Ma thèse comporte deux volets: d’une part, le développement de ligands ciblant les protéines antiapoptotiques et d’autre part, l’étude par RMN des protéines CGC impliquées dans la biosynthèse de la congocidine, métabolite secondaire chez Streptomyces.La famille de protéines Bcl-2 est impliquée dans un des processus clé de la mort cellulaire programmée, appelée l’apoptose mitochondriale. Elle se divise en membres anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) et pro-apoptotiques (Bak, Bax et les «BH3»).Ces molécules vont réguler l’apoptose en maintenant ou non l’intégrité de la membrane mitochondriale. En réponse à un signal de stress, les «BH3» neutralisent les antiapoptotiques et activent les pro-morts, leur permettant de former des pores sur la membrane mitochondriale. Ce phénomène aboutit au relargage du cytochrome c dans le cytosol et à l’activation de la cascade des caspases dont la finalité est la destruction de la celluleLa pertinence de l’étude des Bcl-2 s’observe de manière croissante depuis les années 1990. En effet, une surexpression des membres pro-survie de cette famille (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BFL1 etc...) a été observée dans de nombreux cancers. Suite à ce constat, cibler ces molécules est devenue une piste prometteuse en cancérologie par le développement d’inhibiteurs des protéines pro-survie, l’objectif étant de restaurer l’apoptose dans les cellules tumorales.Dans cette perspective, différentes stratégies thérapeutiques ont été imaginées:(i) la thérapie génique avec l’Oblimersen, un ADN antisens développé par Genta, qui inhibe l’expression de la Bcl-2. Néanmoins, les résultats précliniques sont décevants.(ii) l’utilisation de peptides (ou peptidomimétiques) imitant les sentinelles «BH3» comme antagonistes de l’interaction Bcl-xL/Bak. Il faut souligner le concept des «stappled peptides», permettant la stabilisation des hélices par cyclisation des chaînes latérales. Si certaines de ces molécules synthétisées semblent très actives, aucune n’est encore en étude clinique.(iii) le développement de petites molécules non peptidiques, issues d’un criblage systématique in vitro ou in silico et se caractérisant par une grande variété structurale. Parmi ces molécules, certaines sont synthétiques comme l’ABT-737 et l’ABT-263 élaborés par les laboratoires Abbott, grâce à la méthode d’assemblage des fragments (fragment-based drug design) aidée par des études SAR by NMR (structure activity relationship). D’autres sont issues de produits naturels comme le (R)-Gossypol, le TW-37, la sanguinarine ou l’Obatoclax. En 2008, 11 composés étaient en phase préclinique ou clinique et les résultats pour certains d’entres eux semblaient plus prometteurs que pour l’Oblimersen.Ces stratégies ont permis de mettre au point un certain nombre de composés ciblant les protéines anti-apoptototiques. Si certains de ces composés sont actuellement en phase de tests cliniques, les plus prometteurs (ABT) ont démontré une efficacité uniquement vers certains des protéines anti-apoptotiques laissant place à un phénomène d’échappement des cellules cancéreuses.Un criblage réalisé à l’ICSN par l’équipe de F. Guéritte (Pôle Substances Naturelles Plantes) a permis d’identifier une nouvelle classe de molécules ayant une affinité de l’ordre du μM pour Bcl-xL. Parmi ces composés, deux présentent une attractivité d’un point de vue structural qui rend faisable leur synthèse chimique:(i) la meiogynine A, un sesquiterpène dimère de structure originale isolé des écorces de Meiogyne cylindrocarpa, une plante de Malaisie.(ii) le drimane, un sesquiterpène isolé en grandes quantités du genre zygogynum, une espècede Nouvelle-Calédonie.Ainsi, des collaborations ont été établies au sein de l’ICSN, réunissant diverses expertises (chimie, biologie, physicochimie et modélisation) afin de dégager les synergies souhaitables.Dans la perspective de la conception rationnelle d’analogues aux propriétés améliorées ciblant l’ensemble des membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, ma contribution est de choisir les cibles biologiques (Bcl-xL et Mcl-1), de les obtenir pures et marquées en isotopes stables afin de réaliser par RMN et modélisation moléculaire une étude structurale des complexes protéines/ligands et de définir un modèle d’interaction.Le