Les parasites protozoaires du genre Leishmania sont les agents microbiens responsables d’un groupe de maladies connues sous le nom de leishmanioses. L’infection productive dépend de la capacité de survie du parasite suite au premier contact initial du système immunitaire de l’hôte. Par conséquent, la prolifération du parasite à l’intérieur des phagolysosomes sera responsable de la pathologie. Les promastigotes stationnaires, récupérés en culture axénique de laboratoire sont semblables aux promastigotes métacycliques. Ces derniers sont fortement immunomodulateurs et sont considérés, traditionnellement comme la forme la plus infectieuse du parasite. Les protéines sécrétées de différents organismes ont été directement impliquées dans plusieurs pathologies. Donc, il est possible que les protéines sécrétées par Leishmania, soient également impliquées dans la capacité du parasite à subvertir le système immunitaire. Les avancées récentes dans l’étude du sécrétome de plusieurs types de Leishmania ont permis d’affirmer que le sécrétome est fort complexe. Nous avons déterminé qu’environ 300 protéines sont sécrétées par le parasite, la plupart d’entre elles ayant aucun signal canonique de sécrétion. Le sécrétome de Leishmania est donc composé surtout de protéines qui sont libérées par sécrétion non conventionnelle, . Afin d’étudier le sécrétome associé à la virulence, nous avons développé et validé une approche qui a permis l’étude des composants de l’exoprotéome des parasites stationnaires et logarithmiques. Cette approche était basée sur la culture continue des parasites dans un milieu de culture sans supplément de sérum de bovin fœtal, cRPMI, dans lequel la virulence des parasites est maintenue. Grâce à cette approche nous avons mis en évidence un exoproteome distinct de ceux jusqu’à date répertorié. La méthode de production et de la récupération de l’exoproteome sont donc très importants. Notre exoprotéome est dominé par la GP63, une glycoprotéine dont l’importance centrale dans l’infection a été déjà validée. La culture continue des parasites est donc essentiel pour avoir un exoprotéome représentatif. Nous avons également déterminé que la cultutre en continu pouvait amener à une diminution de la virulence et quarante divisions sont nécessaires pour une perte de virulence significative. Par conséquent toutes nos études se sont fait chez des parasites comptant moins de 20 divisions. Le principal mécanisme associé à la perte de virulence a été identifié comme une incapacité de se différencier en amastigotes. Le cRPMI a donc permis la culture des parasites pour l’étude de l’exoprotéome tout en maintenant la virulence des parasites. La présence de vésicules, décrite déjà comme un composant de l’ exoprotéome, a été confirmée aussi par notre approche continue et a été confirmé, d’ailleurs, dans l’exoproteome des parasites en phase de croissance logarithmique. Les vésicules récupérées des parasites logarithmiques diffèrent de celles recueillies de parasites en phase stationnaire de croissance. En effet des protéines potentiellement impliquées dans la rénovation et le recyclage du contenu protéique, tels certains composants du ribosome étaient enrichies dans les parasites en phase logarithmique tandis que les vésicules des parasites stationnaires ont un contenu protéomique ayant des caractéristiques similaires aux corps apoptotiques des cellules de mammifères. En dehors de la GP63, plusieurs autres protéines décrites comme immunomodulatrices ont été retrouvées dans l’exoprotéome des parasites stationnaires, ce qui indique que celui-ci contient un ensemble de protéines avec un potentiel d’interaction directe avec les cellules du système immunitaire. Immunologiquement, l’exoprotéome récupéré des parasites stationnaires a été capable d’activer les cellules dendritiques, laissant supposer une fonction importante dans la création d’un environnement inflammatoire précoce lors des premières étapes de l’infection. En conclusion, la recherche développée a contribué à l’avancement des connaissances actuelles sur la biologie du Leishmania, grâce au développement et à la validation d’une nouvelle approche afin d’étudier son exoprotéome. L’exoprotéome récupéré était dynamique, il avait une composition spécifique, dépendant du stade du parasite. Cet exoprotéome avait des effets spécifiques sur les cellules dendritiques et il jouait un rôle important dans les étapes précoces de l’infection. Cette étude a ouvert des nouvelles perspectives sur l’exoprotéome de Leishmania spp. permettant la découverte de nouvelles protéines immunomodulatrices et, en corrolaire, de nouvelles cibles pour le contrôle de la maladie associée au parasite. / Protozoa parasites of the genus Leishmania are the responsible for a group of diseases known as leishmaniasis. The infection is associated with the capacity of these parasites to survive in the phagolysosomes of infected macrophages. Successful infections with pathogenic Leishmania spp. are linked to the capacity of the parasite to survive the initial impact of the host immune system and to interfere with the infected cells rendering them incapable of eliminating the parasites. The secreted proteins from the parasite are expected to be in the front line for interactions with the host. Recent advances in the study of the secretome of Leishmania spp. depicted it as highly complex with the majority of proteins without any predictable secretion signal. The secretome is composed of proteins that are released by different mechanisms like conventional and unconventional secretion. Several proteins secreted by Leishmania spp. are known to interact and influence the outcome of the disease by directly interfering with the host immune cells. The proteomic studies on the Leishmania spp. secretome identified more than three hundred proteins released into the exterior. The stationary promastigotes recovered in axenic culture were enriched in the most virulent promastigote form, the metacyclic parasites. Therefore we aimed at evaluating the exoproteome associated with the stationary parasites. To achieve this we developed and validated an approach that would enable the study of the exoproteome components of stationary and logarithmic parasites. This approach was based on the continuous cultivation of the parasites in a medium without any protein supplementation that maintained the basic virulence of the parasites. The continuous approach produced a GP63-rich exoproteome that was distinct from the traditional approaches indicating that the process of recovery induced a significant bias in the study. Furthermore as the continuous approach was chosen, we determined the mechanisms associated with loss of virulence assuring that fully virulent parasites were used. At least forty parasite divisions were required for a short-term loss of virulence. The main mechanism associated with loss of virulence was identified as a growing incapacity to differentiate into amastigotes. The defined time interval of forty divisions enabled us to evaluate the exoproteome without loss of virulence related to the subculture. The protein-free medium developed, cRPMI, retained parasite virulence and morphology similar to that of parasites grown in standard media. The exoproteomes recovered using cRPMI were dominated by proteins without any recognizable secretion sequence, in concordance with reports on other Leishmania spp. The presence of vesicles, already reported as a component of the exoproteome, was also confirmed using our continuous approach. Furthermore, the presence of vesicles in the logarithmic parasites exoproteome was confirmed. The protein content of these vesicles presented a dynamic profile that was dependent on the parasite stage. The vesicles recovered from logarithmic parasites seemed to be related to protein turnover, being significantly enriched in ribosomal components. The vesicles from stationary parasites are of different composition, presenting some characteristics similar to apoptotic bodies. Immunologically the exoproteome recovered from stationary parasites was able to activate dendritic cells suggesting that the exoproteome might have a function in the creation of an early inflammatory environment leading to the recruitment of neutrophils and monocytes that might function as safe heavens for the parasites. In conclusion, our research has contributed to the advance of the current knowledge of Leishmania biology, through the development and validation of a novel approach to study the Leishmania secretome. The exoproteome recovered from stationary parasites had specific immune-modulating effects on bone marrow derived dendritic cells, indicating that it can play an important role in the precocious steps of infection. This study opened new perspectives into the Leishmania spp. exoproteome that will enable the search of new immunomodulatory proteins that might become the future targets to leishmaniasis control.

