HSPB8 appartient à la famille des petites protéines de choc thermique (sHSP ou HSPB) qui contient 10 membres HSPB 1-10. In vitro, HspB8 favorise la dégradation de l'Huntingtine mutée (Htt43Q), une protéine encline à agréger. HspB8 est un chaperon moléculaire capable de reconnaître des substrats protéiques mal repliés pour permettre leur repliement ou leur dégradation. HspB8 forme un complexe stable et stoechiométrique avec Bag3 (2 : 1), un cochaperon de Hsp70. Surexprimées, Bag3 et/ou HspB8 induisent la conversion de LC3-I en LC3-II indiquant que la macroautophagie est stimulée et bloquent l'agrégation de Htt43Q. Nous avons cherché dans cette étude, à déterminer si la formation du complexe HspB8-Bag3 est essentielle dans l'accomplissement de ce phénomène. Bag3 possède un domaine WW peu caractérisé, un domaine riche en proline capable d'interagir avec PLCy l , et un domaine BAG interagissant avec Hsp70 et Bcl-2. Le co-chaperon Bag3 étant modulaire, nous avons recherché quels domaines d'interaction fonctionnels lui sont essentiels. Afin de localiser le site de liaison à HspB8, nous avons réalisé des délétions systématiques des différentes régions de Bag3. L'interaction des différents délétants de 6His-Bag3 avec HspB8 a été analysée par co-puri fi cation au Nickel. Leur capacité à bloquer l'accumulation de Htt43Q dans les fractions solubles et insolubles au SDS et à augmenter le ratio LC3-II/I, marqueur de l'autophagie, a été évaluée. Nous avons déterminé que le site de liaison à HspB8 était constitué de deux motifs répétés de 14 acides aminés très conservés (B8bdl et B8bd2) depuis le poisson jusqu'à l'Homme. Dans les HEK-293T, en l'absence d'interaction avec HspB8, Bag3 est toujours capable de stimuler la macroautophagie et la dégradation de Htt43Q, bien qu'aucune activité de chaperon moléculaire ne lui soit associée in vitro. L'analyse des autres délétants suggère que l'extrémité N-terminale ainsi que la région riche en proline seraient essentielles pour l'activité de Bag3 envers Htt43Q, bien qu'elles ne le seraient pas pour stimuler la macroautophagie. Le domaine C-terminal de Bag3 serait responsable de la stimulation de la macroautophagie et sa délétion bloquerait aussi la dégradation de Htt43Q. La protéine Bag3, en permettant la dégradation des protéines mal conformées (comme Htt43Q) par macroautophagie, jouerait un rôle prépondérant dans le contrôle de la qualité des protéines.

La croissance de la population mondiale et l'évolution des habitudes alimentaires dans tous les pays vers une plus grande consommation d'aliments à base de protéines augmentent les préoccupations à l'échelle planétaire en ce qui concerne le risque de pénurie de protéines. Ceci est à son tour un facteur qui encourage la nécessité de mener des recherches approfondies et structurées pour trouver de nouvelles sources de protéines durables et de mieux valoriser les protéines existantes. Cependant, certaines protéines, notamment de source végétale, sont caractérisées par de médiocres propriétés fonctionnelles et ne permettent pas d'obtenir les aspects techno-fonctionnels souhaités dans les systèmes alimentaires. Afin de remédier à cet inconvénient, l'application de traitements alcalins pour modifier ces protéines et les transformer en ingrédients fonctionnels suscite un grand intérêt depuis quelques années. Ainsi, le présent projet a été réalisé dans un objectif d'utiliser la technologie d'électro-activation en solution comme traitement innovant, original et efficace pour une valorisation intégrale des ingrédients du lactosérum. En effet, le lactosérum en tant que co-produit de la production fromagère contient des composants de haute valeur nutritionnelle et technologique, notamment les protéines, mais aussi le lactose qui peut être utilisé pour produire des sucres à haute valeur ajoutée comme le lactulose qui est un prébiotique reconnu. La première étape de ce travail visait à déterminer l'impact du traitement d'électro-activation alcaline (EA) sur les propriétés physico-chimiques et fonctionnelles du lactosérum doux. L'impact de l'EA alcaline sur la solubilité des protéines, le moussage et les caractéristiques émulsifiantes du lactosérum a été également étudié. Le procédé de l'EA a amélioré la solubilité des protéines dans la plage de pH de 4,0 à 7,0. Contrairement aux échantillons de lactosérum non