Les estrogènes contribuent au contrôle de l'expression de nombreux gènes cibles en interagissant avec les Récepteurs aux Estrogènes (RE). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription qui interagissent avec une séquence cis-régulatrice, appelée Elément de Réponse aux Estrogènes (ERE). Un criblage de molécules capables de lier les RE et de moduler l'expression génique apporte un intérêt thérapeutique (ménopause, cancers hormonodépendant) et des intérêts dans les domaines de la santé publique et de l'écologie (perturbateurs endocriniens). Nous avons développé deux modèles de biocapteurs reposant sur le principe de Résonance Plasmonique de Surface. Une telle démarche permet de réduire le coût et le temps expérimental nécessaire au criblage d'une chimiothèque. Par ailleurs, la validation de l'utilisation de tels outils nécessite la corrélation des résultats à ceux obtenus à l'aide d'un modèle biologique plus complexe. Ainsi, nous avons développé, un modèle de cellules humaines de cancer du sein (MCF-7) transfectées par un vecteur rapporteur. La mise en place en parallèle de ces deux modèles a permit d'identifier un nouveau phytoestrogène agoniste de REa : la 7-O-ß-Dglucopyranolychrysine. L'un de nos biocapteurs est compatible avec l'étude des interactions protéines/protéines. Nous avons donc appliqué ce modèle à la recherche de partenaires de la protéine GEC1 codé par un gène régulé par les estrogènes. En conclusion, nous avons développé en parallèle des biocapteurs ADN/protéine et un modèle cellulaire permettant l'identification de xénoestrogènes (7-O-ß-D-glucopyranolychrysine), ainsi qu'un biocapteur protéines/protéines permettant le criblage de partenaires protéiques.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent, dans nos contrées, une cause importante de handicap et de mortalité. Les approches thérapeutiques restent toutefois relativement impuissantes face à ce problème de santé publique. Elles reposent essentiellement sur la prévention ou la suppression de facteurs de risques tels que le tabagisme, l'hypertension ou encore l'hypercholestérolémie. L'AVC peut être hémorragique, mais dans 80% des cas son origine vasculaire est obstructive. Son traitement aigu peut dans ce cas bénéficier d'agents thrombolytiques dont l'administration est cependant soumise à une fenêtre d'intervention immédiate relativement étroite. L'efficacité d'agents neuroprotecteurs, dont la finalité est de protéger le cerveau des conséquences délétères de l'ischémie/reperfusion cérébrale inhérente à l'AVC (lésions irréversibles et handicap), reste aujourd'hui assez décevante.<br>La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques s'impose dès lors plus que jamais dans ce domaine. S'intéressant aux protéines dont la concentration peut varier au cours du temps, une étude protéomique préliminaire a mis en évidence l'augmentation de la protéine disulfure isomérase (PDI) au cours de l'ischémie reperfusion cérébrale (IRC), un résultat en accord avec les données de la littérature (Tanaka, S., Uehara, T., Nomura, Y., 2000, J. Biol. Chem. 275, 10388-10393). La PDI est une protéine chaperonne dotée d'une activité oxydoréductase/isomérase et est principalement localisée dans le réticulum endoplasmique. Elle assiste le repliement des protéines par la formation ou le déplacement de ponts disulfures.<br>Les agents modulateurs de la PDI incluent l'alcool 4-hydroxybenzylique<br>(4-HBA) et la bacitracine, respectivement inducteur et inhibiteur de cette protéine. Pour déterminer le rôle potentiellement bénéfique ou délétère de la PDI dans l'IRC, l'impact cérébral des modulateurs précités a été étudié dans un modèle murin d'IRC basé sur l'occlusion unilatérale et transitoire de l'artère cérébrale moyenne chez la souris. Dans ce modèle expérimental, le 4-HBA réduit significativement (respectivement de 22 et 55%). la taille de l'infarctus cérébral touchant le cortex et le striatum. L'implication de la PDI dans cette protection cérébrale est confirmée par la suppression de l'effet protecteur du 4-HBA par la bacitracine, le 4-HBA ne manifestant par ailleurs aucune propriété anti-oedémateuse dans le modèle expérimental d'IRC. L'induction de la PDI par le 4-HBA a elle été démontrée sur le cerveau sain de souris, la protéine étant quantifiée par immuno-chemiluminescence après migration électrophorétique (Western blots). Différents isomères de position (alcool 2-hydroxybenzylique et alcool 3-hydroxybenzylique) ainsi que des analogues aliphatiques (1,4-butanediol et 1,5-pentanediol) du 4-HBA se sont avérés, à l'inverse du dernier, incapables de réduire la taille des lésions cérébrales dans le modèle expérimental d'IRC et d'induire la PDI cérébrale.