Cette thèse comprend deux sujets. La première partie est en termes de système de défense bactérien. Les procaryotes et les eucaryotes possèdent des gènes de résistance dans leur génome, qui peuvent être soit innés soit acquis, protégeant contre les infections virales. Au niveau de la population, l'infection abortive (Abi) sert de mécanisme de défense immunitaire inné contre l'invasion par le phage. Les gènes antiviraux AbiV sont prévalents dans les génomes bactériens et présentent des caractéristiques diverses en termes d'évolution et de composition génomique. Les systèmes Abi sont considérés comme des traits altruistes, car les cellules infectées se suicident pour empêcher le cycle lytique du phage et protéger leur communauté. La protéine AbiV appartient à la super famille de liaison aux nucléotides des eucaryotes et des procaryotes (HEPN) et peut fonctionner comme un type d'endoribonucléase. On peut la trouver dans de nombreuses bactéries, dont *Lactococcus lactis, L. paracamosus, Streptococcus pneumoniae* et *Streptococcus oralis*. Dans cette étude, nous avons utilisé le système AbiV de *Lactococcus lactis* non pathogène comme organisme modèle, qui confère une résistance aux phages lactococciques virulents du genre Skunavirus. Cependant, la protéine AbiV a une séquence unique, et aucun homologue structurel est connu. De plus, le mécanisme moléculaire de son activité antiphage reste flou. Notre exploration du système AbiV de *Lactococcus* a révélé un nouveau duo : *abiV1* et *abiV2*, des acteurs essentiels dans son rôle de système de toxine-antitoxine de type III. La toxine, AbiV (encodé par *abiV1*), émerge comme une RNase au sein de la super famille HEPN, distinguée par le motif Rx$\mathsf{_{4-6}}$H. À travers des essais *in vivo* et de la spectrométrie de masse, nous avons observé l'expression d'AbiV indépendamment de la présence de phages, tandis que des expériences *in vitro* ont élucidé sa dégradation sélective de l'ARN ribosomal, laissant l'ARNm intact. En revanche, *abiV2*, le composant antitoxine, fonctionne comme une molécule d'ARN, contrecarrant l'activité nucléase de AbiV1. L'examen structural d'AbiV révèle une zone chargée positivement à travers son dimère, cruciale pour l'ancrage des molécules d'ARN. De plus, notre investigation souligne le rôle indispensable de la région N-terminale d'AbiV (acides aminés 1 à 23) dans son activité de RNase ; un AbiV tronquée et dépourvue de ce segment a présenté des états conformationnels incompatibles avec la liaison à l'ARN. Cette étude offre de nouvelles perspectives sur la dynamique opérationnelle du système antiviral AbiV. La deuxième partie : les endolysines. L'étude des endolysines de bactériophages. Les endolysines, également connues sous le nom d'enzymes muralytiques ou lysines, sont une classe d'enzymes produites par les bactériophages (virus qui infectent les bactéries) dans le cadre de leur cycle de réplication. Ces enzymes jouent un rôle crucial dans le cycle de vie des phages en facilitant la libération des nouvelles particules virales formées à partir des cellules bactériennes hôtes. La fonction principale des endolysines est de dégrader la couche de peptidoglycane, qui est un composant structurel majeur des parois cellulaires bactériennes. La couche de peptidoglycane fournit intégrité structurelle et protection aux cellules bactériennes, et sa dégradation par les endolysines conduit à la lyse ou à la désintégration de la paroi cellulaire. Cela entraîne finalement l'éclatement de la cellule bactérienne et la libération des particules phagiques nouvellement répliquées, leur permettant d'infecter et de se propager dans d'autres cellules bactériennes. Les endolysines se composent généralement d'un ou plusieurs domaines fonctionnels qui travaillent ensemble pour dégrader la couche de peptidoglycane des parois cellulaires bactériennes. Ces domaines contribuent à la structure et à la fonction globales de l'enzyme. Les domaines spécifiques présents dans une endolysine peuvent varier en fonction du phage et de l'hôte bactérien qu'ils ciblent. Dans cette étude, nous avons exploré l'activité lytique et les caractéristiques structurelles de deux endolysines : DAH67913.1 (DAH67), provenant du groupe de bactériophages *Caudoviricetes* sp. identifié à partir des métagénomes humains, et son homologue proche Lys1358, qui utilise *Lactococcus lactis* comme hôte. Notre analyse par cristallographie a révélé des similitudes remarquables dans les structures des deux endolysines, caractérisées par une architecture partagée comprenant un domaine CHAP enzymatiquement actif à l'extrémité N-terminale et un domaine de liaison à la paroi cellulaire, SH3b, à l'extrémité C-terminale. Notamment, contrairement aux autres domaines CHAP, ceux de Lys1358 et DAH67 étaient dépourvus de calcium lié, ce qui a conduit à l'observation sans précédent de conformations inactives distinctes en raison de l'absence de stabilisation d'un motif de type "EF-hand" par cet ion. Ces découvertes apportent un nouvel éclairage sur le rôle régulateur du calcium au niveau moléculaire. De plus, nous avons observé que le Zn2+ inhibe l'activité lytique en se liant aux résidus catalytiques C29 et H89 au sein du domaine CHAP. En outre, nos analyses structurelles ont fourni des informations sur la façon dont le domaine SH3b reconnaît le dipeptide D-Ala-D-Ala, un composant vital du peptidoglycane de la paroi cellulaire de *L. lactis*, à travers des interactions conservées. Les études de mutation ont en outre corroboré l'importance des résidus catalytiques et de la poche de liaison au D-Ala-D-Ala dans la fonctionnalité de ces endolysines. De plus, notre comparaison du mode de liaison de la vancomycine avec le motif D-Ala-D-Ala du peptidoglycane a révélé des mécanismes de reconnaissance distincts employés par le domaine SH3b et les antibiotiques glycopeptidiques. Collectivement, nos découvertes offrent de nouvelles perspectives sur les relations structure-fonction complexes inhérentes à cette famille d'endolysines, fournissant des informations précieuses sur leurs mécanismes d'action et leurs applications potentielles en biotechnologie et en médecine. / **This thesis includes two stories.