Les parasites protozoaires du genre Leishmania sont les agents microbiens responsables d’un groupe de maladies connues sous le nom de leishmanioses. L’infection productive dépend de la capacité de survie du parasite suite au premier contact initial du système immunitaire de l’hôte. Par conséquent, la prolifération du parasite à l’intérieur des phagolysosomes sera responsable de la pathologie. Les promastigotes stationnaires, récupérés en culture axénique de laboratoire sont semblables aux promastigotes métacycliques. Ces derniers sont fortement immunomodulateurs et sont considérés, traditionnellement comme la forme la plus infectieuse du parasite. Les protéines sécrétées de différents organismes ont été directement impliquées dans plusieurs pathologies. Donc, il est possible que les protéines sécrétées par Leishmania, soient également impliquées dans la capacité du parasite à subvertir le système immunitaire. Les avancées récentes dans l’étude du sécrétome de plusieurs types de Leishmania ont permis d’affirmer que le sécrétome est fort complexe. Nous avons déterminé qu’environ 300 protéines sont sécrétées par le parasite, la plupart d’entre elles ayant aucun signal canonique de sécrétion. Le sécrétome de Leishmania est donc composé surtout de protéines qui sont libérées par sécrétion non conventionnelle, . Afin d’étudier le sécrétome associé à la virulence, nous avons développé et validé une approche qui a permis l’étude des composants de l’exoprotéome des parasites stationnaires et logarithmiques. Cette approche était basée sur la culture continue des parasites dans un milieu de culture sans supplément de sérum de bovin fœtal, cRPMI, dans lequel la virulence des parasites est maintenue. Grâce à cette approche nous avons mis en évidence un exoproteome distinct de ceux jusqu’à date répertorié. La méthode de production et de la récupération de l’exoproteome sont donc très importants. Notre exoprotéome est dominé par la GP63, une glycoprotéine dont l’importance centrale dans l’infection a été déjà validée. La culture continue des parasites est donc essentiel pour avoir un exoprotéome représentatif. Nous avons également déterminé que la cultutre en continu pouvait amener à une diminution de la virulence et quarante divisions sont nécessaires pour une perte de virulence significative. Par conséquent toutes nos études se sont fait chez des parasites comptant moins de 20 divisions. Le principal mécanisme associé à la perte de virulence a été identifié comme une incapacité de se différencier en amastigotes. Le cRPMI a donc permis la culture des parasites pour l’étude de l’exoprotéome tout en maintenant la virulence des parasites. La présence de vésicules, décrite déjà comme un composant de l’ exoprotéome, a été confirmée aussi par notre approche continue et a été confirmé, d’ailleurs, dans l’exoproteome des parasites en phase de croissance logarithmique. Les vésicules récupérées des parasites logarithmiques diffèrent de celles recueillies de parasites en phase stationnaire de croissance. En effet des protéines potentiellement impliquées dans la rénovation et le recyclage du contenu protéique, tels certains composants du ribosome étaient enrichies dans les parasites en phase logarithmique tandis que les vésicules des parasites stationnaires ont un contenu protéomique ayant des caractéristiques similaires aux corps apoptotiques des cellules de mammifères. En dehors de la GP63, plusieurs autres protéines décrites comme immunomodulatrices ont été retrouvées dans l’exoprotéome des parasites stationnaires, ce qui indique que celui-ci contient un ensemble de protéines avec un potentiel d’interaction directe avec les cellules du système immunitaire. Immunologiquement, l’exoprotéome récupéré des parasites stationnaires a été capable d’activer les cellules dendritiques, laissant supposer une fonction importante dans la création d’un environnement inflammatoire précoce lors des premières étapes de l’infection. En conclusion, la recherche développée a contribué à l’avancement des connaissances actuelles sur la biologie du Leishmania, grâce au développement et à la validation d’une nouvelle approche afin d’étudier son exoprotéome. L’exoprotéome récupéré était dynamique, il avait une composition spécifique, dépendant du stade du parasite. Cet exoprotéome avait des effets spécifiques sur les cellules dendritiques et il jouait un rôle important dans les étapes précoces de l’infection. Cette étude a ouvert des nouvelles perspectives sur l’exoprotéome de Leishmania spp. permettant la découverte de nouvelles protéines immunomodulatrices et, en corrolaire, de nouvelles cibles pour le contrôle de la maladie associée au parasite. / Protozoa parasites of the genus Leishmania are the responsible for a group of diseases known as leishmaniasis. The infection is associated with the capacity of these parasites to survive in the phagolysosomes of infected macrophages. Successful infections with pathogenic Leishmania spp. are linked to the capacity of the parasite to survive the initial impact of the host immune system and to interfere with the infected cells rendering them incapable of eliminating the parasites. The secreted proteins from the parasite are expected to be in the front line for interactions with the host. Recent advances in the study of the secretome of Leishmania spp. depicted it as highly complex with the majority of proteins without any predictable secretion signal. The secretome is composed of proteins that are released by different mechanisms like conventional and unconventional secretion. Several proteins secreted by Leishmania spp. are known to interact and influence the outcome of the disease by directly interfering with the host immune cells. The proteomic studies on the Leishmania spp. secretome identified more than three hundred proteins released into the exterior. The stationary promastigotes recovered in axenic culture were enriched in the most virulent promastigote form, the metacyclic parasites. Therefore we aimed at evaluating the exoproteome associated with the stationary parasites. To achieve this we developed and validated an approach that would enable the study of the exoproteome components of stationary and logarithmic