Le diagnostic de la maladie d'Alzheimer (MA) est tardif et présente un manque de fiabilité en regard de l'examen neuropathologique postmortem permettant de confirmer ce diagnostic. En effet, les présentations cliniques de la MA peuvent être multiples et parfois atypiques. Des anomalies dans les concentrations des protéines tau, tau phosphorylées et amyloïdes bêta, au sein du liquide céphalorachidien (LCR), ont permis d'améliorer le diagnostic du vivant du patient. Nous avons évalué la performance de ces marqueurs, dans le LCR, utilisés pour le diagnostic de la MA dans les formes syndromiques atypiques. L'utilisation de ces marqueurs augmente la précision du diagnostic lors de ces différentes présentations cliniques. De plus, nous avons mis au point un test diagnostic biochimique postmortem des différentes tauopathies permettant de mieux les caractériser en complément de l'examen neuropathologique. Enfin, nous avons conçu et caractérisé des anticorps spécifiquement dirigés contre la protéine tau phosphorylée en position 231. Cet outil nous a permis de développer un test ELISA dans le LCR. Des résultats préliminaires suggéreraient une interaction in vivo entre les protéines tau et Prion. Ces résultats, décrits pour la première fois, sont corrélés à nos observations histologiques.

Les cellules épithéliales sont à la base de nombreuses fonctions vitales chez les mammifères, en particulier grâce à leurs propriétés de polarisation et de cohésion dynamiques regroupées sous le terme de « Plasticité Epithéliale ». Une manifestation originale de cette plasticité est la Transition Epithélio-Mésenchymateuse (EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition), un processus complexe qui permet à une cellule épithéliale (ou un groupe de cellules) de modifier sa composition et l'organisation de ses protéines pour se détacher de la masse cellulaire à laquelle elle appartient, et ainsi acquérir une organisation de type fibroblastique propice à la motilité cellulaire. Ce phénomène, initialement mis en évidence pour son rôle dans le développement embryonnaire, met en jeu une régulation fine, sous le contrôle de facteurs de transcription dont certains semblent également jouer un rôle au cours de la progression tumorale. Le facteur SNAIL1 (ou SNAIL), dont le rôle est déterminant au cours de la mise en place de nombreux organes, est également fortement exprimé au niveau du front invasif de certains carcinomes et pourrait participer à la dissémination des cellules cancéreuses au sein de l'organisme. Au cours de l'EMT, son expression, sa localisation et son activité sont soumises à une régulation complexe qui implique plusieurs modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes de régulation de SNAIL1 par la protéine-kinase CK2 au cours de l'EMT. Ce travail a été réalisé en deux étapes dont la première fût une caractérisation biochimique de la phosphorylation de SNAIL1 par CK2 et sa régulation par la sous-unité régulatrice CK2β. Dans un deuxième temps, je me suis penché sur l'étude des conséquences de l'inhibition du complexe CK2 par ARN interférence dans les cellules épithéliales mammaires MCF10A. Ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle déterminant de CK2β dans le maintien de l'expression d'un phénotype épithélial et d'une architecture cohésive au sein des cellules MCF10A en culture in vitro. L'ensemble de ces résultats suggère en effet que la protéine-kinase CK2, sous le contrôle de sa sous-unité régulatrice CK2β, exerce une régulation négative sur le niveau d'expression transcriptionnelle et la stabilité protéique de SNAIL1 visant à s'opposer à l'induction de l'EMT.