deuxième volet de ma thèse, à dominante fondamentale, a pour objectif de caractériser par RMN les médiateurs enzymatiques d’une voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire, la congocidine issue des bactéries Streptomyces Ambofaciens.La congocidine présente des propriétés antivirales et anticancéreuses de par sa capacité à se fixer à l’ADN. Cependant, du fait de sa forte toxicité, cette molécule ne peut pas être utilisée directement à des fins thérapeutiques.L’analyse des groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse de la congocidine a mis en évidence 24 gènes. Seuls certains intermédiaires réactionnels ont été identifiés. Cependant, le rôle précis des produits de ces gènes n’est pas encore bien défini.Ainsi, en collaboration avec l’équipe de JL Pernodet à l’Université d’Orsay, nous nous sommes intéressés à deux enzymes en particulier intervenant dans la synthèse de la congocidine, les protéines CGC-10 et CGC-19.L’objectif de cette collaboration est d’utiliser la spectroscopie RMN couplée à la modélisation moléculaire sous contraintes expérimentales afin de déterminer la structure de ces deux protéines. Nous souhaitons apporter des informations sur l’éventuelle présence de motifs structuraux au sein de ces protéines afin de mieux comprendre leur fonction et de définir à quel moment de la voie de biosynthèse elles interviennent.Concernant la protéine CGC-10, nous avons conçu un plasmide optimisé que nous avons fait synthétiser. Le gène obtenu a été cloné dans un vecteur d’expression choisi par nos collaborateurs (pQE30).Concernant la protéine CGC-19, nous allons en décrire les étapes d’expression et de purification qui nous ont permis d’enregistrer l’ensemble des expériences 3D-triple résonnance nécessaires à la détermination de la structure de la protéine. De plus, il a été mis en évidence la présence d’une modification post-traductionnelle de type phosphopanthéténylation au sein de cette protéine. Nous avons produit l’enzyme responsable de cette modification, la sfp, afin de pouvoir effectuer la réaction et suivre l’effet de la modification sur les spectres RMN de la protéine et donc sur la structure.Ce projet, qui s’inscrit dans une perspective de recherche à plus long terme, a pour objectif de caractériser précisément le mécanisme de production de la congocidine. A travers cette démarche, il s’agit de combiner la biologie moléculaire (modification en amont les gènes) à la chimie afin d’obtenir des molécules différentes aux propriétés améliorées et non toxiques. / My PhD thesis contains two parts: development of ligands against anti-apoptotic proteins and structural study of CGC proteins involved in the biosynthesis of congocidine, a Streptomyces Ambofaciens secondary metabolite.The first project concerns the NMR study of the interactions between the anti-apoptotic proteins and two potential ligand candidates, the Meiogynine and the Drimane. These two terpenoïds, identified from ICSN’s chemical library screening against the Bcl-xL protein, have shown a significant inhibiting activity, thus opening promising perspectives for the treatment of cancer cells overexpressing anti-apoptotic proteins. In fact, as these compounds are considerably smaller than the binding site, our objective is to introduce modifications (such as elongation of their structure, functionalization with hydrophilic groups etc.) that may improve their binding properties as well as their delivery and bioavailability.Following to the successful recombinant expression and purification, necessary to obtain labelled targets (15N/13C), our preliminary NMR studies suggested a rather universal action of our candidates, capable to bind not only to Bcl-xL but also to the other major anti-apoptotic protein, Mcl-1. Titration experiments revealed significant perturbations of the HSQC protein NMR spectra with the progressive disappearance of several protein HN and ligand signals, confirming dissociation constants at the µM region for both targets. However, the intermediate chemical exchange NMR regime observed, associated with the weak ligand solubility, poses severe difficulties for the structural elucidation of the complexes by classical NMR methods.In this work alternative approaches for the localisation of the ligands in the hydrophobic cleft of both