** **Part 1.** Prokaryotes and eukaryotes possess resistance genes in their genomes, which can be either innate or acquired, protecting against viral infections. At the population level, abortive infection (Abi) serves as one such innate immune defense mechanism against phage invasion. The AbiV antiviral system is prevalent in many bacterial genomes and exhibits diverse characteristics in terms of evolution and genomic composition. Abi systems are considered altruistic traits, as infected cells commit suicide to prevent the phage lytic cycle and protect their community. The protein AbiV belongs to the higher eukaryotic and prokaryotic nucleotide-binding (HEPN) superfamily and may function as a type of endoribonuclease. It can be found in many bacteria, including *Lactococcus lactis, Lacticaseibacillus paracamosus, Streptococcus pneumoniae* and *Streptococcus oralis*. In this study, we used the non-pathogenic *Lactococcus lactis* AbiV system as a model organism, which provides resistance to virulent lactococcal phages belonging to the Skunavirus genus. However, the AbiV protein has a unique sequence, and no structural homologs is available to date. The molecular mechanism of its anti-phage activity also remains unclear. Our exploration of the *Lactococcus* AbiV system has unveiled a novel duo: *abiV1* and *abiV2*, pivotal players in their role as a type III toxin-antitoxin system. The toxin, AbiV (encoded by *abiV1*), emerges as an RNase within the HEPN superfamily, distinguished by the Rx$\mathsf{_{4-6}}$H motif. Through *in vivo* assays and mass spectrometry, we observed AbiV expression irrespective of phage presence, while *in vitro* experiments elucidated its selective degradation of ribosomal RNA, leaving mRNA untouched. Conversely, *abiV2*, the antitoxin component, functions as an RNA molecule, thwarting AbiV's nuclease activity. Structural examination of AbiV reveals a significant positively charged area across its dimer, pivotal for RNA molecule anchoring. Furthermore, our investigation underscores the indispensable role of the N-terminal region (amino acids 1 to 23) of AbiV in its RNase activity; a truncated AbiV lacking this segment exhibited conformational states incompatible with RNA binding. This study offers fresh insights into the operational dynamics of the antiviral AbiV system. **Part 2.** **The study of bacteriophage endolysins**. Endolysins, also known as lysins, are a class of enzymes produced by bacteriophages as part of their replication cycle. These enzymes play a crucial role by facilitating the release of newly formed viral progeny from the host bacterial cells. The primary function of endolysins is to degrade the peptidoglycan layer, which is a major structural component of bacterial cell wall. The peptidoglycan layer provides structural integrity and protection to bacterial cell, and its breakdown by endolysins leads to the lysis or disintegration of the cell wall. This ultimately results in the bursting of the bacterial cell and the release of newly phage particles, allowing them to infect and propagate in other bacterial cells. Endolysins typically consist of functional domains that work together to degrade the peptidoglycan layer. These domains contribute to the enzyme's overall structure and function. The specific domains present in an endolysin can vary depending on the phage and the targeted bacterial host. In this study, we explored the lytic activity and structural characteristics of two endolysins: DAH67913.1(DAH67), originating from a bacteriophage (*Caudoviricetes* class) identified in human metagenomes, and its close homolog Lys1358, from the virulent phage 1358 which infects specific Lactococcus strains. Our analysis using crystallography unveiled remarkable similarities in the structures of both endolysins, characterized by a shared architecture featuring an enzymatically active N-terminal CHAP domain and a C-terminal cell-wall binding domain, SH3b. Notably, unlike other CHAP domains, those of Lys1358 and DAH67 were devoided of bound calcium, resulting in the unprecedented observation of distinct inactive conformations due to the absence of stabilization of an "EF-hand-like" motif by this ion. These findings shed new light on the regulatory role of calcium at the molecular level. Moreover, we observed that Zn$\mathsf{^{2+}}$ inhibited the lytic activity by binding to the catalytic residues C29 and H89 within the CHAP domain. Additionally, our structural analyses provided insights into how the SH3b domain recognizes the dipeptide D-Ala-D-Ala, a vital component of the lactococcus cell wall peptidoglycan, through conserved interactions. Mutation studies further corroborated the significance of catalytic residues and the D-Ala-D-Ala binding pocket in the functionality of these endolysins. Furthermore, our comparison of the binding mode of vancomycin with the peptidoglycan D-Ala-D-Ala moiety revealed distinct recognition mechanisms employed by the SH3b domain and glycopeptide antibiotics. Collectively, our findings offer novel perspectives on the intricate structure-function relationships inherent in this family of endolysins, providing valuable insights into their mechanisms of action and potential applications in biotechnology and medicine.