traités, qui formaient des émulsions micrométriques et instables à pH 3, les échantillons de lactosérum EA produisaient des émulsions nanométriques et stables à ce pH. De plus, bien que le lactosérum non traité et le lactosérum EA produisaient des émulsions stables à pH 7, les émulsions préparées avec le lactosérum EA avaient des tailles de particules plus petites et étaient plus stables contre la floculation des gouttelettes. Le lactosérum traité à l'EA avait tendance à générer des mousses avec un foisonnement et une stabilité significativement plus élevée. La présente étude a démontré que l'EA pouvait améliorer la fonctionnalité du lactosérum doux. Les protéines végétales sont de plus en plus populaires en raison de leurs bienfaits pour la santé et de leur durabilité. Cependant, comparativement aux protéines animales, les protéines végétales comme celles de canola ont une faible solubilité et des propriétés techno-fonctionnelles qui doivent être améliorées, ce qui les rend inefficaces en tant qu'ingrédients dans la formulation de différents aliments. Ainsi, dans le cadre du présent projet, le deuxième volet consistait à mener des études pour produire des protéines de canola solubles et fonctionnelles par complexation avec des protéines de lactosérum en utilisant la technologie d'électro-activation (AE) en solution. Les résultats obtenus ont permis de démontrer que la présence de lactosérum lors du traitement alcalin par EA de la solution de protéines de canola provoquait des interactions structurelles entre les protéines du lactosérum et les protéines de canola, conduisant au développement de nouveaux complexes de protéines qui sont caractérisés par un haut degré de solubilité et des propriétés émulsifiantes et gélifiantes nettement plus élevées que l'échantillon de canola non traité ou celui ayant subi un traitement par EA. En plus, par rapport aux protéines de canola non traitées qui présentaient une solubilité des protéines inférieure à 25 %, une faible capacité moussante, ainsi qu'une faible capacité d'émulsification et de gélification, les mélanges de canola/lactosérum traités par l'EA ont montré une solubilité des protéines d'environ 100 %, une capacité moussante de 300 %, une capacité de former des émulsions stables pendant 30 jours. Le troisième volet de ce projet a permis de démontrer que le traitement par électro-activation cathodique du lactosérum et des protéines de canola a permis de former un complexe qui est caractérisé par un fort pouvoir de gélification, ce qui constitue une contribution significative à l'amélioration du potentiel d'une co-utilisation des protéines de canola et du lactosérum pour la formulation d'aliments de type gel. Finalement, ce projet a apporté une contribution significative à l'avancement des connaissances sur le potentiel d'utilisation de la technologie d'électro-activation en solution pour la modification alcaline des protéines de lactosérum et du canola en vue d'améliorer leurs propriétés techno-fonctionnelles et de les utiliser comme ingrédients dans la formulation des aliments. En plus, il a été démontré que les traitements alcalins par électro-activation en solution peuvent être utilisés comme méthodes d'alcalinisation sans produits chimiques pour améliorer la solubilité et les propriétés fonctionnelles des protéines de canola et de leur mélange avec le lactosérum. / The growth of the world population (over 30% of the existing 7.5 billion people estimated by 2050) and shifts in global eating patterns towards higher consumption of protein-based foods increase worldwide concerns on protein shortage and encourage extensive research to find new sustainable protein sources, which encourages research to recover protein from sustainable sources and valorization of existing protein sources. However, some proteins show poor functionalities in food systems and fail to provide expected functionality in food systems. The application of alkaline treatments to modify these proteins to convert them into functional ingredients has aroused great interest in recent years. The purpose of this study was to explore the electro-activation technology as an innovative alkalinity method to characteristically valorize whey components. Whey as a by-product of cheese and casein manufacturing contains several valuable components, which have demonstrated promising