target proteins will be presented.Oligopyrroles are secondary metabolites synthesized by Streptomyces bacteria. This family of natural products, composed by one or more pyrrole-2-carboxamide groups is characterized by a variety of biological activities such as antiviral, antitumor and antibiotic functions.One of the best-known metabolites is the congocidine, extensively studied due to its capacity to bind into the minor groove of the DNA double helix, with strong sequence specificity. However, because of its strong toxicity, this molecule cannot be directly used for therapeutic purposes.The analysis of the groups of genes involved in congocidine biosynthesis brought to light 24 genes, but their precise role is not yet well defined. We were particularly interested in two enzymes: the proteins called CGC-10 and CGC-19. For the recombinant expression of the first one, we designed an optimized insert which was cloned in an expression vector pQE30.Concerning CGC-19, the stages of expression and purification, which allowed us to obtain doubly-labeled protein, as well as the 3D NMR experiments for spectral assignment and structure elucidation, will be discussed.Furthermore, we were interested in the holo- state of this protein obtained through a post-traductional modification (phosphopanthéténylation). To this, we produced the enzyme responsible for this modification, Sfp, carry out the reaction in vitro and follow the effect of the modification at the NMR spectra.

Les interactions protéine–protéine jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement cellulaire et sont impliquées dans diverses pathologies. L'étude de ces interactions est donc primordiale. Nous avons entrepris de développer une méthode de « footprinting » basée sur la différence d'accessibilité à l'eau des acides aminés d'une protéine selon qu'elle est seule ou en interaction. Le principe de cette méthode de caractérisation des zones d'interactions protéine–ligand, est basé sur une étape de génération de radicaux carbo-centrés sur les chaînes latérales des acides aminés de la protéine, et sur une étape de réparation de ces radicaux par un atome de tritium.<br /> <br />La première étape a été de déterminer la réactivité des 20 acides aminés communs vis-à-vis de notre méthode : <br />Lys>Leu>Arg>Ile>Trp>Phe>Val>Cys>Met>His>Tyr>Glu>Thr>Asp><br />Gln>Pro>Ala>Asn> Ser>Gly. Notre méthode ensuite appliquée à l'étude du complexe entre la protéine hAsf11-156 et un fragment de l'histone H3 a permis de caractériser sans ambiguïté les trois résidus principaux de H3 (L126, R129 et I130) impliqués dans cette interaction. De plus, nous avons mis en évidence que notre méthode de caractérisation des interactions protéique est à la fois sensible aux phénomènes d'interaction et de repliement.

L'étude des interactions non-covalentes et des relations structure-fonction est à la base de la compréhension des systèmes biologiques. La MS supramoléculaire est une technique de choix pour l'étude des interactions protéine/protéine ou protéine/ligand. Dans le cadre d'études qualitatives ou quantitatives, pour chaque système étudié, les conditions expérimentales et les paramètres instrumentaux ont été optimisés pour conserver le complexe en phase gazeuse (1). L'objectif principal de ce travail est de caractériser le site nucléotidique de hPEBP1 et de contribuer à la découverte de molécules anti-métastases. Sur le plan fonctionnel, une activité enzymatique de hPEBP1 n'a pas pu être mise en évidence. Pour ce projet, une méthode MS de détermination de KD de complexes à faible affinité, plus précise et ne nécessitant par l'utilisation d'un ligand de référence a été développée (2). Une recherche des déterminants structuraux d'un ligand optimal de hPEBP1 a été réalisée par criblage de composés issus d'une synthèse raisonnée basée sur la structure des nucléotides FMN et GTP et par la détermination de leur KD (3). Les criblages ont montré que les critères structuraux indispensables pour la liaison sont la présence d'un groupement chargé ou donneur d'électrons, d'une structure apparentée à une base azotée et d'un cycle additionnel. Une part importante de l'affinité est liée au caractère hydrophobe du ligand. Certains ligands de synthèse ont montré une activité inhibitrice de l'invasion des lignées tumorales.

