiteur endogène des métalloprotéinases matricielles (MMPs) et une protéine de liaison capable d’inhiber l’action des « insulin-like growth factors » (IGFs, dont IGFI et IGFII), des facteurs impliqués dans la croissance et la migration des astrocytes normaux et tumoraux. <p><p>Sur base de la surexpression de TIMP4 et d’IGFBP2 dans les astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus de grade II, nous avons posé l’hypothèse suivante :« L’absence d’agressivité des astrocytomes de grade I, en comparaison aux astrocytomes diffus (grade II-IV) pourrait en partie être liée à l’inhibition par TIMP-4 de la protéolyse des complexes IGFBP2-IGFII au sein de ces tumeurs ». Cette protéolyse, qui diminue l’affinité d’IGFBP2 pour IGFII, pourrait contribuer à libérer IGFII dans la matrice extracellulaire (MEC), favoriser la liaison d’IGFII à son récepteur IGF-IR et stimuler la croissance et la migration des cellules astrocytaires tumorales. Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé différentes analyses biochimiques afin i) de caractériser les actions protéolytiques de MMP-2, MMP-9 et MT1-MMP sur le complexe IGFBP2-IGFII, ii) d’identifier la libération d’IGFII lors du clivage de ce complexe, et iii) d’étudier l’action inhibitrice de TIMP-4. A l’aide d’un modèle cellulaire in vitro (lignée astrocytaire tumorale LN229), nous avons ensuite observé l’influence de la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII sur la croissance et la motilité cellulaire. Cette étude a montré :(1) la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII par MMP-9, (2) l’inhibition partielle de cette protéolyse par TIMP-4, (3) la libération d’IGFII résultant de cette protéolyse et (4) les effets stimulants de la libération d’IGFII sur la croissance et la motilité des cellules LN229. Cette étude souligne le rôle important de la protéolyse des complexes IGFBP2-IGFII dans l’agressivité des astrocytomes diffus. Elle confirme les effets stimulants propres d’IGFII, d’IGFBP2 et de MMP-9 sur la motilité et/ou la croissance des cellules astrocytaires tumorales. Enfin, elle identifie un rôle inhibiteur potentiel de TIMP-4 sur la protéolyse du complexe IGFBP2-IGFII, qui pourrait contribuer à expliquer le caractère plus indolent des astrocytomes de grade I en comparaison aux astrocytomes diffus.<p><p>\ / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction : Le virus de l’hépatite C (VHC), est l’une des premières causes de pathologie hépatique dans le monde. Ce virus à ARN est responsable de l’hépatite C qui aboutit au développement de la cirrhose et du cancer du foie. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, le VHC infecte actuellement plus de 170 millions de personnes dans le monde, soit 3% de la population. L’hépatite C chronique connait toujours en Tunisie un taux de guérison faible pour le génotype 1 car le traitement standard actuellement disponible est la bithérapie interféron pégylé associé à la ribavirine. A l’heure actuelle, le développement de différentes molécules ciblant spécifiquement le VHC, appelées les antiviraux à action directe (AAD), apparait comme une potentielle révolution dans le traitement de l’infection par le VHC.Ces AAD comprennent les inhibiteurs de protéase (IP), les inhibiteurs nucléos(t)idiques (IN) et les inhibiteurs non-nucléosidiques (INN) de la polymérase NS5B ainsi que les inhibiteurs de la protéine NS5A. La quasi-espèce virale est formée d’un mélange complexe de variants viraux parmi lesquels se trouvent des variants associés à des degrés variables à la résistance aux AAD. Ces variants peuvent donc exister naturellement en absence de toute pression médicamenteuse et sont susceptibles d’avoir un impact sur la réponse aux différents traitements par AAD. Notre objectif était de déterminer la prévalence des variants associés à la résistance dans les souches tunisiennes circulantes en préambule à l’introduction deces molécules en Tunisie. Méthodes : L’amplification et le séquençage direct de la protéase NS3, de la polymérase NS5B ainsi que la région NS5A ont été effectuées chez 149 patients tunisiens naïfs de traitement et infectés par le VHC de génotype 1 (génotype 1b = 142 ; génotype 1a = 7). Résultats : Douze séquences NS3 (12/131 ; 9,2%) ont montré des mutations connes pour conférer une résistance aux IP. Une seule séquence (1/95 ; 1,1%) a montré la mutation V321I connue pour conférer une résistance aux IN-NS5B. Trente quatre séquences (34/95 ; 35,8%) ont montré des mutations connues pour diminuer la sensibilité des INN-NS5B. Une seule séquence de génotype 1a (1/7 ; 14,3%) et 17 séquences de génotype 1b (17/112 ; 16,2%) ont montré des mutations connues pour conférer une résistance au inhibiteurs de la protéine NS5A. Conclusions : Notre étude a permis de mettre en évidence la présence de substitutions conférant une diminution de la sensibilité aux AAD chez des patients tunisiens naïfs de tout traitement anti-VHC. Des études in situ seront nécessaires pour évaluer l’impact de ces mutations sur la réponse au traitement. / Introduction: Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver disease worldwide. This RNA virus is responsible for hepatitis C, which leads to the development of cirrhosis and liver cancer. According to the World Health Organization, HCV infects more than 170 million people worldwide, about 3% of the population. Chronic hepatitis C still know in Tunisia low cure rates for genotype 1, because the currently standard treatment available is combination therapy of pegylated interferon plus ribavirin. At present, the development of different molecules that specifically target HCV, called direct-acting antivirals (DAA) appears as a potential revolution in the treatment of HCV infection. These DAA include protease inhibitors (PI), nucleos(t)ide (NI) and non-nucleoside inhibitors (NNI) for NS5B polymerase and NS5A inhibitors. The viral quasispecies is formed by a complex mixture of viral variants including variants associated with variable degrees of resistance to DAA. These variants may therefore exist naturally in absence of drug pressure and may affect response to different treatments by DAA. Our objective was to determine the prevalence of variants associated with resistance in circulating Tunisian strains preamble to the introduction of these molecules in Tunisia. Methods: Amplification and direct sequencing of NS3 protease, NS5B polymerase and NS5A region were performed in 149 Tunisian naïve patients infected with HCV genotype 1 (genotype 1b = 142; genotype 1a = 7) . Results: Twelve sequences NS3 (12/131; 9.2%) showed mutations known to confer resistance to PI. One sequence (1/95; 1.1%) showed the V321I mutation known to confer resistance to NS5B-IN. Thirty four sequences (34/95; 35.8%) showed mutations known to reduce the sensitivity of NS5B-INN. One genotype 1a sequence (1/7; 14.3%) and 17 genotype 1b sequences (17/112; 16.2%) showed mutations known to confer resistance to NS5A inhibitors.Conclusions: Our study highlighted the presence of substitutions conferring decreased susceptibility to DAA in naïve patients infected with HCV genotype 1. Field studies will be needed to evaluate the impact of these mutations on the treatment response.

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