biological and functional properties. The first step of this work aimed to determine the impact of alkaline electro-activation (EA) treatment on physicochemical and functional properties of sweet whey. The impact of alkaline EA on the protein solubility, foaming, and emulsifying characteristics of whey was investigated. The EA process improved the protein solubility at the pH range of 4.0-7.0. In contrast to untreated whey samples, which formed micron-sized and unstable emulsions at pH 3, EA-whey produced nano-sized and stable emulsions at this pH. EA-treated whey tended to generate foams with significantly higher over run and stability. This study demonstrated that EA could enhance the protein solubility of functionality of sweet whey. Further studies were carried out to produce highly soluble and functional canola proteins through pH shifting-driven complexation with whey proteins by chemical-free alkaline electro-activation. Plant proteins are becoming more popular due to their health benefits and sustainability. Compared to animal proteins, canola proteins have poor solubility and functionality, which make them in effective in food formulation. In the second part of the study, whey protein and canola protein were grafted together to create soluble protein composite with superior functionality. Sweet whey was used as a low-price source of animal protein to modify the canola proteins. It was found that the alkaline EA treatment was very effective in functionality improvement of both canola protein alone solution and their mixtures. Further more, the results suggested the presence of whey during the alkaline EA treatment of canola protein solution caused the structural alteration of canola proteins, and formation of protein particles with smaller size and higher surface charge. It resulted in the creation of novel composites proteins with superior solubility and emulsifying properties compared to the EA-treated canola alone sample. This enhanced solubility and emulsifying properties was concluded to be a result of lactose grating on the protein backbone of canola proteins. The overrun of canola protein alone solution increase from 100% to more than 500% after EA-treatment. However, the presence of whey in the EA-treated whey/canola protein solution slightly decreased the foam over run of the sample compared to EA-treated canola alone sample, possibly due to grafting lactose onto the surface of the proteins, resulting in a lower protein surface hydrophobicity. This study showed that the alkaline EA treatment was an effective process to enhance the solubility and functionality of canola proteins and their mixture with whey. In third part of the study, the consequences of alkaline electro-activation (EA) treatment on the flow behavior and gelling properties of canola protein and the mixture of sweet whey/canola protein. Canola protein alone (C) and whey/canola protein mixed suspensions (CW) were treated in an alkalizing electro-activation reactor and then naturalized to neutral pH. The alkaline EA treatment resulted in the production of small aggregates crosslinked by disulfide and covalent bonds. The gelation experiments showed that the EA-treated canola protein and whey/canola protein samples had a superior capacity to develop an integrated gel structure with higher mechanical and rheological properties and improved water holding capacity compared to the untreated samples. Characterization of interactions involved in the gel network structure suggested that the strong covalent interactions played a prominent role in the network of these EA-treated samples. The SDS-PAGE pattern of the gels made from EA-treated canola protein and whey/canola protein samples confirmed the presence of intensive protein polymerization through covalent crosslinking in these gels. The results of this part of the study suggest that the alkaline EA treatment is an effective tool for improving the gelation properties of canola proteins and producing whey/canola protein composite gels with improved functionality. Taken together, the current study showed that alkaline EA treatments can be used as chemical-free alkalinization methods to enhance the solubility, emulsifying and foaming properties, and gelation capacity, sweat whey, canola protein, and the mixture whey and canola protein.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

