La réaction de carbamylation, comme les réactions de glycation, d’oxydation ou de carbonylation, fait partie des modifications post-traductionnelles non enzymatiques des protéines. Elle correspond à la fixation d’acide isocyanique sur les groupements aminés des protéines et conduit à la formation de produits de carbamylation, dont fait partie l’homocitrulline. Des études in vitro ont mis en évidence le caractère délétère de la carbamylation des protéines sur leur structure et leur fonction. Des études in vivo ont montré l’accumulation tissulaire des produits de carbamylation au cours de l’insuffisance rénale chronique et du vieillissement. Cependant, peu de travaux ont porté sur la carbamylation des protéines intracellulaires.Ce travail a porté sur l’étude de la carbamylation des protéines intracellulaires, leur impact sur la cellule ainsi que leur devenir. De plus, un mécanisme de réparation des protéines carbamylées a été recherché.Nous avons montré, par une approche quantitative et qualitative, que les protéines intracellulaires pouvaient être carbamylées dans des conditions physiologiques et que leur carbamylation était augmentée en présence de cyanate ou d’urée. Nous avons également montré que les cellules étaient capables d’éliminer les protéines carbamylées, en impliquant le protéasome. Un phénomène de décarbamylation a été mis en évidence, ce qui ouvre des possibilités pour la mise en place de stratégies visant à limiter ou à inverser la carbamylation. / The carbamylation reaction, like glycation, oxidation or carbonylation reactions, is a non-enzymatic post-translational modification of proteins. It corresponds to the binding of isocyanic acid to protein amino groups and leads to the formation of carbamylation-derived products (CDPs), such as homocitrulline. In vitro studies have demonstrated the deleterious effect of carbamylation of proteins on their structure and function. In vivo studies have shown tissue accumulation of CDPs during chronic kidney disease and aging. However, studies on the carbamylation of intracellular proteins are lacking.This work was devoted to the study of the carbamylation of intracellular proteins, their impact on cell and their fate. In addition, a mechanism for repairing carbamylated proteins has been investigated.Our results showed, by quantitative and qualitative approaches, that intracellular proteins were carbamylated in physiological conditions and that their carbamylation rate was increased in the presence of cyanate or urea. We also have shown that cells were able to remove carbamylated proteins by a mechanism involving the proteasome. A phenomenon of decarbamylation has been highlighted, which opens up possibilities for the implementation of strategies to limit or reverse carbamylation.

Face au vieillissement accru de la population, les maladies neurodégénératives sont désormais un problème de santé publique majeur. Dans plusieurs cas, les dépôts amyloïdes sont constitués de fibres d’IDP (« intrinsically disordered protein »), comme par exemple le peptide Aβ dans les plaques séniles et TAU dans les PHF retrouvés dans la maladie d’Alzheimer, ou encore l’Alpha synucléine dans les corps de Lewy retrouvés dans la maladie de Parkinson. Dans ces maladies, l’accumulation de fibres amyloïdes est au cœur des mécanismes de neurodégénérescence. Ainsi, comprendre les mécanismes biologiques qui mènent à la formation des fibres peut permettre d’envisager de nouveaux traitements et/ou des molécules capables de ralentir ou arrêter la progression de ces pathologies. Ces travaux de thèse vont, dans une première partie, développer les nouvelles méthodologies appliquées à l’étude des IDPs par RMN. Dans une deuxième partie, ils s’attacheront à mieux comprendre les mécanismes d’agrégation de deux IDPs très impliquées dans des maladies neurodégénératives. Le premier cas étudié sera celui de la protéine TAU, impliquée dans la maladie d’Alzheimer, et le deuxième cas sera celui d’Alpha synucléine, impliquée dans la maladie de Parkinson. / Due to population aging, neurodegenerative diseases have become a major public health problem. In many cases, the amyloid deposits are composed of IDP (Intrinsically disordered protein) fibers, as Aß peptide in senile plaques and TAU in the PHF found in Alzheimer's disease, or Alpha synuclein in Lewy bodies found in Parkinson's disease. The accumulation of amyloid fibers is at the heart of the mechanisms of neurodegeneration. The understanding of the biological mechanisms that lead to the formation of the fibers may allow novel treatments and / or molecules that slow or stop the progression of these diseases. Firstly, in this thesis, we will develop new methodologies to study IDPs by NMR. In the second part, we will seek to better understand the mechanisms of aggregation of two IDPs involved in neurodegenerative diseases. The first case will be the aggregation of TAU protein in Alzheimer's disease and the second case will be the aggregation of Alpha synuclein in Parkinson's disease.

Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les protéines Tau sont impliquées dans plusieurs maladies neurodégénératives dénommées tauopathies, dont la plus fréquente est la maladie d’Alzheimer. Ces maladies se caractérisent par une accumulation intracellulaire de protéines Tau hyper- et anormalement phosphorylées sous forme de filaments. Ces lésions, dont l’origine et le rôle exact restent mal connus, sont au cœur d’un processus dégénératif conduisant à de nombreux troubles cognitifs et/ou moteurs et aboutissant le plus souvent à un syndrome de démence. Les protéines Tau appartiennent à la famille des protéines associées aux microtubules. Elles sont principalement neuronales et majoritairement localisées dans les axones où elles modulent l’assemblage et la stabilisation des microtubules. La mise en évidence d’autres localisations au sein des neurones, notamment dans le noyau, suggère néanmoins que Tau pourrait être une protéine multifonctionnelle. Cependant, bien que Tau soit observée dans le noyau des neurones, sa fonction n’a jamais été étudiée. Des études in vitro ont montré que la protéine Tau purifiée est capable de se lier et de stabiliser l’ADN en le protégeant de la dégradation par les DNAses ainsi que des altérations provoquées par les radicaux libres. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d’étudier in situ, la fonction de Tau nucléaire sur l’intégrité de l’ADN en condition de stress. Dans ce but, nous avons développé et caractérisé des modèles dans lesquels un stress thermique ou un stress oxydant, un mécanisme précocement impliqué dans la maladie d’Alzheimer, modulent la quantité de Tau dans le noyau de neurones. Nos résultats indiquent qu’en réponse à une hyperthermie, stress non toxique pour les cellules, Tau est déphosphorylée et s’accumule dans le noyau des neurones où elle se lie à l’ADN. Afin d’étudier le rôle de Tau nucléaire, nous avons analysé par Comet assay l’effet de l’hyperthermie sur l’intégrité de l’ADN dans des neurones sauvages ou déficients en Tau. Les résultats ont montré que ce type de stress entraîne des dommages à l’ADN spécifiquement dans les neurones déficients en Tau. Dans ces neurones, l’expression à l’aide de vecteurs adénoviraux de la Tau humaine possédant ou non une séquence de localisation nucléaire pour cibler Tau dans le compartiment nucléaire, prévient les dommages induits par le stress. Inversement, une hypothermie induit une hyperphosphorylation de Tau et prévient son accumulation dans le noyau. Dans ce contexte, nous avons observé la présence de dommages à l’ADN dans les neurones sauvages. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l’accumulation de Tau dans les noyaux protège l’ADN neuronal des dommages induits par un stress. En conclusion, ce travail montre, pour la première fois, un nouveau rôle de Tau en tant qu’acteur essentiel de la réponse précoce à un stress dans le neurone où la protéine Tau protège l’intégrité de l’ADN. Dans les tauopathies, l’altération pathologique de Tau pourrait avoir un impact délétère sur sa fonction neuroprotectrice de l’ADN et contribuer ainsi à la physiopathologie de ces maladies. / Tau proteins are involved in several neurodegenerative disorders, named tauopathies. Alzheimer’s disease (AD) is the most common tauopathy. These diseases are characterized by an intracellular accumulation of abnormally and hyperphosphorylated Tau into filaments. The etiology and exact contribution of these lesions are poorly understood but they induce degenerative process leading to cognitive and/or motor troubles and in several cases, dementia. Tau proteins belong to the family of microtubule associated proteins. They are mainly expressed in neurons and strongly localized in axons. Tau’s function is to promote assembly and stabilization of microtubules. However, the observation of additional neuronal localizations suggests that Tau could be a multifunctional protein. Indeed, Tau has been visualized in the nucleus of neurons, but its nuclear function has never been studied. In vitro studies have shown that purified Tau protein can bind to DNA. Tau-DNA complex could stabilize DNA, protecting it from DNAse’s degradation and from damages induced by hydroxyl free radicals. Thus, the aim of this work was to study, in situ, the function of nuclear Tau on DNA integrity in stress condition. In this purpose, we developed and characterized models in which thermal stress or oxidative stress, an early mechanism involved in AD, modulates Tau level in the nucleus of neurons. Our results indicate that, in response to heat stress, a non toxic cellular stress, Tau is dephosphorylated and accumulates into the nucleus of neurons. Tau binds to DNA and heat stress increases Tau-DNA complex formation. To study the role of