Le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique avec au dessus de 120 millions de personnes infectées et à ce jour aucun traitement capable de contrer de manière efficace ce virus. Le VHC a été découvert en 1989, classé dans la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hepacivirus. Il s’agit d’un virus enveloppé, formé donc d’une bicouche lipidique, d’une capside, et d’un acide nucléique (ARN). La capside virale est formée d’une seule et unique protéine appelée « Core ». Il s’agit d’une protéine de 177 acides aminés sous sa forme mature. Il a été démontré au sein du laboratoire du Professeur Denis Leclerc que la première moitié de la protéine (C82) était suffisante pour générer à la fois in vivo et in vitro la formation de la capside virale. Ayant comme objectif de comprendre les mécanismes régissant l’assemblage viral, nous avons étudié cette protéine d’un point de vue structural. Suite à la mise au point d’un protocole robuste d’expression, de marquage isotopique et de purification, nous avons étudié la Core C82 par dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la Core C82 est non structurée et flexible, confirmant ainsi l’analyse de la séquence primaire et les prédictions de structure secondaire de la Core. Nous avons ainsi mis en évidence que la moitié N-terminale de la Core du VHC appartenait à la famille des protéines intrinsèquement non structurées (IUP). Les IUPs sont des protéines peu ou très peu structurées et parfois capables de se structurer en liaison à un partenaire (protéine, acide nucléique, petite molécule). Nous avons donc, dans le but de structurer la Core C82, testé de multiples conditions de sel, détergent, agent lipomimétique et un partenaire protéique (protéine p53). Seul l’ajout d’un agent lipomimétique (2,2,2-trifluoroéthanol, TFE) à la Core C82 est venu modifier sa structure et sa dynamique. Nous avons ainsi pu démontrer que la Core C82 pouvait adopter une structure en hélice α. Nous avons, de plus, confirmé que ce repliement était également présent dans des versions tronquées plus longues de la Core (formes C124 et C170). Enfin, nous avons, parallèlement à son étude structurale, mis au point un test in vitro d’inhibition de l’assemblage. Cet outil nous a permis de découvrir plusieurs peptides dérivés de la séquence protéique de la Core et de la protéine NS5A du VHC, ayant un effet inhibiteur sur l’assemblage viral in vitro de la Core mature (C170). Ces travaux innovateurs représentent une avenue encourageante vers la découverte d’un moyen efficace de soigner l’infection au VHC. Au final, même si la structure 3D de la Core mature reste non déterminée, notre étude structurale de la Core C82 est la plus complète réalisée à ce jour à l’échelle atomique. Par ailleurs, nos travaux préliminaires sur la forme mature de la Core (C170) semblent être très prometteurs et permettraient de déterminer la structure 3D de la protéine Core mature. / The hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem with more than 120 million infected people, and to date no efficient treatment is available. HCV was discovered in 1989, classified in the flaviviridae family, and is the only member of the hepacivirus genus. It is an enveloped virus, consisting in a lipid bilayer, a capsid, and a ribonucleic acid (RNA). The viral capsid is composed by only one protein called “Core” protein. It is a 177 amino acid long protein in its mature form. It was demonstrated in our laboratory that the first half of this protein (C82) was sufficient to generate, both in vivo and in vitro, the assembly of the viral capsid. In order to understand the mechanism controlling the capsid assembly, we have studied the structural aspect of this protein. After developing robust protocols of overexpression, isotope labelling and purification of the protein C82, we studied this truncated form using circular dichroism and nuclear magnetic resonance. The experimental data obtained suggest that Core C82 is an unstructured and very flexible protein, thus confirming primary sequence analysis and secondary structure predictions. We established that the N-terminal half of the Core protein is a member of the intrinsically unstructured protein family (IUP). IUPs are proteins which are totally or partially unstructured, but can sometimes undergo a structural change induced by the binding of a partner (protein, nucleic acid, small molecule). In order to induce a structured form of the C82 protein, we have tested a large range of conditions of salt, detergent, lipomimetic solvent, as well as interaction with a proteic partner (p53). Only the addition of a lipomimetic agent (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) to the Core C82 protein resulted in a structural and a dynamical change. In this special condition, we were able to demonstrate that the Core C82 can adopt an α-helix conformation. We have, moreover, confirmed that this conformation was also present in longer truncated form of the Core protein (C124 and C170). We also, along its structural analysis, developed an in vitro test to inhibit the assembly of the Core protein. This tool allowed us to discover several small peptides derived from the HCV Core and NS5A proteins amino acid sequences, with an inhibitory effect on the viral assembly of the mature Core protein (C170). This innovative work is potentially an interesting step towards the development of an efficient treatment against HCV. Ultimately, even if the 3D structure of the mature Core protein remains unsolved, our structural study of the C82 truncated form is the most comprehensive study to date at an atomic resolution. Moreover, our preliminary works on the mature form of the Core protein (C170) are very promising and should eventually lead to the three dimensional structure.

L’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6) infecte les enfants en bas âge et sa prévalence est estimée à près de 95% dans la population mondiale. Ce virus se distingue des autres membres de la famille des herperviridae par sa capacité à s’intégrer aux chromosomes cellulaires. On estime qu’environ 1% de la population mondiale serait porteuse d’une copie du génome du HHV-6 par cellule (52, 73, 100, 119, 131). Le mécanisme de cette intégration est toujours inconnu. Nous pensons que la protéine U94 du HHV-6 joue un rôle important dans l'intégration chromosomique du génome viral. Elle serait nécessaire à l'éxécution d'une recombinaison homologue entre les séquences télomériques cellulaires et virales (motif TTAGGG). U94 a une homologie de séquence de 24% avec la protéine Rep68 responsable de l'intégration du génome de l’adeno-associated virus 2 (AAV-2) au chromosome 19 (123). Pour ce faire, quatre activités intrinsèques à la protéine Rep68 lui sont nécessaires : la liaison à l'ADN simple et double brin, l'ATPase, l'hélicase et l'endonucléase (54, 97). Le but de ce projet de recherche était de caractériser les activitités biochimiques de la protéine U94. Tout d’abord, nous avons démontré que la protéine U94A est localisée au noyau en accord avec les résultats obtenus par le laboratoire du Dr. Mori (87). Pour réaliser nos études, nous avons exprimé et purifié U94 chez E. coli en fusion avec la protéine maltose-binding protein (MPB). Nos résultats démontrent que les protéines MBP-U94A et MBP-U94B sont capables de lier préférentiellement l'ADN simple brin avec un motif CCCTAA (complément du motif télomérique TTAGGG). L’essai de liaison sur le Proteon™ XPR36 démontre également que la protéine MBP-U94B lie un ADN double brin ayant le motif télomérique cellulaire. Nos résultats nous ont amenés à vérifier si l'ARN de la télomérase, qui contient un motif CCCTAA, pouvait aussi être lié par les protéines MBP-U94A et MBP-U94B. Les résultats obtenus indiquent que MBP-U94 ne lie pas l'ARN, ni la séquence équivalente en ADN ce qui suggère que la liaison de U94 requiert plus d’une répétition du motif CCCTAA. En se basant sur des études de mutagenèse réalisées sur la protéine Rep68 (128, 129), nous avons générés des mutants U94A et U94B. Les résultats démontrent que la mutation K395A affecte négativement la capacité de liaison à l’ADN de U94. Les essais d'ATPase indiquent que MBP-U94A et MBP-U94B hydrolysent l'ATP en ADP et AMP en présence d'un ADN simple brin ou d’un ADN double brin. Divers mutants des activités d’ATPase/Hélicase et d’endonucléase présumées furent générés et devront être caractérisés. Ces résultats suggèrent que U94 possède les activités biochimiques nécessaires à l'intégration du génome viral aux chromosomes cellulaires. / Human herpesvirus 6 infects young children with an estimated prevalence of 95% in the world population. It differs from the other members of the herperviridae family by its capacity to integrate cell's chromosomes. It is estimated that approximately 1% of the world population carries a copy of the HHV-6 genome per cell (52, 73, 100, 119, 131). The chromosomal integration mechanisms used by HHV-6 are currently unknown. Our hypothesis is that the HHV-6 U94 protein plays an important role in chromosomal integration that we suspect occur through homologous recombination between cellular and viral telomeric sequences (TTAGGG). The U94 gene product shares 24% sequence homology with Rep68, a responsible for the genomic integration of adeno-associated virus 2 (AAV-2) (123). To promote integration, Rep68 relies on four intrinsic activities: binding to single and double stranded DNA, ATPase activity, helicase and endonuclease (54, 97). The goal of this research project is to characterize the biochemical properties of U94 and determine whether it posseses activities similar to Rep68. First, we confirmed the results of Dr. Mori's laboratory by showing that U94 is localized in the nucleus (87). Next, to conduct our studies, we’ve expressed and purified maltose-binding-U94 recombinant proteins (MBP-U94) in E. coli. Our results suggest that MBP-U94A and MBP-U94B preferentially bind single-strandred DNA containing the CCCTAA motif (complement to the TTAGGG telomeric motif). Surface plasmon resonance (SPR) experiments also indicate that MBP-U94B binds double-stranded DNA containing telomeric motifs. Since the telomerease RNA component TERC contains the CCCTAA motif, we investigated whether MBP-U94 could bind a single-stranded RNA molecule containing the CCCTAA motif. SPR analysis clearly indicates that MBP-U94 does not bind such RNA nor a single-stranded DNA molecule having a single CCCTAA motif, suggesting that more than one motif is required for proper binding. Based on published work on Rep68 (128, 129), we generated specific U94 mutants. Our results indicate that the K395A mutation greatly diminishes U94 binding to DNA pointing out the importance of this residue. ATPase assays were also performed and indicate that both MBP-U94A and MBP-U94B possess the ability to hydrolyze ATP into ADP and AMP when incubated in the presence of DNA. Several other mutants targeting the helicase and endonuclease activities were generated and will be tested in the near future. Altogether these results suggest that U94 has biological properties that are consistent with a role for this protein in the process of chromosomal integration of the HHV-6 genome into the host chromosomes.

La protéine membranaire « Growth Arrest-Specific 1 » (GAS1) est reconnue pour ses effets antitumoraux et anti-métastatiques de par sa capacité à induire l’arrêt du cycle cellulaire, généralement en phase Go, et l’apoptose. Cependant, le rôle de GAS1 a été peu étudié et est quelque peu controversé dans le contexte oncologique. De plus, des évidences poussent à croire que cette protéine jouerait un rôle dans le processus angiogénique. Pour étudier le rôle de GAS1 dans le cancer, des tests in cellulo classiques mesurant la prolifération, le cycle cellulaire ainsi que l’apoptose ont été réalisés sur des cellules cancéreuses surexprimant GAS1. Des immunobuvardages ont été utilisés afin de détecter la présence de GAS1 dans les différentes lignées cellulaires et leur milieu de culture. Des xénogreffes utilisant la membrane chorioallantoïque de l’œuf de poulet (essai CAM) ont été réalisées pour évaluer le potentiel tumorigénique et angiogénique des cellules. La surexpression de GAS1 dans les différentes lignées cellulaires cancéreuses n’a eu aucun effet sur leur prolifération, leur cycle cellulaire ainsi que leur état apoptotique, lorsque mesurés in vitro. Cependant, lorsque ces cellules furent testées à l’aide de l’essai CAM, le poids des tumeurs exprimant GAS1 ainsi que l’angiogenèse ont augmenté. Des essais CAM, utilisant entre autres des bouchons de collagène et la protéine GAS1 soluble purifiée, ont démontré que cette dernière stimule indirectement l’angiogenèse. En résumé, un nouveau rôle pro-angiogénique a été mis en évidence pour la protéine GAS1 soluble. L’angiogenèse tumorale est primordiale à la progression de plusieurs types de cancers incluant le cancer de la prostate. Cette dernière est d’ailleurs ciblée par des traitements anticancéreux. GAS1 soluble représente donc une cible thérapeutique potentielle pour traiter le cancer. / Growth Arrest-Specific 1 (GAS1) is a membrane protein recognized for its antitumor and anti-metastatic effects due to its capacity to induce cell cycle arrest, usually in the Go phase, and apoptosis. However, the role of GAS1 has not been the subject of much analysis and is somewhat controversial in cancer. Moreover, evidence leads us to infer that this protein could play a role in angiogenesis. To study the role of GAS1 in cancer, conventional in cellulo tests measuring proliferation, cell cycle and apoptosis were performed on cancer cells overexpressing GAS1. Immunoblotting was used to detect the presence of GAS1 in the different cell lines and their culture medium. Xenografts employing the chorioallantoic membrane of the chicken egg (CAM essay) were used to evaluate the tumorigenic and angiogenic potential of the cells. GAS1 overexpression in various cancer cell lines showed no effect on their proliferation, cell cycle and apoptotic state when measured in vitro. However, when these cells were tested with the CAM assay, weight of tumors expressing GAS1 as well as angiogenesis was increased. CAM assays, using among other things collagen plugs and purified soluble GAS1 protein, demonstrated that the latter indirectly stimulates angiogenesis. In summary, a new pro-angiogenic role has been demonstrated for soluble GAS1. Tumor angiogenesis is essential to the progression of several types of cancer including prostate cancer. Angiogenesis is therefore the focus of several anticancer treatments. Thus, soluble GAS1 represents a potential therapeutic target for treating cancer.