A l’heure actuelle, le processus neurodégénératif responsable de la MA n’est pas complètement élucidé et ses causes sont probablement multiples. Cependant, on sait qu’il met en jeu Tau, une protéine associée aux microtubules et qui permet leur stabilisation ; dans les cerveaux des patients Alzheimer, Tau est présente sous un état anormalement phosphorylée, agrégeant en filaments appariés en hélice à l’intérieur des neurones. Notre modèle d’étude in vitro consiste en une protéine Tau recombinante phosphorylée par la CDK2/CycA3 sur deux phosphoépitopes spécifiques à la MA et reconnus par les anticorps AT8 et AT180. Ce profil de phosphorylation a été caractérisé de façon qualitative et quantitative par spectroscopie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire). Nous avons ensuite tenté de cartographier ces phosphoépitopes par deux techniques complémentaires originales : la RMN et le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Nous avons également montré que l’(hyper)phosphorylation de Tau ne menait pas forcément à son détachement des microtubules, hypothèse largement répandue dans la littérature. Finalement, nous avons pu mettre en évidence une interdépendance entre les deux phosphoépitopes AT8 et AT180 lors de la déphosphorylation de notre échantillon de protéine Tau phosphorylée par PP2AT55, une phosphatase trimérique majeure du cerveau. / The neurodegenerative process responsible for Alzheimer’s disease is not yet elucidated and its causes are probably multiple. Nevertheless, we know that it brings into play Tau, a microtubule associated protein that allows their stabilization; in Alzheimer patients’ brain; Tau proteins are present under an abnormally hyperphosphorylated state which aggregate in paired helical filaments inside the neurons. Our in vitro study model is based on a recombinant Tau protein phosphorylated by CDK2/CycA3 on two Alzheimer’s disease specific phosphoepitopes recognized by AT8 and AT180 antibodies. This phosphorylation pattern was qualitatively and quantitatively characterized by NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spectroscopy. We tried then to map these phosphoepitopes by two original and complementary methods NMR and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). We also showed that (hyper)phosphorylation of Tau doesn’t lead necessarily to its detachment from microtubules, a hypothesis widely spread in literature. Finally, we highlighted that during the dephosphorylation of our phospho-Tau sample by PP2AT55, a major trimeric phosphatase in brain, the dephosphorylation of AT8 phosphoepitope was under AT180 phosphorylation status control.

Le gène H19 est soumis à l’empreinte génomique parentale et ne code aucune protéine. Le produit de ce gène, le long ARN non codant (lncRNA) H19, agit en tant qu’ARN et est impliqué dans le développement embryonnaire ainsi que dans la tumorigenèse. Le lncRNA H19 est le précurseur du miR-675. Mes travaux de thèse ont permis d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la tumorigenèse mammaire par le gène H19. Nous avons mis en évidence que le lncRNA H19 régule négativement la protéine p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux ont démontré que le lncRNA H19 interagit physiquement avec la protéine p53 et MDM2 afin d’induire sa dégradation et empêcher sa translocation dans le noyau. Ce nouveau mode d’action d’H19 dans les cancers du sein pourrait expliquer le manque de pertinence clinique de l’étude du statut mutationnel de p53 par immunohistochimie dans ce cancer. J’ai également mis en évidence que non seulement le lncRNA H19 est impliqué dans la régulation des cellules souches cancéreuses, mais également le miR-675-5p. En effet, les tumeurs exprimant des signatures géniques associées aux marqueurs de cellules souches cancéreuses sont des tumeurs qui surexpriment le gène H19. De plus, la modulation de l’expression du lncRNA H19 et de son microARN régule les capacités fonctionnelles associées aux cellules souches cancéreuses mammaires. Pour finir, j’ai initié un projet permettant l’identification, sans a priori, des gènes cibles du lncRNA H19 et de son microARN dans les cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, j’ai mis en évidence l’implication