YB-1 est un régulateur important de l’expression des gènes dans les cellules eucaryotes. En plus de son rôle dans la transcription, YB-1 joue un rôle clé dans la traduction et la stabilisation des ARN messagers. Nous avons identifié plusieurs nouveaux partenaires de la protéine YB-1 par chromatographie d’affinité à partir de différents extraits tissulaires. Parmi ces partenaires, nous avons démontré que YB-1 interagit avec la tubuline et les microtubules et stimule fortement l'assemblage des microtubules in vitro. Les microtubules assemblés en présence de YB-1 ont une ultrastructure normale, et les données montrent que YB-1 recouvre probablement la surface extérieure des microtubules. De la même façon YB-1 stimule aussi l'assemblage de la tubuline-MAP qui est plus proche des complexes protéiques qui existent dans la cellule, et de la tubuline clivée par subtilisine ce qui suggère que son interaction avec la tubuline ne relève pas seulement d’effets électrostatiques. Nous avons enfin découvert que la tubuline interfère avec la formation des complexes ARNm:YB-1. Ces résultats suggèrent que YB-1 peut réguler l'assemblage des microtubules in vivo et que son interaction avec la tubuline peut contribuer à la régulation de la traduction des ARN messagers. En effet, in vivo, la traduction des mRNPs dépend de l’état de saturation de l’ARN messager par YB-1. Nous avons montré ici que lorsque le rapport YB-1:ARNm est faible, les complexes mRNPs possèdent des structures non-compactes, alors que les mRNPs saturés sont compacts. Ce changement structural est observé de façon parallèle à l'inhibition de la traduction des ARN messagers lorsqu’ils passent des polysomes (traduits) aux mRNPs libres (non traduits). De façon intéressante, nous avons découvert que les mRNPs saturés se lient aux microtubules via des interactions protéine:protéine et ont tendance à former des agrégats sur la surface des microtubules. Cette dernière propriété pourrait contribuer à la formation de granules de stress et à la localisation des mRNPs dans le cytoplasme. Finalement, un modèle de diffusion facilité a été développé pour expliquer l'assemblage des microtubules orchestré par les polyamines naturelles (telles que YB-1 qui sont positivement chargées dans la cellules). L’ensemble de ces données contribuent à une meilleure compréhension de processus biologiques fondamentaux concernant l’assemblage de la tubuline en microtubules et le trafic des ARN dans la cellule. Ils pourraient avoir un intérêt pour développer de nouveaux médicaments qui ciblent les microtubules. / YB-1 is a major regulator of gene expression in eukaryotic cells. In addition to its role in transcription, YB-1 plays a key role in translation and stabilization of mRNAs. We identify several novels YB-1 protein partners by affinity chromatography of different tissue extracts. We observed that YB-1 interacts with tubulin and microtubules and stimulates microtubule assembly in vitro. Microtubules assembled in the presence of YB-1 exhibited a normal single wall ultrastructure where YB-1 probably coats the outer microtubule wall. Furthermore, we found that YB-1 also promotes the assembly of MAPs-tubulin and subtilisin-treated tubulin. Additionally, we demonstrated that tubulin interferes with mRNA:YB-1 complexes. These results suggest that YB-1 may regulate microtubule assembly in vivo and that its interaction with tubulin may contribute to the control of mRNA translation. The translational status of mRNPs in vivo depends on amount of YB-1 associated with mRNA. We show here that at low YB-1:mRNA ratios mRNP complexes possess an incompact structures, whereas saturated mRNPs are compact. This structural change corresponds to translation inhibition when mRNA moves from polysomal (translatable) to free (untranslatable) mRNPs. Saturated mRNPs bind to microtubules via protein:protein interactions and tend to self-aggregate on microtubule surface. This property could contribute to stress granule formation, mRNPs traffic and localization of translation apparatus within cytoplasm. Finally, the facilitated diffusion model was developed to explain enhancement of microtubule assembly by positively charged natural polyamines in living cells. Altogether our data contribute to the understanding of fundamental biological processes.