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans le contrôle de la majorité des processus physiologiques. Dans le modèle classique, la signalisation par les RCPGs se résumait à l'activation de protéines G hétérotrimériques capables de moduler l'activité d'effecteurs, qui, à leur tour, contrôlent la concentration intracellulaire de seconds messagers tels que l'AMPc ou le calcium. Cette vision classique de la signalisation s'est par contre complexifiée au fil des années et l'on sait maintenant que les RCPGs interagissent avec une multitude d'autres protéines afin de transmettre de façon spécifique les signaux extracellulaires. Ainsi, pour bien comprendre comment est régulé un RCPG, il devient primordial de connaître les protéines interagissant avec celui-ci. Nous avons donc entrepris d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour les récepteurs DP (récepteur de la prostaglandine D[indice inférieur 2]), TP[bêta] (récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2]) et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, puis, de déterminer le rôle de ces complexes protéiques dans la fonction des récepteurs. Lors d'un criblage par double-hybride visant à identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour DP, nous avons identifié la protéine ankyrin repeat domain-containing protein 13C (ANKRD13C), une protéine n'ayant pas encore été caractérisée jusqu'à maintenant. Des études de localisation ont montré qu'ANKRD13C est associée à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elle interagit avec DP. Cette interaction facilite d'abord la biogenèse du récepteur en ralentissant la dégradation des récepteurs nouvellement synthétisés. Elle régule aussi le transport de DP vers la membrane plasmique en induisant la rétention dans le RE des formes immatures du récepteur. Elle facilite finalement la dégradation par le protéasome des formes de récepteurs retenues dans le RE. Ces expériences suggèrent donc un rôle de chaperonne pour ANKRD13C dans la biogenèse du récepteur DP. La protéine adaptatrice RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) a ensuite été identifiée comme nouveau partenaire d'interaction pour l'isoforme [bêta] du récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2] (TP[bêta]).Les résultats présentés dans cette étude montrent que les deux protéines interagissent directement et qu'elles forment un complexe au niveau du RE. L'interaction entre TP[bêta] et RACK1 s'est d'ailleurs avérée essentielle pour que le récepteur puisse être exporté du RE vers la membrane plasmique. Ces travaux ont donc révélé un rôle majeur de RACK1 dans la fonction de TP[bêta], plus précisément au niveau de son transport vers la surface cellulaire. Finalement, une nouvelle interaction entre le récepteur [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique ([bêta][indice inférieur2]-AR) et la petite protéine G Rab11 a été caractérisée.Les expériences réalisées démontrent que les deux protéines s'associent en cellules via une interaction directe. Une construction du [bêta][indice inférieur 2]-AR où les sites d'interaction avec Rab11 sont mutés a été générée. La mise en évidence d'un défaut de recyclage de ce mutant suite à une stimulation avec un agoniste spécifique a permis d'établir que l'interaction directe avec Rab11 est essentielle pour que le [bêta][indice inférieur 2]-AR puisse recycler de façon adéquate.Les résultats présentés dans cette thèse illustrent le rôle joué par trois nouveaux complexes protéiques dans la synthèse, l'export et le recyclage de RCPGs. L'identification et la caractérisation de ces nouvelles interactions permettra de mieux comprendre comment sont régulés les récepteurs DP, TP[bêta] et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, et permettra éventuellement d'améliorer les connaissances quant à la régulation de l'ensemble des récepteurs couplés aux protéines G.

Miz-1 est un facteur de transcription qui active la transcription de gènes cytostatiques tels que p15[indice supérieur 1NK4B] ou p21[indice supérieur CIP1]. Il s’agit d’une protéine de la famille BTB/POZ, qui possède un ensemble de 13 doigts de zinc de type Cys?His? dans sa portion C-terminale. L’activation de ces gènes par Miz-1 peut être régulée par les protéines SMAD. SMAD3 et 4 peuvent toutes deux se lier aux doigts de zinc 1 à 4 de Miz-1, et les autres doigts de zinc sont pressentis pour être responsables de la liaison à l’ADN. Les séquences reconnues par Miz-1 sur les promoteurs des deux gènes mentionnés ci-haut ont été identifiées, mais n’ont pas d’homologie entre elles. L’oncogène c-Myc a la possibilité de se lier à Miz-1, et cette interaction cause la répression des gènes normalement activés par Miz-1, favorisant ainsi la prolifération cellulaire. Cette interaction cruciale, de même que celle entre Miz-1 et l'ADN, est toutefois assez mal caractérisée. Le but du projet dont fait partie ce mémoire est d’éclaircir tout ce mécanisme de liaison. Ce mémoire étudie la structure et les propriétés dynamiques des doigts de zinc 5 à 8 de Miz-1, qui, selon l’hypothèse initiale, seraient impliqués dans la liaison au promoteur des gènes-cibles de Miz-1. La résonance magnétique nucléaire est la technique qui a été utilisée dans le but d’obtenir ces résultats, et une partie importante de ce mémoire est dévouée à la théorie derrière cette puissante technique. La détermination de la structure de ces doigts de zinc est en fait une seule des nombreuses étapes du projet de l’élucidation du mécanisme de transrépression par c-Myc/Miz-1. Suite à la présentation des structures de ces doigts de zinc, ce mémoire s’intéresse à leurs caractéristiques dynamiques très particulières pour ce type de domaine protéique. Nous avons en effet découvert que les doigts de zinc 5 à 8 présentaient un niveau très élevé d’échange conformationnel, et qu’une portion du doigt de zinc 6 ne peut être caractérisée structurellement à cause de mouvements dans l’échelle de la micro/milliseconde, eux-mêmes dus à des répulsions électrostatiques. En conclusion, nous proposons que le ZF 6 ait un rôle de charnière entre deux ensembles de ZFs dans Miz-1. Ces résultats permettent l’actualisation du modèle de liaison de Miz-1 au promoteur de p15[indice supérieur INK4B] qui avait été élaboré comme hypothèse, et ils nous rapprochent de la compréhension de la transrépression par c-Myc. [symboles non conformes]