nuclear Tau, we analyzed the effects of heat stress on DNA integrity by Comet assay in wild type or Tau deficient neurons. Results showed that this stress causes DNA damages specifically in Tau deficient neurons. In these neurons, the expression of Tau with adenoviral vector encoding for hTau with or without a nuclear localization sequence to target Tau in the nuclear compartment prevents heat stress-induced DNA damages. Conversely, cold stress induces Tau hyperphosphorylation and prevents its accumulation into the nucleus. In this context, we observed DNA damages in wild type neurons. All these results suggest that nuclear accumulation of Tau protects neurons from stress-induced DNA damages. In conclusion, this study enlightens, for the first time, a new role of Tau as an essential actor in the early response to cellular stress in neurons where Tau has a neuroprotective function on DNA in stress condition. In tauopathies, pathologic Tau alteration could lead to a loss of its neuroprotective function on DNA, that could likely contribute to the pathophysiology of the disease.

Le cytosquelette microtubulaire est une des cibles majeures en thérapie anticancéreuse. La caractérisation des isoformes d'une protéine est une problématique complexe en analyse protéomique. Pourtant il est crucial de mettre en évidence les variations de séquence primaire et les modifications post-traductionnelles qui peuvent dans certains cas être corrélées avec un phénomène physiologique et dans d'autres avec un état pathologique. Ainsi, la surexpression de l'isotype βIII de la tubuline, protéine constitutive des microtubules, peut avoir des conséquences importantes sur la régulation des propriétés dynamiques des microtubules et donc sur la réponse des tumeurs aux agents anticancéreux. Chaque isotype de tubuline se distingue principalement par les derniers acides aminés composant leur extrémité C-terminale. L'analyse top-down par MALDI-ISD est une approche de choix pour la caractérisation des isotypes de tubuline dont βIII. De plus, les propriétés spécifiques de fragmentation de cette protéine rendent possible son étude in situ sur coupes de tissue. Le choix de la matrice ainsi qu'une connaissance de la séquence primaire des protéines sont des paramètres importants lors des analyses MALDI-ISD. Une protéine telle qu'EB1, présentant une forte homologie de séquence C-terminale avec l'isotype α1B de la tubuline, est un candidat intéressant pour ce type d'approche. Cette protéine associée aux microtubules est le centre d'un réseau protéique régulant la dynamique des microtubules tel que dans le cas de l'angiogenèse tumorale. L'interaction entre EB1 et les protéines à domaine CAP-Gly se réalise par l'intermédiaire de son motif C-terminal -EEY où la tyrosine semble en être l'élément régulateur. La mise au point d'une approche de protéomique d'affinité pour l'identification et la quantification par spectrométrie de masse des complexe interagissant avec EB1 semble donc être un prérequis pour l'élaboration de nouveaux composés inhibant ce type d'interaction dans des contextes biologiques précis. / Microtubule is one of the major targets in cancer therapy. Protein isoforms characterization is a complex issue in proteomic analysis. Yet is is crucial to highlight primary sequence variations and posttranslational modifications that are associated with physiological processes or pathologies. Thus overexpression of βIII-tubulin isotype, protein that make up microtubules, can have consequences on the regulation of microtubules dynamic properties and therefore tumors response to anticancer agents. Each tubulin isotype is distinguished by the last amino acids of their C-terminus. MALDI-ISD top-down analysis is of interest for tubulin isotypes characterization as βIII. In addition, specific fragmentation properties of this protein make possible its in situ study on tissue sections. Matrix choice and knowledge of proteins primary sequence are important parameters for MALDI-ISD experiments. As protein such as EB1, that presents high sequence homology with α1B-tubulin isotype C-terminus, is an interesting candidate for this kind of approach. This microtubule associated protein is the core of a protein netword that regulates microtubule dynamics such as in the cas of tumor angiogenesis. The interaction between EB1 and proteins with CAP-Gly domain is realized through its C-terminal motif -EEY and tyrosine seems to be the regulatory element. The development of an approach by proteomics affinity for the identification and the quantification by mass spectrometry of complex interacting with EB1 appears to be a prerequisite for the development of new compounds that inhibit this peculiar mode of protein-protein interaction in specific biological contexts.