du lncRNA H19 et du miR-675-5p dans différents processus impliqués dans la tumorigenèse mammaire. / The H19 gene is subject to genomic imprinting and does not encode protein. The product of this gene, the long non coding RNA (lncRNA) H19, act as an RNA and is involved in development and the tumorigenesis. The H19 RNA is the precursor of miR-675. My thesis work identified new mechanism involved in the regulation of breast tumorigenesis by H19. We have demonstrated that the lncRNA H19 negatively regulates the p53 protein in breast cancer cell lines. My work revealed that H19 interacts with p53 and MDM2 to induce the degradation of p53 and impedes its nuclear localization. This new mechanism of H19 in breast cancer could explain the lack of clinical relevance of the p53 mutational state measured by immunohistochemistry in breast cancer. My work also revealed that not only the lncRNA H19 is involved in the regulation of breast cancer stem cells but also the miR-675-5p. Indeed, we have shown a correlation between overexpression of H19 and expression of a cancer stem cell phenotype in patient tumors. Furthermore, the modulation of H19 or miR-675 expression regulates the functional capacities associated with breast cancer stem cells. I also initiated a project that will allow the identification of H19 and miR-675 target genes in breast cancer cell lines. To conclude, I highlighted the implication of the lncRNA H19 and miR-675 in different process involved in breast cancer tumorigenesis.

ErbB2/HER2 est un récepteur tyrosine kinase de la famille d'EGFR (ErbB1) surexprimé dans plus de 20% des cancers du sein et associé à une forme particulièrement agressive de la maladie. Les récepteurs ErbBs sont actifs seulement sous forme de dimères, permettant la phosphorylation de leur queue C-terminale par leur domaine tyrosine kinase. La phosphorylation entraine l'interaction avec des protéines adaptatrices et l'activation de voies de signalisation, Ras/MAPK et PI3K/Akt principalement. Ces voies contrôlent la prolifération, la motilité cellulaire et la résistance à l'apoptose. Contrairement à ErbB1/3/4, ErbB2 dimérise en l'absence de ligand. Comprendre les autres mécanismes de régulation de la phosphorylation de ses tyrosines et de ses interactions est donc particulièrement intéressant.ErbB2 a fait l'objet de nombreuses études structurales et fonctionnelles. Elles ont permis la mise au point de traitements ciblés efficaces mais sujets à l'apparition de résistance, dont l'anticorps Trastuzumab, ciblant sa partie extracellulaire. La queue C-terminale d'ErbB2 (CtErbB2) a été très souvent ignorée dans ces études. Cette partie étant intrinsèquement désordonnée, il a fallu attendre ces dernières années pour que les concepts et les outils permettant de l'étudier émergent.Dans cette thèse, j'ai d'abord effectué la caractérisation structurale et dynamique de CtErbB2. J'ai montré que bien qu'étant dépourvue de toute structure stable, cette région riche en prolines possède plusieurs structures secondaires transitoires et un contact longue-distance participant très probablement à la régulation de ses interactions intra- et inter-moléculaires. Dans une deuxième partie je me suis intéressée à la caractérisation de la protéine adaptatrice Grb2, partenaire essentiel de ErbB2 pour l'activation de la voie des MAP kinases. L'organisation en solution des domaines de cette protéine modulaire dans sa forme libre était jusque là inconnue. J'ai ensuite étudié l'interaction entre Grb2 et CtErbB2, et montré que CtErbB2 interagit non seulement avec le domaine SH2 de Grb2 (par l'intermédiaire d'une phosphotyrosine), mais aussi avec son domaine SH3 N-terminal (grâce à un motif polyproline). Enfin, j'ai mis en place plusieurs stratégies de phosphorylation des tyrosines de CtErbB2, dans le but d'étudier plus largement l'effet des phosphorylations sur l'ensemble de cette région. / ErbB2/HER2 is a receptor tyrosine kinase of the EGFR (ErbB1) family overexpressed in 20% of breast cancers and associated to a particularly aggressive form of the disease. ErbB receptors are only active upon dimerization that enables phosphorylation of their C-terminal tail by their tyrosine kinase domain. Phosphorylation then triggers interaction