Ce travail de thèse est une contribution à la compréhension de l’encrassement des échangeurs de chaleur à plaques (ECP) lors du traitement thermique de solutions de protéines du lactosérum. Ce travail vise principalement à établir les liens existants entre la composition des différentes solutions de lactosérum (teneurs en β-lactoglobuline (β-lg) et en calcium), leurs comportements en dénaturation et leurs aptitudes à encrasser les surfaces chaudes de l’ECP. Cette étude a montré l’influence de la teneur en calcium et du ratio molaire calcium/protéine sur les mécanismes de dénaturation thermique de la β-lg, les distributions des masses de dépôt protéique, la dynamique de formation de dépôt et la structure des premières couches de dépôt en surface. Par ailleurs, la détermination des constantes cinétiques de dénaturation chaude de la β-lg et la connaissance de l’histoire thermique du produit ont permis de simuler les profils de concentrations des différentes espèces de β-lg (native, dépliée et agrégée) le long de l’ECP et d’étudier la corrélation entre la masse de dépôt sec et les quantités de β-lg dénaturées dans l’ECP. Ainsi, cette simulation a pu mettre en évidence le faible rôle des agrégats dans les mécanismes d’encrassement et à la fois l’influence de l’espèce dépliée et de la teneur en calcium dans la distribution du dépôt protéique. Enfin, une corrélation originale entre la distribution de la masse de dépôt sec dans chaque canal de l’ECP et les paramètres cinétiques de dénaturation a été établie pour chaque solution protéique modèle étudiée, montrant ainsi l’impérieuse nécessité des approches de génie de la réaction chimique pour prédire l’encrassement protéique. / This Ph.D. work is a contribution for understanding the fouling in plate heat exchangers (PHE) during the heat treatment of whey protein solutions. This work aims at establishing the relationship between the composition of the different whey protein solutions (β-lactoglobulin content (β-lg) and calcium), their denaturation behaviour and their ability to foul the hot surfaces of the PHE.This study showed the strong impact of the calcium content and the calcium/protein molar ratio on the β-lg thermal denaturation mechanisms, the distributions of the deposit fouling, deposit formation dynamics and the structure of the first deposit layers.The determination of the β-lg denaturation kinetic constants and the knowledge of the thermal profile allowed to simulate the concentration profiles of the different β-lg species (native, unfolded and aggregated) along the PHE and to study the correlation between the dry deposit mass of and the amount of denatured β-lg in the PHE. This simulation highlighted the negligible role of the aggregates in the fouling mechanisms and both the influence of the unfolded species and the calcium content on the distribution of protein deposition. Finally, a new correlation between the distribution of dry deposit masses in each channel of the PHE and the denaturation kinetic parameters was determined for each studied protein solution, showing thus that chemical reaction engineering approaches are requested for predicting proteinaceous fouling.

La protéine Tax du virus HTLV-1 a les propriétés d'un oncogène viral et joue un rôle important dans l'induction de la transformation cellulaire menant à l'ATL. L'activité oncogène de Tax résulte d'effets pléiotropes sur divers mécanismes cellulaires y compris l'activation de l'expression de gènes cellulaires spécifiques par la voie NF-B et la dérégulation de la progression du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que Tax est une protéine hautement modifiée dans diverses lignées cellulaires y compris dans les lymphocytes T transformés par HTLV-1. L'ensemble des modifications post-traductionnelles de Tax forment une suite hiérarchisée qui contrôlent la localisation intracellulaire de Tax, sa capacité d'activer les kinases IKK et la voie de signalisation des facteurs NF-B et sa capacité d'induire un arrêt dans la progression de la mitose. En effet, la phosphorylation de Tax contrôle son ubiquitination et son passage dans le noyau où elle est sumoylée et acétylée. L’ubiquitination et la sumoylation de Tax agissent de manière concertée pour permettre l’activation de l’expression des gènes par la voie NF-B tandis que son acétylation permet de lever le blocage induit en fin de mitose. Les effets exercés par les modifications post-traductionnelles sur les fonctions oncogènes de la protéine Tax suggèrent que ces modifications pourraient être des cibles thérapeutiques pour le développement de traitements contre l'ATL.