La création de nouvelles fonctions basées sur la reconnaissance protéique et sur l'assemblage de domaines est un enjeu majeur en biotechnologie et est un moyen de comprendre les relations structures/fonctions des protéines engagées dans des processus d'interactions. Aujourd’hui, des bibliothèques de protéines artificielles obtenues par ingénierie peuvent être sources de protéines aux propriétés de reconnaissance analogues à celles des dérivés d’anticorps.L’équipe Modélisation et Ingénierie des Protéines a ainsi construit une banque de protéines à motifs structuraux répétés appelées « alphaReps ». Les alphaReps présentent des propriétés remarquables en termes de production et de stabilité. Contrairement à la plupart des anticorps et dérivés d’anticorps, elles peuvent même s’exprimer sous forme fonctionnelle dans le cytoplasme de cellules eucaryotes. De tels objets peuvent donc maintenant être utilisés comme des briques élémentaires en vue d’une ingénierie modulaire. Ainsi la construction de nouvelles fonctions de reconnaissance optimisées tant au niveau de la spécificité que de l’affinité sera possible en réarrangeant et/ou dupliquant ces briques élémentaires.Un premier volet de ce projet de thèse a consisté à construire puis étudier les propriétés biophysiques de protéines bidomaines basées sur les alphaReps afin de mieux comprendre les comportements adoptés par de telles constructions. Outre l’aspect fondamental de cette question, cette étude donnera « les règles » pour moduler de façon contrôlée les interactions entre ces protéines. Les résultats montrent qu'il est possible de créer de nouvelles fonctions par simple ajout d'un linker entre deux alphaReps : avidité, coopérativité, changement de conformation.Dans un second temps, l’objectif a été de développer, à partir des protéines bidomaines précédemment étudiées, de nouveaux biosenseurs basés sur le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) pouvant être utilisés in vivo et in vitro. Cette deuxième partie présente deux biosenseurs avec des limites de détection de l'ordre du nanomolaire. Les alphaReps utilisées dans ces constructions pouvant être changées en fonction de la cible souhaitée, il s'agit ici d'une preuve de concept pouvant être généralisée à n'importe quelle cible.Enfin la dernière partie de cette thèse s'est portée sur la conception et l'étude de nouveaux biosenseurs génétiquement codables. Ces biosenseurs présentent notamment l’avantage d’être utilisables immédiatement après production et ne nécessitent donc plus d’étape de couplage chimique. Les résultats obtenus montrent que la création de tels biosenseurs est possible mais qu’une optimisation reste encore nécessaire pour améliorer leur spécificité, leur stabilité et leur capacité de détection. / The creation of new protein functions based on recognition and molecular assembly is not only a major goal in biotechnology but is also a means to understand the relation structure/function of proteins involved in interaction processes. Today, libraries of artificial proteins obtained by engineering can be a source of proteins with recognition properties similar to the properties of antibodies.The team Protein Engineering and Modeling has thus created a library of proteins with structural repeats called the “alphaReps”. The alphaReps present remarkable properties in terms of production and stability. Unlike most of the antibodies and their derivatives, they can even be expressed and functional in the cytoplasm of eukaryotic cells. Such objects can therefore be used as building bricks in modular engineering. The construction of new optimized recognition functions both in specificity and in affinity can then be possible by rearranging or duplicating these elementary bricks.The first part of this thesis project consisted in the construction and study of the biophysical properties of bidomain proteins based on alphaRep in order to have a better understanding of the behaviour of such constructions. Beside the fundamental aspect of this question, this study will give the “rules” to modulate the interactions between these proteins in a controlled way. The results show that it is possible to create new functions such as avidity, cooperativity, conformational change, simply by adding a linker between two alphaReps.In a second step, the goal was to develop, with the bidomain proteins previously studied, new biosensors based on the FRET (Förster Resonance Energy Transfer) which can be used in vivo and in vitro. This second part presents two biosensors with limits of detection in the nanomolar range. Since the alphaReps used in these constructions can be changed depending on the chosen target, it is a proof of concept which can be adapted to any desired target.Finally, the third part of this thesis focused on the development of genetically codable biosensors. These biosensors have the particular advantage of being usable directly after production and therefore no longer require a chemical coupling step. The results show that the development of such biosensors is worth considering but an optimization is still required in order to improve their specificity, their stability and their detection capacity.

Les chaperons moléculaires, une famille de protéines diverses en structure et taille, sont dédiés à accompagner, replier et protéger d’autres protéines afin qu’elles atteignent leur conformation finale et leur emplacement dans la cellule. Dans ce but, les chaperons moléculaires doivent être hautement spécialisés dans l’exécution de tâches spécifiques, telles que le repliement, le transport ou la désagrégation, et polyvalents dans leur motifs de reconnais- sance, afin de pouvoir interagir avec un grand nombre de protéines di érentes. Di érents chaperons moléculaires collaborent au sein de la cellule, formant ainsi un réseau complexe qui assure le contrôle de la qualité du protéome. Les interactions entre les di érents partenaires de ce réseau et entre les chap- erones et leurs substrats sont souvent dynamiques, ce qui rend leur obser- vation structurale particulièrement di cile pour les techniques de biologie structurale. Par conséquent, il y a à ce jour peu d’information sur les struc- tures et mécanismes d’interaction au sein des complexes chaperon-substrate. Dans cette thèse, je présente des études sur la structure, la dynamique et les interactions entre les substrats de deux chaperons moléculaires, en utilisant diverses méthodes biophysiques et in vivo.Dans la première partie, je montre que la chaperone TIM910, située dans l’espace inter-membranaire des mitochondries, lie ses substrats, des protéines membranaires destinées aux deux membranes mitochondriales, d’une manière très dynamique. Non seulement le complexe TIM910 est en échange constant entre les espèces monomèriques et hexameriques, mais aussi le substrat lié échange entre mulitples conformations à une échelle de millisecondes. Sur la base de la résonance magnétique nucléaire (RMN), de small-angle X-ray scat- tering (SAXS), de l’ultracentrifugation analytique (AUC) et des expériences mutationnelles in vivo et des tests fonctionnels d’import dans les mitochon- dries, je propose un modèle structurale de l’interaction entre le chaperon et la protéine membranaire. TIM910 lie ses substrats dans une poche hydrophobe à l’extérieur du chaperon. Cette interaction est modulaire et se fait avec un ou deux hexamères de TIM910, en fonction de la longueur du substrat.Dans la deuxième partie, nous avons étudié le comportement du récepteur N-terminal du unfoldase ClpC1 de M. tuberculosis en présence d’antibiotiques et de ligands di érents. Le domaine N-terminal de ClpC1 est le site de liai- son de divers antibiotiques nouveaux contre M. tuberculosis. L’antibiotique Cyclomarin A supprime complètement la dynamique induite par le ligand arginine-phosphate. Nous proposons que cette suppression de la dynamique soit le principe fondamental du mécanisme d’action de cet antibiotique.Dans les deux cas, les structures X-ray des chaperons dans leur état apo et la structure de ClpC-NTD liée à des antibiotiques étaient disponibles, mais ces structures statiques ne su sent pas pour expliquer le mécanisme d’action. La structure X-ray de TIM910 n’a pas fourni d’ indication sur l’endroit ou la façon dont les substrats sont liés. De même, les structures X-ray du domaine N-terminal de apo et de Cyclomarine A de ClpC1 ne présentent que des di érences de structure mineures. Les deux exemples montrent que les données structurelles