La compréhension et la prédiction des relations structure-fonction de protéines par des approches in sillico représentent aujourd'hui un challenge. Malgré le développement récent de méthodes algorithmiques pour l'étude du mouvement et des interactions moléculaires, la flexibilité de macromolécules reste largement hors de portée des outils actuels de modélisation moléculaire. L'objectif de cette thèse est de développer une nouvelle approche basée sur des algorithmes de planification de mouvement issus de la robotique pour mieux traiter la flexibilité moléculaire dans l'étude des interactions protéiques. Nous avons étendu un algorithme récent d'exploration par échantillonnage aléatoire, ML-RRT pour le désassemblage d'objets articulés complexes. Cet algorithme repose sur la décomposition des paramètres de configuration en deux sous-ensembles actifs et passifs, qui sont traités de manière découplée. Les extensions proposées permettent de considérer plusieurs degrés de mobilité pour la partie passive, qui peut Æetre poussée ou attirée par la partie active. Cet outil algorithmique a été appliqué avec succès pour l'étude des changements conformationnels de protéines induits lors de la diffusion d'un ligand. A partir de cette extension, nous avons développé une nouvelle méthode pour la résolution simultanée du séquenc¸age et des mouvements de désassemblage entre plusieurs objets. La méthode, nommée Iterative- ML-RRT, calcule non seulement les trajectoires permettant d'extraire toutes les pièces d'un objet complexe assemblé, mais également l'ordre permettant le désassemblage. L'approche est générale et a été appliquée pour l'étude du processus de dissociation de complexes macromoléculaires en introduisant une fonction d'évaluation basée sur l'énergie d'interaction. Les résultats présentés dans cette thèse montrent non seulement l'efficacité mais aussi la généralité des algorithmes proposés.

Les cytochromes P450 (P450) et la NADPH-cytochrome P450 réductase (CPR) sont les principaux acteurs du métabolisme des xénobiotiques chez les mammifères. La CPR est une protéine multidomaine formée de deux domaines catalytiques comprenant les cofacteurs FAD et FMN et reliés par un domaine de connexion. Grâce aux propriétés rédox de ses deux flavines, la CPR est capable de scinder le flux diélectronique du NADPH en deux transferts monoélectroniques vers les P450. Jusqu'alors, la CPR avait toujours cristallisé dans une conformation dite fermée, compatible avec un transfert interne du FAD au FMN, mais dans laquelle le FMN était tellement enfouie au cœur de la protéine qu'un transfert externe vers les P450 était inenvisageable. Le projet de cette thèse consistait à construire et analyser les caractéristiques structurales et biochimiques de CPR chimères constituées de domaines issues des CPR humaine et de levure. Ces chimères sont toujours fonctionnelles vis-à-vis d'accepteurs artificiels et naturels. Leurss constantes catalytiques, la vitesse des différents transferts d'électrons internes et externes, les potentiels standards de leurs cofacteurs ou encore leur stabilité vis-à-vis d'agents dénturants ou de la température ont été mesurés et comparés aux caractéristiques des CPR parentales. De plus, la structure cristallographique de l'une d'elle a pu être déterminée à 2,5 Å de résolution et dans une nouvelle conformation dite ouverte. Celle-ci prouve le caractère dynamique de cette protéine multidomaine, et pourrait correspondre à la conformation de la CPR au sein du complexe bimoléculaire CPR-P450 lors du transfert externe entre le FMN et le cytochrome. Les facteurs pouvant influencer ou dicter ces changements conformationnels ont été appréhendés grâce à des analyses d'enzymologie, de cinétiques rapides, de potentiométrie ou encore de dénaturation.