La vision traditionnelle de la synthèse protéique chez les eucaryotes comprend un ARN messager (ARNm) qui porte un seul cadre de lecture ouvert (ORF). Chaque gène codant eucaryote produit généralement une protéine canonique et éventuellement une ou plusieurs isoformes. Cependant, de nombreuses évidences expérimentales récentes démontrent que le protéome des eucaryotes a été sous-estimé, et que les cellules sont capables de synthétiser des protéines qui n’étaient jusqu’alors pas prédites. Ces nouvelles protéines « alternatives » (altProts) peuvent être issues de la traduction d’ORFs non annotés contenus sur des ARNms, ou des ARNs non codants. Ces découvertes ont été possibles grâce aux progrès techniques réalisés en biochimie analytique en protéomique par spectrométrie de masse. Dans le cadre de ces analyses, deux approches sont privilégiées. La première, ou bottom-up se base sur les produits peptidiques issus d’une digestion enzymatique des protéines quand la seconde ou top-down est basée sur la mesure des protéines entières. Les travaux réalisés dans cette thèse s’articulent autour du développement de stratégies pour la découverte et la caractérisation des altProts par approches protéomiques bottom-up et top-down. Ces aspects sont décrits dans plusieurs publications scientifiques qui seront présentées dans ce manuscrit. Elles comprennent une revue de bibliographie, deux publications relatives à l’application de l’approche top-down par micro-extractions de tissus de cerveau de rat et de biopsie tumorale ovarienne et une publication relative à la détermination de la stœchiométrie de deux protéines, l’une alternative et l’autre canonique toutes deux issues du même gène. / The traditional view of protein synthesis in eukaryotic species involves one messenger RNA (mRNA) bearing a single open reading frame (ORF). Thus, each eukaryotic coding gene may produce one canonical protein and possibly one or more of its isoforms. However, numerous experimental evidence report that eukaryotic proteomes may have been under-estimated and that cells are capable of synthetizing proteins which had not been predicted thus far. These novel proteins, termed “alternative proteins” (altProts) may be translated from non-canonical ORFs localized in mRNAs or from RNAs annotated as non-coding. These discoveries were made possible thanks to technical progresses in analytical chemistry in mass spectrometry-based proteomics. These analyses are based on two main strategies; the “bottom-up” approach is based on the peptidic products of enzymatic digestion of native proteins whereas the second and more recent approach, termed “top-down”, is based on the analysis of intact protein by mass spectrometry. The work described in this thesis is focused on the development of experimental strategies helping the discovery and characterization of altProts using bottom-up and top-down approaches. The findings are described in scientific publications which are included in the thesis. These publications include a review, two publications on the application of the top-down approach using micro-extractions on rat brain tissue and ovarian tumor biopsy and one publication related to the stoichiometry elucidation of a canonical and an alternative protein both encoded within the same gene.