statiques souvent ne permettent pas d’expliquer le fonctionnement d’un système moléculaire, donc la combinaison de di érentes techniques et le développement de nouvelles méthodes pour étudier les complexes chaperon-substrat sont primordiaux pour comprendre leur fonction. / The diverse group of molecular chaperones is dedicated to accompany, fold and protect other proteins until they reach their final conformation and loca- tion inside the cell. To this end, molecular chaperones need to be specialized in performing specific tasks, like folding, transport or disaggregation, and versatile in their recognition pattern to engage many di erent client pro- teins. Moreover, molecular chaperones need to be able to interact with each other and with other components of the protein quality control system in a complex network. Interactions between the di erent partners in this network and between the substrate and the chaperone are often dynamic processes, which are especially di cult to study using standard structural biology tech- niques. Consequently, structural data on chaperone/substrate complexes are sparse, and the mechanisms of chaperone action are poorly understood. In this thesis I present investigations of the structure, dynamics and substrate- interactions of two molecular chaperones, using various biophysical and in vivo methods.In the first part I show that the mitochondrial membrane protein chap- erone TIM910 binds its substrates in a highly dynamic manner. Not only is the TIM910 complex in constant exchange between monomeric and hex- americ species, but also the bound substrate samples multiple conformations on a millisecond timescale. Based on nuclear magnetic resonance (NMR), small-angle X-ray scattering (SAXS), analytical ultracentrifugation (AUC) and in vivo mutational experiments I propose a structural model of the chap- erone/membrane protein interaction. TIM910 binds its substrates in a hy- drophobic pocket on the exterior of the chaperone in a modular fashion, where the number of TIM910 complexes bound depends on the length of the substrate.In the second part I studied the behavior of the N-terminal receptor do- main of the ClpC1 unfoldase from M.tuberculosis in the presence of di erent antibiotics and ligands. The N-terminal domain of ClpC1 is the binding site for various new antibiotics against M.tuberculosis. The antibiotic cyclomarin completely abolishes dynamics induced by the ligand arginine-phosphate. We propose that this suppression of dynamics is the underlying principle for the mechanism of action of this antibiotic.In both cases X-ray structures of the apo or antibiotic bound form were available, but not su cient to explain the mechanism of action. The X- ray structure of TIM910 provided no evidence on where or how substrates are bound. Likewise, X-ray structures of the apo and cyclomarin-bound N-terminal domain of ClpC1 show only minor di erences in structure.Both examples show that static structural data is often not enough to explain how a molecular system works, and only the combination of di er- ent techniques, including newly developed methods enable the atomic-level understanding of chaperone/substrate complexes.

CCR5 est un récepteur couplé aux protéines G répondant aux CC-chimiokines MIP-1, MIP-1, RANTES et MCP-1. Le récepteur structurellement le plus proche est CCR2b, qui répond à MCP-1. CCR5 est exprimé à la surface des lymphocytes T mémoire, les monocytes, macrophages et cellules dendritiques. Ce récepteur joue un rôle important dans l'établissement des réponses inflammatoires contre les agents pathogènes, mais aussi dans la pathogenèse de maladies inflammatoires chroniques. CCR5 constitue aussi avec CXCR4 un des co-récepteurs qui permettent l'entrée du virus de l'immunodéficience humaine dans ses cellules cibles. CCR5 présente donc un grand intérêt en thérapeutique, et tous les éléments susceptibles de mieux comprendre sa structure, ses mécanismes d'activation ou ses cascades de signalisation sont à même de contribuer au développement d'agents à usage thérapeutique. Deux nouveaux concepts sont apparus dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. D'une part, il est apparu que les récepteurs couplés aux protéines G pouvaient interagir directement avec un éventail de partenaires intracellulaires et réguler de cette façon des cascades de signalisation indépendamment des protéines G hétérotrimériques. D'autre part, un nombre croissant de récepteurs se sont révélés capables de former des homodimères et des hétérodimères. Nous avons dès lors appliqué ces deux concepts à l'étude de CCR5. Nous avons donc recherché de nouveaux partenaires de CCR5 par deux approches complémentaires, le double hybride et le « GST-pulldown ». Dans les deux cas, nous nous sommes focalisé sur le domaine C-terminal du récepteur CCR5, d'une part parce que la majorité des interactions mises en évidence pour d'autres récepteurs concernent ce domaine, d'autre part parce que l'extrémité C-terminale de CCR5 est conservée dans l'évolution et comporte différents motifs dont la relevance fonctionnelle a été démontrée. Par ailleurs, nous avons appliqués les techniques d’immunoprécipitation et de BRET pour étudier les phénomènes d’homodimérisation de CCR5, ainsi que son hétérodimérisation avec le récepteur apparenté CCR2b. Les conséquences fonctionnelles de ces interactions ont ensuite été étudiées. Par les techniques de double hybride et de pull-down, nous n’avons pas pu identifier de nouveaux partenaires de CCR5. Seules des interactions non-spécifiques ont pu être mises en évidence. Malgré une recherche intensive menée par d’autres groupes, un seul nouveau partenaire de CCR5 a été décrit entre-temps dans la littérature. Lors des études d'oligomérisation de récepteurs, nous avons mis en évidence la formation d'homodimères de CCR5 et CCR2b par des expériences d’immunoprécipitations et de BRET, ainsi que d'hétérodimères CCR5-CCR2b. Les conséquences fonctionnelles de ces observations sur la liaison de chimiokines, la signalisation et l'internalisation des récepteurs ont été étudiées. Contrairement aux données de la littérature, nous n'avons pas montré de coopérativité positive entre les récepteurs co-exprimés, quant à leur capacité à induire la libération de calcium intracellulaire. Par contre, nous avons mis en évidence une coopérativité négative en termes de liaison de chimiokines. Il apparaît ainsi que chaque dimère ne peut lier qu'une seule chimiokine, et qu'en conséquence, les ligands d'un récepteur peuvent entrer en compétition avec la liaison d'un traceur sur l'autre récepteur au sein d'un hétérodimère. Ces dimères de récepteurs apparaissent cependant comme dissociables, suite à la liaison d'agonistes ou de chimiokines induisant leur internalisation, car aucun phénomène de co-internalisation ne peut être mis en évidence. Ces observations, qui sont originales dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G, peuvent sans doute être généralisées à l'ensemble des récepteurs de chimiokines, voire à d'autres classes de récepteurs. Elles sont importantes pour l'interprétation de la pharmacologie des récepteurs dans leur environnement naturel, et sont susceptibles de développements importants permettant de mieux comprendre la structure des dimères, la dynamique de leur association, et les mécanismes d'activation des récepteurs en général au sein de leur structure dimérique.