with adaptor proteins and activation of signaling pathways, mainly Ras/MAPK and Akt/PI3K. Those pathways control cell proliferation, motility and resistance to apoptosis. Contrary to ErbB1/3/4, ErbB2 can dimerize without any ligand. Understanding other mechanisms of regulation of its tyrosine phosphorylation and of its interactions is thus particularly interesting.ErbB2 structure and function have been extensively studied. This has led to the development of several FDA-approved targeted drugs, that are effective but to which resistance occurs, amongst which the Trastuzumab antibody that targets ErbB2 extracellular domain. The C-terminal tail of ErbB2 (CtErbB2) has been widely ignored in these studies. Since it is intrinsically disordered, the concepts and tools to study it have only emerged in the last few years.In the present work, I have performed the structural and dynamic study of CtErbB2. I showed that despite its lack of any stable structure, this proline-rich region exhibits several transient secondary structures and a long-range contact that might participate in the regulation of its intra- and inter-molecular interactions. Then, I characterized the adaptor protein Grb2, which is a partner of ErbB2 that is essential for the activation of the MAPK pathway. The solution organization of the domains of this modular protein in its apo-form was unknown so far. I also studied the interaction between Grb2 and CtErbB2, showing that in addition to the known SH2-phosphotyrosine interaction, a polyproline motif of CtErbB2 binds to the N-terminal SH3 domain of Grb2. Finally, I implemented several strategies to phosphorylate CtErbB2 tyrosines, to study more extensively the effect of phosphorylation on the whole tail.

Les protéines U2AF65, CAPERα, PUF60 et SPF45 sont des facteurs d'épissage qui possèdent des domaines similaires appelés UHM et qui interagissent pendant les étapes précoces de l'épissage avec des protéines qui possèdent des domaines ULM, comme SF3b155. Par des approches biochimiques, nous avons mis en évidence la formation d'assemblages macromoléculaires par U2AF65 et CAPERα au contact du domaine multi-ULM de SF3b155. En diminuant les taux d'expression des facteurs d'épissage à domaines UHM avec des shRNA et en analysant par qPCR l'épissage de 65 exons cassette, nous avons identifié un rôle activateur de CAPERα, U2AF65 et PUF60 et un rôle répresseur de SPF45 dans l'épissage. Plus particulièrement, CAPERα et U2AF65 activent l'épissage des exons cassette présentant des séquences flanquantes en 5' riches en motifs polypyrimidine. De plus, ces séquences favorisent la formation des assemblages macromoléculaires de U2AF65 et CAPERα. Appuyés par ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel des interactions multivalentes conduisent à la formation d'assemblages macromoléculaires par CAPERα et U2AF65 ; ces complexes ont une affinité particulière d'une part pour les séquences introniques riches en motifs polypyrimidine et d'autre part avec le domaine multi-ULM de SF3b155. L'ensemble de ces interactions favorise la reconnaissance des sites 3' d'épissage. / U2AF65, CAPERα, PUF60 and SPF45 are splicing factors that hold similar domains called UHM that interact during the early splicing steps with ULM domains proteins, such as SF3b155. Using biochemical approaches, we highlighted the formation of macromolecular assemblies by U2AF65 and CAPERα in contact with the multi-ULM domain of SF3b155. The inhibition of the expression of the UHM splicing factors by shRNA, followed by a qPCR analysis of 65 cassette exons led us to identify an activating role of CAPERα, U2AF65 and PUF60 and a repressing role of SPF45 in splicing. Particularly, CAPERα and U2AF65 activate splicing of cassette exons presenting long pyrimidine-rich 5' flanking regions. Moreover, these regions favor the formation of macromolecular assemblies of U2AF65 and CAPERα. On the basis of these results, we propose a model in which multivalent interactions lead to CAPERα and U2AF65 macromolecular assemblies; these assemblies present a particular affinity on one hand for long pyrimidine-rich introns and on the other one for the multi-ULM domain of SF3b155. All these interactions promote 3' splice sites recognition.