Depuis la mise en cuve du raisin jusqu'à la dégustation, les interactions entre tanins et protéines jouent un rôle prépondérant en Œnologie. Elles vont influencer de nombreuses caractéristiques du vin, notamment l'astringence. La cinétique et l'équilibre de l’interaction entre la BSA, une protéine modèle, et des tanins de raisin ont été étudiés. Différentes conditions de ratio initial, de pH et d'éthanol ont permis de mettre en évidence des propriétés essentielles du mécanisme. La non-stœchiométrie de la réaction et la dépendance linéaire du ratio initial tanin-protéine de la solution avec celui du précipité est un des points clefs. Les constantes cinétiques sont également dépendantes de ce ratio. La participation conjointe des forces hydrophobes et des liaisons hydrogènes a été montrée. En parallèle, le suivi des tanins et des protéines lors de la vinification et de la dégustation a été réalisé. La disparition des protéines dans le moût au début de vinification peut être corrélée au comportement des tanins. Une méthode HPLC permettant la titration de la salive par le vin montre un comportement classique des protéines salivaires dans l'interaction. La visualisation des protéines salivaires précipitant sous l'effet des tanins par gels 2D montre globalement une non-spécificité de l’interaction avec une précipitation non sélective des protéines salivaires par les tanins du vin. / From wine making to wine tasting, interactions between tannin and protein detain a prominent role in Enology, influencing several wine characteristics like its astringency. Interaction kinetics and precipitation equilibrium between BSA, a model protein, and grape seed tannin have been studied. Variations of initial ratio, pH and ethanol conditions pointed out essential properties of the mechanism. Lack of stoichiometry of the interaction with a linear dependence between initial and final tannin/protein ratio are key points. Kinetic constants are also related to this ratio. Mutual participation of both hydrophobic forces and hydrogen bonds has been shown. Along with these investigations in model solution, tannin and proteins have been followed during wine making and tasting. Disappearance of protein in the must and tannin behaviour can be linked. An HPLC method allowing the titration of saliva with wine indicates a classical behaviour of salivary proteins. Observation of salivary proteins precipitating with tannin thanks to 2D gels shows a non selective precipitation of salivary proteins by wine.