<br>Le potentiel neuroprotecteur du 4-HBA a été étudié dans un autre modèle d'évaluation, à savoir celui des crises audiogènes chez la souris déficiente en magnésium, connu pour sa réponse aux agents anticonvulsivants mais aussi aux composés antioxydants (Vamecq, J., Maurois, P., Bac, P., Bailly, F., Bernier, J.L., Stables, J.P., Husson, I.,Gressens, P., 2003, Eur. J. Neurosci. 18, 1110-1120). La dose de 4-HBA protégeant 50% des animaux vis-à-vis de la crise audiogène était de 25 mg/kg contre 35mg/kg pour la 6-hydroxyflavanone (6-HFN), une flavone de référence active dans ce test. Ces résultats suggérant un potentiel antioxydant similaire des deux composés ont conduit à une étude comparative de leurs effets protecteurs dans le modèle murin d'IRC. Cette étude tout en confirmant la protection offerte par le 4-HBA dans l'IRC expérimentale a révélé l'incapacité du 6-HFN d'induire une protection significative dans ce modèle. A l'inverse du 4-HBA, le 6-HFN n'induisait pas la PDI cérébrale murine, confortant ici l'hypothèse que la protection du 4-HBA vis-à-vis de l'IRC résulte plus de sa capacité à induire la PDI que d'autres de ses propriétés parmi lesquelles son potentiel antioxydant. Finalement, le 4-HBA, à des doses atteignant 200 mg/kg, s'est avéré dénué de toxicité dans le test de la barre tournante.<br>En conclusion, le 4-HBA représente un agent neuroprotecteur actif dans plusieurs modèles d'évaluation. Son efficacité vis-à-vis des lésions induites par l'IRC semble étroitement liée à sa capacité à induire la PDI cérébrale, faisant dès lors de cette protéine une cible pharmacologique prometteuse pour le développement pharmacologique de composés actifs dans l'AVC.

Lors de mon cursus universitaire à Orsay, j'ai eu l‘opportunité de suivre des enseignements variés, tous (ou presque ...) dispensés avec passion. Ces professeurs m'ont conforté dans mon amour de la Science, avec un intérêt tout particulier pour l'étude des systèmes complexes : la compréhension du fonctionnement de la cellule, de l'organe et de l'individu m'apparaissait alors riche de mille promesses !<br />J'ai lu avec intérêt les deux volumes du “Heller”, captivé par l'ingéniosité de nos aînés pour élucider le fonctionnement des plantes. Toutefois, déjà à l'époque, je ressentais une certaine frustration car l'analyse s'arrêtait à un niveau “descriptif”. Je rêvais de pouvoir descendre à un niveau “explicatif” (par la suite, j'ai appris qu'on disait “moléculaire”). Imaginer un instant qu'on puisse un jour visualiser la cascade d'interactions moléculaires qui va de l'application de l'acide abscissique à la chute des feuilles me comblait d'aise.<br />Comprendre cet enchaînement nécessite d'appréhender le fonctionnement de chacune des protéines impliquées, or ces fonctions sont portées par les structures tridimensionnelles des protéines. C'est là que tout devient plus compliqué ! En effet, il suffit de consulter les bases de données et d'y comparer l'abondance relative des structures primaires de protéines à celle des structures tertiaires pour mesurer la difficulté d'aborder la troisième dimension ! Même avec les progrès réalisés au tournant du millénaire, déterminer toutes les structures 3D de toutes les protéines étudiées semble hors de portée. On réalise alors le grand intérêt de construire une “Pierre de Rosette” qui fera correspondre structures primaires, structures tertiaires et fonctions. De même qu'on sait déjà traduire une séquence de nucléotides en une séquence d'acides aminés, il est primordial de percer les lois qui nous permettront de replier une séquence d'acides aminés en une structure tridimensionnelle. Nous pourrons ainsi, à moindre effort, obtenir les structures 3D in silico, en analyser le fonctionnement et les interactions. Cela est d'autant plus important en cette ère de post-génomique qui voit s'accumuler des milliers de séquences inconnues, issues des programmes de séquençage systématique.