L'étude des interactions non-covalentes et des relations structure-fonction est à la base de la compréhension des systèmes biologiques. La MS supramoléculaire est une technique de choix pour l’étude des interactions protéine/protéine ou protéine/ligand. Dans le cadre d'études qualitatives ou quantitatives, pour chaque système étudié, les conditions expérimentales et les paramètres instrumentaux ont été optimisés pour conserver le complexe en phase gazeuse (1). L'objectif principal de ce travail est de caractériser le site nucléotidique de hPEBP1 et de contribuer à la découverte de molécules anti-métastases. Sur le plan fonctionnel, une activité enzymatique de hPEBP1 n'a pas pu être mise en évidence. Pour ce projet, une méthode MS de détermination de KD de complexes à faible affinité, plus précise et ne nécessitant par l'utilisation d'un ligand de référence a été développée (2). Une recherche des déterminants structuraux d'un ligand optimal de hPEBP1 a été réalisée par criblage de composés issus d’une synthèse raisonnée basée sur la structure des nucléotides FMN et GTP et par la détermination de leur KD (3). Les criblages ont montré que les critères structuraux indispensables pour la liaison sont la présence d’un groupement chargé ou donneur d’électrons, d’une structure apparentée à une base azotée et d’un cycle additionnel. Une part importante de l’affinité est liée au caractère hydrophobe du ligand. Certains ligands de synthèse ont montré une activité inhibitrice de l’invasion des lignées tumorales. / The study of noncovalent interactions and structure-function relationships provides the basis for the understanding of biological systems. Supramolecular MS is a favored technique to dissect protein/protein or protein/ligand interactions. In the context of qualitative or quantitative studies, experimental conditions and instrumental parameters have been optimized for each system to preserve the noncovalent complex in the gas-phase (1). The main objective of this work is to characterize the nucleotide site of hPEBP1 and to contribute to the discovery of antimetastatic molecules. Functionally, a catalytic activity for hPEBP1 could not be detected. For this project, an original MS method to more accurately determine KD for low-affinity complexes without a reference ligand was developed (2). Structural features of an optimal hPEBP1 ligand were determined by screening compounds based on FMN and GTP nucleotides in the context of a rational design approach, using KD determination to rank affinities (3). Screening highlighted that the essential structural requirements for binding hPEBP1 consist in a charged group or an electron donor, a structure related to a cyclic nitrogenous base and an additional cycle. A significant part of the affinity depends on the hydrophobic nature of the ligand. Some of the synthesized nucleotide analogs are active as inhibitors of invasion in tumor cell lines.

Ce travail de thèse a été focalisé sur le développement d'approches MS et IM-MS supramoléculaires pour la caractérisation fine des interactions protéine/ligand et pour l'analyse de mélanges protéiques complexes. La maîtrise des instruments de MS supramoléculaire ainsi que les optimisations instrumentales et méthodologiques réalisées ont permis d'étendre le potentiel des approches MS et IM-MS pour la caractérisation d'assemblages moléculaires particulièrement complexes. Nous avons ainsi pu suivre la cinétique de formation de complexes protéine/ligand ainsi que les changements conformationnels qui y sont associés, montrant l'intérêt du couplage IM-MS en recherche pharmaceutique. De plus, ce travail a porté sur l'étude de complexes de très hauts poids moléculaires et l'évaluation de l'IM-MS pour obtenir des informations structurales sur ces complexes. Nous avons ainsi permis de repousser certaines limites de la MS et de placer cette technique au cœur des études de biologie structurale.