Le facteur hétérotrimérique e/aIF2 joue un rôle central dans le démarrage de la traduction chez les Eucaryotes et chez les Archées. Il conduit l'ARNt initiateur méthionylé jusqu'au ribosome et assure la spécificité de sélection du codon de démarrage sur l'ARNm. La structure cristallographique d'aIF2de l'archée Pyrococcus abyssi, précédemment résolue au laboratoire, a révélé une très forte homologie entre aIF2γ, qui constitue le coeur de l'hétérotrimère, et le facteur d'élongation bactérien EF1A. Cependant, possède des caractéristiques structurales propres qui pourraient être responsables de sa spécificité d'action dans le démarrage de la traduction. Une étape cruciale de ce travail a consisté à développer un test de suivi in vitro de l'association d'aIF2 au Met-ARNti Met. Ce test a permis d'évaluer l'importance des caractéristiques du Met-ARNti Met et la contribution de chacune des sous-unités de l'hétérotrimère dans la formation du complexe aIF2:Met-ARNti Met. Ainsi, il a été montré que le résidu méthionine constitue un déterminant majeur dans la reconnaissance du Met-ARNti Met par aIF2. D'autre part, il apparaît que la sous-unité seule est effectivement capable de lier l'ARNt selon un mode similaire à celui observé pour EF1A mais avec une affinité considérablement réduite par rapport à celle de l'hétérotrimère. Nous avons montré que la présence de la sous-unité αétait nécessaire pour retrouver une affinité optimale vis-à-vis de l'ARNt tandis que la sous-unité βne semble pas jouer de rôle dans cette liaison. L'utilisation d'une stratégie de découpage d'en domaines séparés a montré que c'est le domaine 3 d'aIF2qui lie la sous-unité par l'intermédiaire d'une boucle du domaine 2 de . De plus, le dimère D3semble nécessaire et suffisant pour retrouver une affinité pour l'ARNt comparable à celle du facteur natif. Dans un second temps, des cristaux de la sous-unité entière et d'une forme tronquée correspondant aux domaines 2 et 3 ont été obtenus. Les structures d'D2-3 et d'complet ont été résolues à respectivement 2.26 et 3.37 Å de résolution. L'analyse du modèle structural a révélé une mobilité du domaine 3 d'αpar rapport au bloc rigide formé par les domaines 1 et 2. La comparaison de séquences d'e/aIF2a montré que les zones de conservation d'se situaient principalement dans le domaine 1 et dans le domaine 3 de la protéine, qui possèdent tous les deux des propriétés générales de liaison des ARNs. Le domaine 1 d'αpourrait ainsi interagir avec un autre partenaire de type ARN du démarrage de la traduction, tel que l'ARNm ou l'ARN ribosomal. Finalement, des cristaux d'aIF2de Sulfolobus solfataricus ont été obtenus et la structure de l'hétérodimère a été résolue à 3.0 Å. Cette structure a confirmé les données biochimiques précédemment obtenues : le domaine 3 de la sous-unité interagit avec le domaine 2 de , au niveau de la boucle L1 précédemment caractérisée. L'analyse de cette structure a révélé pour la première fois une conformation des régions Switch de similaire à celle observée au sein du complexe EF1A:GDPNP:ARNt, ce qui permet d'expliquer la GTPdépendance de la fixation du Met-ARNti Met par aIF2. La comparaison de cette structure à celle d'EF1A suggère que seule γpourrait être en contact avec l'ARNt au sein de l'hétérodimère αγ. Le renforcement de l'affinité pour l'ARNt observé en présence d'αnous a conduit à envisager un rôle possible d'αdans l'établissement des conformations observées pour les régions Switch dans la structure d'aIF2γ.

Ce manuscrit décrit la synthèse et l'étude physico-chimique de tensioactifs innovants utilisés comme outils biochimiques pour le maintien et la cristallisation de protéines membranaires en solution aqueuse. Un premier chapitre présente les moyens techniques actuels à disposition pour la manipulation et l'étude des protéines membranaires ainsi que les problèmes rencontrés concernant leur inactivation et les alternatives actuelles. Une seconde partie décrit la synthèse d'un lipide hémifluoré possédant un ligand métallique spécifique, qui a été utilisé pour la formation d'un film de Langmuir. Les propriétés du film lipidique (stabilité et fluidité) ont été étudiées et des essais de cristallisation 2D suivant le concept interfacial ont été réalisés sur une protéine recombinante SUR1 « his tag » solubilisée dans des micelles de détergents hydrocarbonés. Le troisième chapitre aborde la notion d'amphiphilie faciale et décrit la synthèse de tensioactifs glucosidiques par « click chemistry » basés sur corps aromatique central. La persubsitution sélective de têtes hydrophiles sur les positions 1,3,5 et de parties hydrophobes sur les positions 2,4,6 apporte une amphiphilie aux molécules via une ségrégation faciale. Enfin, le dernier chapitre est dédié à l'étude du comportement et des propriétés physico-chimiques des tripodes amphiphiles faciaux en solution aqueuse grâce à différentes techniques : tensiométrie, diffusion de la lumière, CPLH,...