Malgré son implication importante dans de nombreux processus environnementaux, la matière organique naturelle (MON) reste mal caractérisée, principalement à cause du caractère réfractaire des structures dans lesquelles elle est impliquée. Si des fonctions amides ont été mises en évidence dans la MON, la structure moléculaire des unités associées est encore inconnue. La pyrolyse couplée à la chromatographie gazeuse et à la spectrométrie de masse (Py-GC-MS) en présence de Tetra-Methyl-Ammonium Hydroxyde (TMAH) est a priori un outil pertinent pour l'analyse de ces structures. Pour mieux comprendre le comportement des structures azotées de la MON au cours de la Py-GC-MS/TMAH, nous avons étudié par cette méthode, les 20 acides aminés protéiques, 17 dipeptides, 4 polypeptides et une protéine, la Sérum Albumine Bovine (SAB). Cette étude a permis de mettre en évidence les principaux mécanismes de pyrolyse des acides aminés (méthylation directe, cyclisation, dimérisation, homolyse, décarboxylation, et déamination), et l'influence de la liaison peptidique sur ces mécanismes. La Py-GC-MS/TMAH des dipeptides et des polypeptides a montré l'importance des produits de cyclisation, en particulier des diketopiperazines et de structures plus complexes basées sur 3 acides aminés, et des produits d'homolyse pour les acides aminés aromatiques. De plus, cette étude a permis d'établir une base de données des produits de pyrolyse des acides aminés et des 17 dipeptides. Enfin, la pyrolyse de la SAB en mélange avec les deux principales macromolécules présentes dans la biomasse (lignine et cellulose) montre que les coefficients de réponse sont défavorables à la protéine.

L'objectif de ce travail était d'étudier les interactions entre une protéine modèle, l'albumine de sérum bovin (BSA), et la surface d'un acier inoxydable ferritique, le Fe-17Cr, lors des toutes premières étapes de formation de la couche d'oxyde en solution aqueuse. Différents paramètres ont été testés : potentiel (potentiel de corrosion Ecor et potentiel passif), pH (compris entre 1,3 et 10) et absence/présence d'ions chlorures en solution. Pour atteindre cet objectif, des méthodes électrochimiques (courbes de polarisation, spectroscopie d'impédance électrochimique (SIE)) et la spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X (XPS) ont été couplées. En absence de chlorures, les mesures d'impédance révèlent une inhibition de la corrosion par la BSA, à pH 1,3 et Ecor. Les analyses XPS montrent que la couche de BSA adsorbée sur la surface d'acier inoxydable (molécules chimiquement intactes ; épaisseur d'environ 4 nm) n'a d'effet ni sur la composition chimique ni sur l'épaisseur des couches d'oxyde et d'hydroxyde. Par conséquent, l'inhibition de la corrosion mise en évidence à pH 1,3 et Ecor est due à la protéine elle-même et non pas à un changement de composition chimique et/ou d'épaisseur des couches de surface. En présence de chlorures (NaCl 0,5M), la protéine accélèrerait la corrosion localisée du Fe-17Cr passivé à pH 5,5 ; de plus, le potentiel de piqûration Ep est plus faible quand la passivation et l'exposition à la BSA sont simultanées. Le potentiel de piqûration est d'autant plus cathodique que la quantité de protéine adsorbée est importante.