Les interactions intermoléculaires entre une protéine et ses différents partenaires représentent des cibles de plus en plus prisées pour l'élaboration de composés thérapeutiques capables d'intervenir dans des processus biologiques. La méthode FBDD (Fragment-Based Drug Design) permet de concevoir des molécules bioactives tels que des inhibiteurs, à partir de la structure tridimensionnelle du complexe formé entre la protéine et une molécule fragment. Dans le cadre de ce projet de thèse nous proposons d'utiliser le déplacement chimique pour l'étude des structures 3D de ces complexes protéine-ligand. Nous nous focaliserons sur la mesure des perturbations de déplacement chimique CSP (Chemical Shift Perturbations) des atomes d'une protéine cible, induites par la liaison d'un fragment. Nous démontrerons la puissance de cet outil RMN à travers la simulation des CSP induits par l'interaction d'un fragment sur une protéine cible et leur comparaison aux CSP expérimentaux. L'analyse sera réalisée sur deux protéines cibles et la comparaison des données expérimentales et simulées permettra dans un premier temps de mettre en évidence un réarrangement structural de la protéine Bcl-xL lors de son interaction avec un fragment. Puis, dans un second temps, nous montrerons que cette analyse quantitative des CSP peut permettre de déterminer l'orientation des fragments dans le site d'interaction de la protéine PRDX5. Nous comparerons alors les performances de la méthode pour différents types de protons proposant ainsi de nouvelles pistes pour la compréhension du comportement des CSP vis-à-vis de leurs contributions électroniques / Intermolecular interactions between protein and its partners represent highly attractive targets for the elaboration of therapeutic compounds abble to interfere in biological processes. A novel approach in drug design called Fragment-Based Drug Design (FBDD) consists of designing bioactive molecules like inhibitors, from the 3D structure of the complex formed between a protein and a fragment molecule (MW < 300g/mol). Here we suggest using the chemical shift, to study these protein-ligand structures. We will particularly focus on the measurement of Chemical Shift Perturbations (CSP) induced by the fragment-binding on protein’s nuclei. We will evidence the potency of this NMR tool through simulation of CSP induced by fragment interaction on protein target and the comparison with experimental CSP. Two protein targets will be used and the comparison between experimental and simulated data will evidence on one hand, the structural rearrangement of the protein Bcl-xL upon fragment-binding. On the other hand, we will demonstrate that this quantitative use of CSP is unable to determinate fragment orientations inside the protein PRDX5 binding site. We will compare the performances of the method for different kinds of protein and proposing answers to better understand the behaviour of CSP toward their different electronic contributions

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d'être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l'hypothèse qu'ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l'accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu'ABCG2 transporte de l'hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d'ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d'ABCG2, ECL3, composé d'environ 70 acides aminés. L'affinité d'ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l'albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l'hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L'ensemble de ce travail a donc permis d'une part de mieux comprendre le rôle d'ABCG2 dans la régulation de l'homéostasie des porphyrines, notamment l'hème, et d'autre part, de façon originale, d'identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s'effectue.