De nombreuses protéines ou domaines de protéines sont intrinsèquement non structurés/désordonnés (IUPs), mais possèdent néanmoins des fonctions diverses et importantes in vivo. La technique de choix pour étudier les IUPs est la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Cependant, pour obtenir de l'information à partir des différentes expériences de RMN possibles, les spectres doivent d'abord être attribués. Pour faciliter cette attribution, un outil graphique, semi-automatique qui utilise le concept des plans produit et somme a été développé. Cet outil a permis l'étude de deux IUPs individuelles, Tau et NS5A VHC. Les résonances RMN du squelette et des Cb ont été attribuées entièrement pour deux fragments de Tau (F3 et F5) et partiellement pour Tau entier P301L. Ces attributions RMN de Tau pourraient mener à davantage de compréhension sur le comportement structural de cette protéine quand elle se lie à, ou polymérise des microtubules. Aussi la formation des agrégés de Tau, qui est une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, pourrait être étudiée plus en détail. Dans un deuxième temps, la protéine non structurale 5A (NS5A) du virus de l'Hépatite C (VHC) a été étudiée. Les propriétés structurales du deuxième et troisième domaine (sur trois) de cette protéine ont été évaluées. De la structure hélice alpha résiduelle a été observée, ce qui pourrait indiquer des régions prédisposées à interagir avec d'autres partenaires cellulaires. On a également examiné l'interaction entre CypA et CypB et les domaines D2 et D3 de NS5A, car ces PPIases pourraient jouer un rôle dans la réplication de VHC / Many proteins and protein regions have been shown be intrinsically unstructured/disordered (IUPs) and still carry out diverse and important functions in vivo. The technique of choice for studying IUPs is Nuclear Magnetic Resonance (NMR). However, to be able to obtain information of many possible NMR spectra, these must first be assigned. This process is complicated in the case of IUPs by the increased amount of signal overlap. To facilitate the assignment, a graphical semi-automatic assignment tool using the concept of product and sum planes was developed. Using this tool, the study of individual IUPs by NMR became conceivable. A first considered IUP is human Tau. The backbone and Cb resonances have been fully assigned for two Tau fragments (F3 and F5) and partially assigned for full-length Tau P301L. These NMR assignments of Tau could eventually lead to more insight in the structural behaviour of the protein upon its binding to or polymerisation of microtubules, and in its aggregated form which is observed to be one of the hallmarks of Alzheimer's disease. Secondly, the Hepatitis C virus (HCV) non-structural protein 5A (NS5A) was considered. The structural properties of both the second and third domain (out of three) of this protein have been assessed and some residual a-helical structure was observed, which could be indicative of regions prone to interaction with other cellular partners. We have also examined the interaction between both CypA and CypB and the domains D2 and D3 of NS5A, as these PPIases might be involved in HCV replication

Les cathepsines à cystéine (CP) participent à la dégradation du tissu bronchique ainsi qu’à l’inactivation de protéines de l’immunité innée lors de maladies inflammatoires. Lors de la mucoviscidose (CF), on observe un déficit de la protéine du surfactant pulmonaire SP-A, qui participe à la défense antimicrobienne. Nous avons caractérisé les CP dans des expectorations CF et analysé leur capacité à hydrolyser le SP-A. La balance CP/inhibiteurs est déséquilibrée en faveur des CP et la cathepsine B participe à ce déséquilibre en hydrolysant leurs inhibiteurs, les kininogènes. Cependant, les CP ne sont pas des marqueurs de colonisation par Pseudomonas aeruginosa. De plus, la cathepsine S clive sélectivement SP-A dans son site de liaison aux sucres et aux lipides, induisant la perte de ses propriétés antibactériennes et d’agrégation, contribuant au déficit de la défense innée, à la perte d’homéostasie du surfactant et à l’exacerbation de l’inflammation au cours de la mucoviscidose. / Cysteine cathepsins (CP) that are implicated in bronchial tissue injuries and inactivation of antibacterial proteins emerge as key players in pulmonary inflammations. A decrease of pulmonary surfactant protein SP-A which is involved in innate host defence has been reported in patients suffering from cystic fibrosis (CF). We characterized sputum CP and their ability to hydrolyze SP-A. There is an imbalance CP/inhibitor tipped in favor of CP proteolytic activities. Furthermore, cathepsin B, which is able to degrade major plasma CP inhibitor, kininogens, favors this imbalance. However, CP are not biomarkers of colonization by Pseudomonas aeruginosa. Moreover, Cat S cleaves SP-A specifically in its lectin-like domain (CRD) that conducts to the loss of antibacterial and aggregation properties. So, CP, especially cathepsin S, participate to the deficiency of innate immunity, surfactant homeostasis defect and to the exacerbation of inflammatory response in cystic fibrosis.

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