Avec la constante augmentation des prix du pétrole et la diminution des ressources fossiles, des alternatives « vertes » doivent être trouvées. Ainsi, des premières recherches ont été menées sur la possibilité de mettre au point des colles pour panneaux à base de bois dans lesquelles une partie du phénol a été substituée par des protéines de blé. De même, les tanins sont des molécules polyphénoliques naturelles et peuvent être une alternative aux produits chimiques de synthèse issus du pétrole. Les tanins de châtaignier, tanins hydrolysables, ont été utilisés afin de substituer une partie du phénol lors de la synthèse de résines phénoliques. Ces résines ont été étudiées et utilisées pour la fabrication de mousses phénoliques rigides. Cette démarche constitue un pas de plus vers la mise au point et la future commercialisation de matériaux plus respectueux de l’environnement. En outre, les tanins ont également été utilisés lors du développement de mousses rigides biosourcées tanins-furaniques, cette fois-ci il s’agit de tanins condensés : tanins de quebracho, couplés à de l’alcool furfurylique (d’origine agricole). Ces mousses « vertes » présentent une bonne résistance mécanique, de bonnes performances thermiques et elles ne brûlent pas, ainsi, elles sont totalement adaptées à une utilisation pour l’isolation des bâtiments. Enfin, de nouveaux types de matériaux issus de produits naturels (tanins et alcool furfurylique) ont été mis au point lors de cette thèse : des matériaux abrasifs et de friction biosourcés. Des roues abrasives et des disques abrasifs ont été développés et testés. Et des plaquettes de frein automobile ont été fabriquées et testées en conditions réelles. Tous ces nouveaux matériaux présentent d'excellentes propriétés par rapport aux matériaux commerciaux / With the constant increase of oil prices and with the dwindling of fossil resources, "green" alternatives must be found. Thus, first research was conducted on the possibility to develop synthetic phenolic adhesives for wood-based panels where a part of phenol was substituted by wheat proteins. Similarly, tannins which are natural polyphenolic molecules can be used as an alternative to synthetic chemical products. Chestnut tannin, a hydrolysable tannin was used to substitute part of phenol during the synthesis of phenolic resins. The characteristics of these resins were studied and the resins used for the manufacture of rigid phenolic foams. This is a new step towards the development and future commercialization of more environmentally friendly materials. Furthermore, condensed flavonoid tannins were also used in the development of tannins-furanic biobased rigid foams. Quebracho wood tannin extract was coupled with furfuryl alcohol another material of natural, agricultural origin. These "green" foams show good mechanical strength, good thermal performance and do not burn, thus they are entirely suitable for use in building insulation. Finally, new types of materials made from the same natural products (tannins and furfuryl alcohol) were developed during the research described in this thesis: biobased abrasive and friction materials. Abrasive wheels and abrasive discs for steel molding and steel cutting using a biobased matrix were thus developed and tested. Moreover, automotive brake pads were prepared and were tested under real vehicle application conditions. All these new materials showed excellent properties compared to commercial materials and yielded excellent results comparable and sometime superior to their synthetic commercial equivalents

Les domaines thymosineβ/WH2 sont une famille de protéines intrinsèquement désordonnées impliqués dans le remodelage du cytosquelette d’actine. Ces domaines de 20 à 50 acides aminés existent seuls ou au sein de protéines modulaires, isolés ou répétés. Ils exercent de nombreuses fonctions : ils séquestrent des monomères d’actine, promeuvent l’assemblage du filament, nucléent, fragmentent et coiffent les filaments. Tous les domaines WH2 interagissent de manière similaire avec l’actine via une hélice amphipathique N-terminale suivie d’un brin central et d’une région C-terminal plus ou moins longue et dynamique. Une étude antérieure a montré que la fonction des domaines βT/WH2 isolés était liée à la dynamique du complexe avec l’actine déterminée par une combinaison d’interactions intermoleculaires le long de l’ensemble de la séquence. Les mécanismes expliquant la multifonctionnalité des domaines WH2 répétés restent vagues. Ce travail de thèse présente tout d’abord la production d’actine recombinante, sauvage et mutée dans le système baculovirus/Sf9 pour la biologie structurale ainsi que le développement de stratégies de marquage isotopique en cellules d’insectes. La deuxième partie s’intéresse à la caractérisation structurale et dynamique de domaines WH2 seules en solution : deux domaines isolés et deux protéines contenant deux domaines WH2. Les hélices amphipathiques N-terminales sont partiellement repliées avec des populations variant selon les protéines. La préstructuration des régions C-terminales est plus variable, complètement désordonnée ou partiellement hélicoïdale selon les protéines. La dernière partie présente l’étude de l’interaction de ces protéines avec l’actine. / WH2 domains are a family of intrinsically disordered proteins involved in actin cytoskeleton remodeling. These short domains, isolated or repeated in various actin binding proteins display a low sequence identity and a large panel of functions such as sequestration of actin monomers, promotion of unidirectional assembly, nucleation, fragmentation, filament capping. All WH2 domains fold similarly upon actin binding. They form an extended interface along actin, with an amphipathic N-terminal helix followed by an extended central strand and a more dynamic C-terminal region. Previous work on single βT/WH2 domains showed that function was linked to the dynamics of the complex with actin which is determined by a combination of intermolecular interactions throughout the sequence. The multifunctionality of WH2 tandem repeats is still elusive. The present work first describes production of recombinant wild-type and mutant actin in insect cells and isotopic 15N-labeling for NMR spectroscopy. As a first step to gain insight into the folding upon binding mechanism of functionally different WH2 repeats, we investigated the conformational behavior of two single domains and two tandem repeats free in solution by NMR. The N-terminal amphipatic helix is partially formed but with various propensities depending on the proteins while the C-terminal region that may form an helix in the complex may be either completely disordered or partially formed in absence of actin. Investigation of WH2:actin interaction for the same four proteins is described in the last chapter.