Les adénovirus sont des virus icosaédriques non enveloppés à ADN double brin. Bien que ces virus soient très étudiés dans le but d'une application possible en thérapie génique, le manque de connaissances fondamentales, notamment structurales, est probablement à l'origine du faible succès rencontré lors des premiers essais effectués. Dans le cadre d'un programme général d'étude structurale des protéines de l'adénovirus, nous nous sommes intéressés aux protéines mineures et particulièrement à la protéine IX. Cette dernière est localisée sous forme de 4 trimères au centre de chaque face du virus. Grâce à des reconstructions 3D à partir des images de cryo-microscopie électronique, d'une part, d'un adénovirus humain décoré par des Fabs ciblant le domaine C-terminal de la protéine IX et, d'autre part, d'un adénovirus canin dans lequel le domaine C-terminal de la protéine IX a été fusionné avec la GFP, nous avons pu localiser le domaine C-terminal à la surface de la capside. En combinant ces résultats avec des données biophysiques obtenues pour différents mutants de la protéine IX, nous avons proposé un modèle de son intégration au sein de la capside. Nous avons en particulier montré que la protéine IX formait un maillage localisé entre les différents capsomères.<br /> Nous nous sommes également intéressés à une autre protéine structurale de l'adénovirus : la tête de fibre courte de l'adénovirus aviaire. Nous avons résolu la structure cristallographique de cette protéine à 2 Å de résolution. Cette structure a été comparée avec d'autres structures de tête de fibre d'adénovirus déjà connues. Nous avons pu en déduire que, malgré de faibles homologies de séquences, les structures tertiaire et quaternaire des têtes de fibre étaient conservées au sein de la famille des adénovirus. La construction d'un arbre phylogénique basé sur les structures atomiques des têtes de fibre nous a permis de mettre en évidence une nouvelle filiation entre les adénovirus infectant différentes espèces. La structure a également conduit à des hypothèses quand à la nature des récepteurs cellulaires de l'adénovirus aviaire.<br />La troisième protéine structurale à laquelle nous nous sommes intéressés est la base du penton de l'adénovirus humain de sérotype 3. Cette protéine pentamérique peut s'associer par douze pour former un assemblage hautement symétrique : le dodécaèdre. Grâce à leur cavité de 80Å et leur capacité à entrer dans les cellules, ces particules dodécaédriques ont été proposées comme véhicule de transfert de gène en thérapie génique potentielle. Nous avons réussi récemment à améliorer des cristaux de cet assemblage pour arriver à une diffraction des rayons X allant jusqu'à une résolution de 3.5 Å. La résolution de la structure est en cours.

Un dérivé phosphorylé covalent stable de la Ca-ATPase du réticulum sarcoplasmique est obtenu à partir de la protéine modifiée par le FITC. Nous avons produit de façon reproductible, des cristaux de type tubulaire de ce dérivé phosphorylé cuvaient stable, à partir de vésicules de réticulum sarcoplasmique natives. Après un traitement d'image de clichés de cryomicroscopie électronique, nous avons calculé la première structure tridimensionnelle d'un dérivé phosphorylé covalent stable d'une ATPase de type P à 8À de résolution. La comparaison de cette nouvelle structure avec les autres structures existantes de la Ca-ATPase, suggère certaines modifications notamment au niveau ou positionnement des domaines cytoplasmiques. Des expériences de trypsinisation et de chromatographie sur une colonne agarose-Red120, ont permis d affiner ces observations. Les liens entre ces moditications structurales et le mécanisme de transport de calcium couplé à l'hydrolyse d ATP sont discutés.