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité du cisplatine, puissante drogue anticancéreuse qui interagit avec l'ADN. Nous avons étudié in vitro certaines étapes clé des mécanismes moléculaires qui relient le fonctionnement du système de réparation MMR avec la cytotoxicité de cette drogue. Notre étude s'est focalisée sur l'interaction entre l'ADN platiné et la protéine MutS du système MMR impliquée dans les étapes d'initiation de la réparation. Trois points ont été abordés dans cette étude : i) la reconnaissance par MutS des lésions du cisplatin et des composés de lésion du cisplatine (formés lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux purines pontées par le platine) ii) l'étape d'initiation de la réparation régulée par la fixation d'ATP et d'ADP par la protéine MutS iii) l'étude d'un dérivé du cisplatine (DACH-platine) ne présentant pas de résistance croisée avec le cisplatine. Les principaux résultats ont été obtenus par des techniques électrophorétiques et par résonance plasmonique de surface. Notre étude montre que MutS joue le rôle d'un senseur des lésions du cisplatine et que l'ADN platiné peut jouer le rôle d'un cofacteur dans la régulation biochimique de l'activité de MutS en présence de nucléotides régulateurs. Nos résultats suggèrent que les composés de lésion des adduits majoritaires du cisplatine pourraient être les lésions critiques impliquées dans la cytotoxicité du cisplatine via le système MMR.

Adsorption of proteins at interfaces has an important role in biotechnological and pharmaceutical applications. Indeed, several undesirable processes are related to protein adsorption, as for example: fouling of contact lenses, clotting on blood contacting devices, triggering inammation around articial organs, diminished circulation time of therapeutic proteins and drug bearing liposomes. Neutral water soluble polymers, such as poly(ethylene glycol) (PEG), are used to repress protein adsorption: by coating the surface with a polymer brush, a "cushion" is created between the protein and the surface, that can reduce, or even completely repress the adsorption. Understanding the mechanism that inhibits the adsorption at interfaces is an active field of research, and could lead to relevant improvements in biomaterials performances and design. A clear understanding of the mechanism of protein adsorption onto polymer brushes is still missing. The first models describing the interactions of a polymer brush with adsorbing particles predicted two adsorption modes: primary adsorption at the grafting surface, and secondary adsorption at the outer edge of the brush (occurring for large cylindrical proteins). Primary adsorption can be repressed by increasing the grafting density of the brush, and secondary adsorption by increasing its thickness, in agreement with the experiments reported in the literature. But experimental evidences (a maximum in the adsorbed amount observed for long brushes) suggested then the existence of a third mode: ternary adsorption within the brush itself, due to attractive interactions between the protein and the brush. Standard techniques can in general only probe the total adsorbed amount. The aim of this work was to separate primary and ternary adsorption isotherms, by using neutron reectivity and deuterated proteins. As neutrons interact differently with hydrogen and deuterium atoms, the contrast between the hydrogenated brush and the deuterated protein is high enough to separate the two contributions. We studied the adsorption of deuterated myoglobin on PEG brushes with different degrees of polymerisation (N = 56, 146 and 770), and as a function of the area per grafted chain. The contribution of primary and ternary adsorption was separated for the different systems, and the adsorbed amount was extracted and the adsorption isotherms compared to the theoretical predictions. The ability to distinguish between the different adsorption modes, and the quantification of their relative contribution to the overall amount of adsorbed proteins, represents a major advance in optimising surface properties. In particular, the occurrence of ternary adsorption onto PEG brushes affects their status as tool for repressing protein adsorption. L’adsorption de protéines aux interfaces a un rôle important pour certaines applications pharmaceutiques ou biotechnologiques. En effet, plusieurs processus indésirables sont liés à l’adsorption de protéines, par exemple l’encrassement de lentilles de contact, la coagulation dans des appareils contenant du sang, l’inflammation d’organes artificiels ou encore la diminution du temps de circulation dans le corps de protéines ou liposomes thérapeutiques. Certains polymères, tels que le polyéthylène glycol (PEG), sont utilisés pour réprimer l’adsorption de protéines : en greffant une brosse de PEG sur la surface, une couche est créée entre la protéine et celle-ci qui diminue, voire même réprime complètement l’adsorption. Comprendre le mécanisme qui entrave l’adsorption aux interfaces est un sujet de recherche actif, qui pourrait mener à des améliorations significatives dans la conception de biomatériaux. À ce jour, la compréhension du mécanisme d’adsorption de protéines sur des brosses de polymère n’est pas claire. Les premiers modèles décrivant les interactions entre brosses de polymères et particules adsorbantes prédisaient deux modes d’adsorption : l’adsorption primaire sur la surface de greffage, et l’adsorption secondaire à l’extérieur de la brosse (pour les grandes protéines cylindriques uniquement). L’adsorption primaire peut-être réprimée en augmentant la densité de greffage de la brosse, et l’adsorption secondaire en augmentant son épaisseur, en accord avec les expériences reportées dans la littérature. Mais d’autres évidences expérimentales (un maximum dans la quantité adsorbée observé pour les brosses longues) ont ensuite suggéré l’existence d’un troisième mode : l’adsorption ternaire à l’intérieur même de la brosse, due aux interactions attractives entre la protéine et la brosse. Les techniques standards peuvent en général mesurer la quantité adsorbée totale. Le but de ce travail était de séparer les isothermes d’adsorption primaire et ternaire, en utilisant la réflectivité de neutrons et des protéines deutérées. Comme les neutrons interagissent différemment avec les atomes d’hydrogène ou de deutérium, le contraste entre la brosse hydrogénée et la protéine deutérée est ainsi suffisant pour séparer les deux contributions. Nous avons étudié l’adsorption de myoglobine deutérée sur des brosses de PEG avec différents degrés de polymérisation (N = 56, 146 and 770), en fonction de l’aire par chaîne Σ. La contribution des adsorptions primaire et ternaire put être séparée pour les différents systèmes, et les quantités adsorbées extraites pour finalement comparer les isothermes d’adsorption aux prédictions théoriques. La possibilité de distinguer les différents modes d’adsorption, et la quantification de leur contribution relative à la quantité totale de protéines adsorbées représente une avancée majeure dans l’optimisation des propriétés des surfaces. L’adsorption ternaire dans les brosses de PEG en particulier remet en question leur utilisation pour réprimer l’adsorption de protéines.