L’érythropoïèse est un processus complexe qui aboutit à la formation de 100 milliards de globules rouges/jour. Elle est finement régulée pour permettre d’adapter la production de globules rouges aux besoins en oxygène des tissus périphériques. La compréhension des processus complexes mis en jeu lors de la régulation de l’érythropoïèse requière l’étude de nouveaux acteurs moléculaires tel que la protéine NACA (chaîne alpha du complexe associé aux polypeptides naissants), mise en évidence comme un régulateur positif de la différenciation érythroïde humaine. Nous avons identifié ERGIC-53 comme nouvel interacteur de NACA. ERGIC-53 est une lectine mannose spécifique membranaire impliquée dans le transport des glycoprotéines du Réticulum Endoplasmique (RE) vers le compartiment ERGIC (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment). Nous avons démontré que ERGIC-53 et NACA participent à la régulation du trafficking de l’EPO-R. NACA est aussi un régulateur négatif de l’apoptose médié par FADD. Nous avons initié l’étude de NACA dans les Syndromes Myélodysplasiques de bas risque (ES-MDS) présentant une déficiente de l’érythropoïèse due à l’apoptose des progéniteurs érythroïdes. Nous avons démontré que la transduction de NACA des progéniteurs CD34+ de ES-MDS restore la différenciation érythroïde et augmente la survie des progéniteurs érythroïdes. De plus, cette étude suggère que la quantification du mRNA NACA pourrait être un nouveau marqueur prédictif de réponse au traitement par rhEPO. En conclusion, notre travail a souligné qu’une simple molécule de la machinerie cellulaire est impliquée dans la différenciation érythroïde normale et des ES-MDS. / The erythropoiesis is a complex process that leads to the formation of 100 billion red cells per day. It is finely regulated to adjust the production of red blood cells according to oxygen needs of peripheral tissues. To understand the complex processes involve in the regulation of erythropoiesis, it requires the study of molecular actors such as the NACA protein (the alpha chain of the nascent polypeptide-associated complex), highlighted as a positive regulator of erythroid human differentiation. We have identified ERGIC-53 as a novel interactor of NACA. ERGIC-53 is a lectin mannose-specific membrane involved in the transport of glycoproteins from the Endoplasmic Reticulum (ER) to the ERGIC compartment (Golgi Endoplasmic Reticulum Compartment Intermediate). We have shown that ERGIC-53 and NACA are involved in the regulation of trafficking of EPO-R. NACA may be also a negative regulator of apoptosis mediated by FADD. We investigated the role of NACA in early stages of myelodysplastic syndromes (ES-MDS) which have ineffective erythropoiesis due to apoptosis of erythroid progenitors. We have demonstrated that transduction of NACA in CD34 + progenitor cells from ES-MDS restores erythroid differentiation and increased survival of erythroid progenitors. Moreover, this study suggests that the level of mRNA NACA may be a new predictive marker of response to rhEPO treatment. In conclusion, our work highlighted that a molecule of the cellular machinery is involved in erythroid differentiation of both normal and ES-MDS CD34+ cells.