Plusieurs études ont démontré que le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) possède la propriété d’incorporer diverses protéines de la cellule-hôte. Certaines observations indiquent que ce processus d'incorporation est sélectif. Cependant, les mécanismes expliquant la sélectivité des protéines incorporées demeurent largement inconnus. Les travaux présentés ciblent l'identification du facteur responsable de l'incorporation sélective de la protéine cellulaire ICAM-1 par le VIH-1. Parallèlement, nous avons évalué la sensibilité des virus porteurs de l’ICAM-1 à l’action de l’inhibiteur de fusion, T-20. Un système de transfection et d'expression transitoire a été utilisé afin de produire des particules virales isogéniques avec ou sans l’ICAM-1, et de certains de ses variants. Ce système nous a permis de démontrer que le VIH-1 s’approprie la molécule d’adhésion ICAM-1 par un processus indépendant de l’enveloppe virale (Env), mais dépendant de la portion intracytoplasmique de l’ICAM-1. Cette incorporation serait dirigée par une interaction directe ou indirecte entre la molécule d’adhésion et le précurseur immature Gag du VIH-1. Par ailleurs, la présence de l’’ICAM 1 sur le VIH-1 augmente la résistance des virions à l’action du T-20 en accélérant la cinétique de fusion du virion. La présence de l’ICAM-1 à la surface des virions et son rôle dans le cycle réplicatif du VIH 1 sont très importants dans la pathogenèse du VIH-1. / INTRODUCTION Previous works have indicated that incorporation of surface glycoprotein into retroviruses such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is not a highly specific process since several cellular glycoproteins can be inserted within the mature viral particle. The mechanism(s) that govern the acquisition of such host constituents have remained so far elusive. OBJECTIVES We have examined the molecular basis, associate to ICAM-1 localization and structural viral proteins responsible for the selective incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 within HIV-1. We also investigated whether sensitivity to the newly developed fusion inhibitor T-20 is affected by incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 in HIV 1. METHODS We have first investigated the role played by the viral envelope (Env) of HIV-1 in the acquisition of host ICAM-1. The incorporation process of ICAM-1 was also investigated by using different ICAM-1 constructs in which both transmembranes and intracytoplasmic tails were modified. These investigations were performed in combination with virus capture and immunoprecipitation studies, Western blot, confocal microscopy analyses, and infectivity assays. We finally used laboratory isolates of HIV-1 (X4- and R5-tropic) either lacking or bearing ICAM-1 as well as clinical variants into infectivity tests to both evaluate their respective IC50 for the fusion inhibitor and to understand the mechanism of resistance bring by the presence of this host molecule. RESULTS Mutation in the matrix (MA) domain or on Env-deficient viruses produced either in immortalized or primary human cell lines does not affect the incorporation of ICAM-1 by HIV-1. However, the incorporation seems to be conducted by the cytosolic tail of ICAM-1. Further experiments suggested that there is an association – direct or indirect – between ICAM-1 and virus-encoded Pr55Gag. We also demonstrate that ICAM-1-bearing virions are more resistant to T-20 than isogenic HIV-1 particles lacking this host adhesion molecule probably based on a reduction of the kinetic window during which the viral envelope is sensitive to T-20. CONCLUSION This study represents the first demonstration that structural Gag polyproteins mediate the uptake of a host-derived cell surface constituent (ICAM-1) by interacting directly with its cytoplasmic domain or by interacting with a partner into the cytosol. This observation describes a new strategy by which HIV-1 can modulate its replicative cycle considering that insertion of ICAM-1 within nascent virions has been shown to affect virus life cycle and also the sensitivity to the newly develop class of inhibitor including T-20.