Ce travail de thèse a été focalisé sur le développement d’approches MS et IM-MS supramoléculaires pour la caractérisation fine des interactions protéine/ligand et pour l’analyse de mélanges protéiques complexes. La maîtrise des instruments de MS supramoléculaire ainsi que les optimisations instrumentales et méthodologiques réalisées ont permis d’étendre le potentiel des approches MS et IM-MS pour la caractérisation d’assemblages moléculaires particulièrement complexes. Nous avons ainsi pu suivre la cinétique de formation de complexes protéine/ligand ainsi que les changements conformationnels qui y sont associés, montrant l’intérêt du couplage IM-MS en recherche pharmaceutique. De plus, ce travail a porté sur l’étude de complexes de très hauts poids moléculaires et l’évaluation de l’IM-MS pour obtenir des informations structurales sur ces complexes. Nous avons ainsi permis de repousser certaines limites de la MS et de placer cette technique au cœur des études de biologie structurale. / The aim of this thesis was the development of different supramolecular approaches, like MS and IM-MS, to characterize precisely protein/ligand interaction and to analyze complex mixtures of proteins. Understanding of supramolecular MS instruments and instrumental and methodological optimizations were allowed the development of MS and IM-MS to characterize very high mass supramolecular assembly. Thus, we were able to follow by kinetic the formation of protein/ligand interaction as well as associated conformational modifications, showing the interest of IM-MS coupling in pharmaceutical research. Furthermore, this work deals with the study of high mass complexes and assessment of IM-MS to obtain structural information on these complexes. As a consequence, we have pushed away some limits of MS allowing the use of this technique in structural biology.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d’être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l’hypothèse qu’ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l’accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu’ABCG2 transporte de l’hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d’ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d’ABCG2, ECL3, composé d’environ 70 acides aminés. L’affinité d’ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l’albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l’hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L’ensemble de ce travail a donc permis d’une part de mieux comprendre le rôle d’ABCG2 dans la régulation de l’homéostasie des porphyrines, notamment l’hème, et d’autre part, de façon originale, d’identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s’effectue. / ABCG2 belongs to the ABC-transporter family, involved in drug resistance developed by cells, notably cancer cells. This transporter has also a physiological role of endobiotic detoxification, in particular porphyrins that are essential but potentially toxic molecules. This toxicity implies a specific handle, to avoid them to remain free in solution. In that context, we hypothesized that ABCG2 participate to this detoxification, limiting the intracellular porphyrin accumulation by presenting them to an extracellular partner. We show that ABCG2 transports heme and some of its derivatives and precursors. Interestingly, these porphyrins, unlike other ABCG2 (non-porphyric) substrates, can bind to an extracellular domain, specific of ABCG2, ECL3, 70 residues-long. ECL3 displays affinities for porphyrins in the range of 0.5 to 3.5 μM, high enough to allow their binding after transport. We also show that human serum albumin, implicated in heme detoxification, releases porphyrins bound to ECL3 by a direct interaction with ABCG2. This work established a better comprehension of ABCG2 role in porphyrin and in particular heme homeostasis regulation. In addition, our results contribute to elucidate part of the molecular mechanism by which such regulation is carried out.

L’élucidation des interactions non-covalentes des complexes biologiques revêt d’une importance majeure dans la compréhension du fonctionnement cellulaire. L’objectif de ce travail de thèse est d’approfondir les développements de la spectrométrie de masse (MS) pour l’étude de ces complexes, que ce soit par MALDI-MS (la désorption-ionisation laser assistée par matrice) ou par ESI-MS (l’ionisation électrospray). Ce travail s’est articulé autour de trois axes : i) étude de la stœchiométrie et de la topologie du complexe SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acétyltransferase, module Histone Acétyl Transferase) par pontage chimique couplé à la MS ; ii) suivi de la dimérisation des complexes formés par RAR-RXR (récepteur de l’acide rétinoïque - récepteur X des rétinoïdes) avec différents ADNs ; iii) mesure de la constante de dissociation des complexes RXR-ligand. Les méthodologies développées ont permis de repousser le potentiel de la MS et d’obtenir des informations structurales des complexes biologiques. / Elucidation of non-covalent interactions of biological complexes takes on great importance for the understanding of cellular function. The purpose of this thesis is a further development of mass spectrometry (MS) for the study of these complexes, either by MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption-ionization) or by ESI-MS (electrospray ionization). This work was focused on three main lines: i) study of the stoichiometry and the topology of SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase, Histone Acetyl Transferase module) complex by chemical cross-linking coupled to MS; ii) monitoring the dimerization of the complexes formed by RAR-RXR (retinoic acid receptor - retinoid X receptor) with different DNAs; iii) measuring the dissociation constant of RXR-ligand complexes. The developed methodologies made it possible to expand the potential of MS and get insight into structure of biological complexes.