Depuis l'apparition du terme "biosensor" à travers un article de Lyons et Clark en 1962, les biocapteurs ont connu un véritable essor tant au niveau académique qu'industriel. Le principal objectif de ce travail de thèse était de créer une surface permettant l'immobilisation spécifique par liaison covalente de simple ou double brin d'ADN puis d'étudier les interactions pouvant exister entre une protéine donnée et l'ADN. Pour préparer la surface à cette immobilisation, nous avons opéré une réduction électrochimique de sel d'aryldiazoniums. Ce type de modification nous a permis de fixer de manière covalente sur la surface conductrice des fonctions de type Ar-SO2Cl. Par l'utilisation de la QCM et de l'AFM, nous avons pu par la suite détailler les mécanismes de fonctionnement de protéines (HsRad51 et Transposase) en interaction avec l'ADN simple ou double brin fixé, que ce soit d'un point de vue cinétique ou bien structural.

Le bactériophage T5 est un virus infectant E. Coli. L'assemblage et la maturation de sa capsidecomportent plusieurs étapes critiques pour la formation des virions lors du cycle infectieux.Parmi ces étapes, j'ai étudié les processus d'expansion et de décoration de la capside de T5.L'expansion implique d'importantes réorganisations conformationnelles des 775 sous-unités de laprotéine pb8 composant la capside, conduisant au doublement du volume de la capside qui peutalors contenir le génome du phage. J'ai déterminé des conditions physico-chimiques permettantd'induire l'expansion de la capside in vitro, puis j'ai effectué des expériences de SAXS résoluesdans le temps montrant que l'expansion est un processus hautement coopératif, qui conduit, en uneétape, à un état final remarquablement stable. D'autre part, j'ai réalisé une étude fonctionnelle de laprotéine de décoration pb10, montrant que sa fixation est un marqueur de l'expansion. Enfin l'étudestructurale de pb10 menée par SAXS a permis de déterminer un modèle à basse résolution de sonenveloppe moléculaire.