La transcription par l’ARN polymérase II (ARNP II) est un mécanisme promiscuitaire à l’origine d’évènements transcriptionnels hasardeux, qui génèrent continuellement des transcrits aberrants dans la cellule. L’organisation précise du matériel génétique sous forme de chromatine est cruciale pour améliorer la précision de l’ARNP II en orientant sa fonction pour limiter ses erreurs et empêcher cette transcription cryptique. La structure chromatinienne est très dynamique et plusieurs mécanismes moléculaires coopèrent afin de déstabiliser les nucléosomes en amont de l’ARNP II, pour autoriser la lecture de l’ADN, et de les reconstituer dans son sillage, pour maintenir l’organisation chromatinienne du génome. De façon intéressante, une fonction potentielle de la caséine kinase 2 (CK2) dans la dynamique de la chromatine est suggérée dans la littérature. CK2 est une protéine kinase essentielle, conservée chez les eucaryotes, et impliquée dans des processus cellulaires variés. Dans notre étude, nous explorons le rôle de CK2 dans les modulations de la chromatine associées à la transcription. Nous avons démontré que CK2 phosphoryle le chaperon d’histones Spt6, régulant ainsi sa stabilité et sa fonction d’organisateur chromatinien. L’inactivation de cette voie de régulation conduit à l’accumulation considérable de transcrits cryptiques provenant d’initiations opportunistes intragéniques sens et antisens. La phosphorylation de Spt6 par CK2 favorise le recyclage des histones H3/H4 en 3’ des régions codantes et participe ainsi à la conservation de la structure de la chromatine lors de la transcription et à la suppression de la transcription cryptique. Notre étude suggère en outre que les fonctions de CK2 dans la modulation de la chromatine et la précision transcriptionnelle pourraient s’étendre au-delà de la régulation de Spt6, via la modulation de facteurs tels que les complexes PAF ou FACT. Enfin, nous proposons que la suppression de la transcription cryptique par CK2 contribue à optimiser la transcription afin d’améliorer la réponse transcriptionnelle à des stress extérieurs. L’ensemble de notre étude montre que CK2 stimule la précision transcriptionnelle en régulant directement Spt6 et probablement d’autres facteurs impliqués dans le maintien co-transcriptionnel de la chromatine. Ce mécanisme est crucial pour préserver le programme d’expression du génome et favorise la plasticité et l’efficacité de la réponse transcriptionnelle aux signaux de stress, nécessaires à l’adaptation de la cellule à son environnement. / Transcription by RNA polymerase II (RNAPII) is pervasive and aberrant transcripts are permanently generated within cells. Precise and controlled genomic organization in chromatin structure is essential to improve RNAPII accuracy and prevent cryptic transcripts accumulation. Chromatin structure is highly dynamic during transcription, unfolded to give access to DNA and refolded back in the wake of RNAPII to prevent spurious transcription. Multiple mechanisms act together to make this process highly efficient. Casein Kinase 2 (CK2) is a protein kinase ubiquitously present among eukaryotes and implicated in various important cellular processes. Interestingly, a potential function of this kinase in chromatin dynamics through the regulation of chromatin factors has previously been suggested. In this study, we address the role of CK2 in chromatin modulations associated with transcription. We found that CK2 depletion from yeast cells results in an increase of histone turnover in 3’ of transcribed regions and spurious transcription from cryptic promoters. Interestingly, we demonstrate that CK2 modulates directly Spt6 histone chaperone stability and function. This regulation promotes histone recycling during transcription elongation and maintain chromatin organization within coding regions, thereby inhibiting cryptic intragenic and antisense transcription. Our study also suggests that CK2 suppression of spurious transcription extend beyond Spt6 regulation. Indeed, we describe that additional role of CK2 with respect to spurious transcription could be related to its regulation of RNAP II activity through CTD Ser2 phosphorylation. Chromatin regulators such as PAF complex and FACT could also be involved in this regulation process. Finally, we propose that CK2 suppression of spurious transcription is essential for transcriptional optimal and efficient responses to environmental signals. Altogether, our data highlights CK2 signaling pathway as a regulator of transcription accuracy by affecting the essential histone chaperone Spt6, and probably other factors directly involved in the transcriptional process. This mechanism is important to the suppression of cryptic transcription in steady state conditions but also seems to contribute to the fitness of an optimal cellular response to stress signals.