La toxine diphtérique (DT) une toxine bactérienne sécrétée par Corynebacterium diphtheriae. Lors de l'intoxication d'une cellule, le domaine de translocation (T) de la DT s'insère dans la membrane à pH acide et assiste la translocation du domaine catalytique (C) dans le cytosol. Le domaine T adopte une conformation en molten globule (MG) et devient compétent pour l'interaction membranaire. Nous avons identifié par mutagenèse les résidus du domaine T dont la protonation favorise la formation de l'état MG en solution et l'interaction membranaire. Les résultats montrent que la protonation concertée des six histidines du domaine T est impliquée dans la formation de l'état MG en solution. La paire His223-257 et l'His251 ont un effet prépondérant dans la formation de l'état molten globule en solution, alors que la paire His322-323 (mais également His251) est davantage impliquée dans l'interaction avec la membrane, et en particulier la liaison à la membrane.<br />Nous avons étudié les changements de conformation des deux domaines C et T dans une protéine CT correspondant à la DT tronquée de son domaine R, afin de comprendre les effets du lien covalent sur les conformations respectives de C et T en fonction du pH. Les mutants CTW50/153F et CTW206/281F ont permis de suivre la fluorescence des Trp de chaque domaine dans la protéine CT. Les<br />résultats montrent que le domaine T dirige la translocation de C dans les premières étapes de la translocation (formation de l'état MG, liaison et insertion membranaire), et qu'il pourrait jouer un rôle de chaperon en stabilisant l'état MG du domaine C.

Les interactions protéine–protéine jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement cellulaire et sont impliquées dans diverses pathologies. L'étude de ces interactions est donc primordiale. Nous avons entrepris de développer une méthode de « footprinting » basée sur la différence d'accessibilité à l'eau des acides aminés d'une protéine selon qu'elle est seule ou en interaction. Le principe de cette méthode de caractérisation des zones d'interactions protéine–ligand, est basé sur une étape de génération de radicaux carbo-centrés sur les chaînes latérales des acides aminés de la protéine, et sur une étape de réparation de ces radicaux par un atome de tritium.<br /> <br />La première étape a été de déterminer la réactivité des 20 acides aminés communs vis-à-vis de notre méthode : <br />Lys>Leu>Arg>Ile>Trp>Phe>Val>Cys>Met>His>Tyr>Glu>Thr>Asp><br />Gln>Pro>Ala>Asn> Ser>Gly. Notre méthode ensuite appliquée à l'étude du complexe entre la protéine hAsf11-156 et un fragment de l'histone H3 a permis de caractériser sans ambiguïté les trois résidus principaux de H3 (L126, R129 et I130) impliqués dans cette interaction. De plus, nous avons mis en évidence que notre méthode de caractérisation des interactions protéique est à la fois sensible aux phénomènes d'interaction et de repliement.

Le diagnostic biologique des maladies à prions du vivant du patient repose sur la recherche de protéine 14.3.3 dans le liquide céphalo-rachidien. Le dosage conjoint de la néoptérine permet d'améliorer nettement sa spécificité. Cependant, les performances analytiques ne sont pas suffisantes pour établir un diagnostic de certitude. Dans la quête d'un marqueur supposé plus spécifique, nous avons recherché la protéine prion pathologique résistante à la protéinase K (PrPres) dans le nerf péronier. Malgré l'optimisation de notre méthode, nous ne l'avons détecté que dans un cas sur trois. Cela nous a conduit à utiliser et valider la streptomycine comme ligand exogène pour concentrer la PrPres. Nous avons démontré sa capacité à concentrer la PrPres d'origine cérébrale et amygdalienne; sa sensibilité analytique s'avère être équivalente, pour une faible quantité de tissu initiale (5 mg), à celle de l'acide phosphotungstique. Par ailleurs, nous avons pu correctement classer, à partir d'un nombre significatif d'échantillons cérébraux, les patients EST des patients non atteints d'une EST avec une sensibilité et une spécificité de 100 %. Ainsi, nous disposons d'un outil susceptible d'augmenter la sensibilité des techniques initialement utilisées pour détecter la PrPres dans des nerfs facilement accessibles par biopsie.