parasites. This approach was based on the continuous cultivation of the parasites in a medium without any protein supplementation that maintained the basic virulence of the parasites. The continuous approach produced a GP63-rich exoproteome that was distinct from the traditional approaches indicating that the process of recovery induced a significant bias in the study. Furthermore as the continuous approach was chosen, we determined the mechanisms associated with loss of virulence assuring that fully virulent parasites were used. At least forty parasite divisions were required for a short-term loss of virulence. The main mechanism associated with loss of virulence was identified as a growing incapacity to differentiate into amastigotes. The defined time interval of forty divisions enabled us to evaluate the exoproteome without loss of virulence related to the subculture. The protein-free medium developed, cRPMI, retained parasite virulence and morphology similar to that of parasites grown in standard media. The exoproteomes recovered using cRPMI were dominated by proteins without any recognizable secretion sequence, in concordance with reports on other Leishmania spp. The presence of vesicles, already reported as a component of the exoproteome, was also confirmed using our continuous approach. Furthermore, the presence of vesicles in the logarithmic parasites exoproteome was confirmed. The protein content of these vesicles presented a dynamic profile that was dependent on the parasite stage. The vesicles recovered from logarithmic parasites seemed to be related to protein turnover, being significantly enriched in ribosomal components. The vesicles from stationary parasites are of different composition, presenting some characteristics similar to apoptotic bodies. Immunologically the exoproteome recovered from stationary parasites was able to activate dendritic cells suggesting that the exoproteome might have a function in the creation of an early inflammatory environment leading to the recruitment of neutrophils and monocytes that might function as safe heavens for the parasites. In conclusion, our research has contributed to the advance of the current knowledge of Leishmania biology, through the development and validation of a novel approach to study the Leishmania secretome. The exoproteome recovered from stationary parasites had specific immune-modulating effects on bone marrow derived dendritic cells, indicating that it can play an important role in the precocious steps of infection. This study opened new perspectives into the Leishmania spp. exoproteome that will enable the search of new immunomodulatory proteins that might become the future targets to leishmaniasis control.

Cette thèse comprend deux sujets. La première partie est en termes de système de défense bactérien. Les procaryotes et les eucaryotes possèdent des gènes de résistance dans leur génome, qui peuvent être soit innés soit acquis, protégeant contre les infections virales. Au niveau de la population, l'infection abortive (Abi) sert de mécanisme de défense immunitaire inné contre l'invasion par le phage. Les gènes antiviraux AbiV sont prévalents dans les génomes bactériens et présentent des caractéristiques diverses en termes d'évolution et de composition génomique. Les systèmes Abi sont considérés comme des traits altruistes, car les cellules infectées se suicident pour empêcher le cycle lytique du phage et protéger leur communauté. La protéine AbiV appartient à la super famille de liaison aux nucléotides des eucaryotes et des procaryotes (HEPN) et peut fonctionner comme un type d'endoribonucléase. On peut la trouver dans de nombreuses bactéries, dont *Lactococcus lactis, L. paracamosus, Streptococcus pneumoniae* et *Streptococcus oralis*. Dans cette étude, nous avons utilisé le système AbiV de *Lactococcus lactis* non pathogène comme organisme modèle, qui confère une résistance aux phages lactococciques virulents du genre Skunavirus. Cependant, la protéine AbiV a une séquence unique, et aucun homologue structurel est connu. De plus, le mécanisme moléculaire de son activité antiphage reste flou. Notre exploration du système AbiV de *Lactococcus* a révélé un nouveau duo : *abiV1* et *abiV2*, des acteurs essentiels dans son rôle de système de toxine-antitoxine de type III. La toxine, AbiV (encodé par *abiV1*), émerge comme une RNase au sein de la super famille HEPN, distinguée par le motif Rx$\mathsf{_{4-6}}$H. À travers des essais *in vivo* et de la spectrométrie de masse, nous avons observé l'expression d'AbiV indépendamment de la présence de phages, tandis que des expériences *in vitro* ont élucidé sa dégradation sélective de l'ARN ribosomal, laissant l'ARNm intact. En revanche, *abiV2*, le composant antitoxine, fonctionne comme une molécule d'ARN, contrecarrant l'activité nucléase de AbiV1. L'examen structural d'AbiV révèle une zone chargée positivement à travers son dimère, cruciale pour l'ancrage des molécules d'ARN. De plus, notre investigation souligne le rôle indispensable de la région N-terminale d'AbiV (acides aminés 1 à 23) dans son activité de RNase ; un AbiV tronquée et dépourvue de ce segment a présenté des états conformationnels incompatibles avec la liaison à l'ARN. Cette étude offre de nouvelles perspectives sur la dynamique opérationnelle du système antiviral AbiV. La deuxième partie : les endolysines. L'étude des endolysines de bactériophages. Les endolysines, également connues sous le nom d'enzymes muralytiques ou lysines, sont une classe d'enzymes produites par les bactériophages (virus qui infectent les bactéries) dans le cadre de leur cycle de réplication. Ces enzymes jouent un rôle crucial dans le cycle de vie des phages en facilitant la libération des nouvelles particules virales formées à partir des cellules bactériennes hôtes. La fonction principale des endolysines est de dégrader la couche de peptidoglycane, qui est un composant structurel majeur des parois cellulaires bactériennes. La couche de peptidoglycane fournit intégrité structurelle et protection aux cellules bactériennes, et sa dégradation par les endolysines conduit à la lyse ou à la désintégration de la paroi cellulaire. Cela entraîne finalement l'éclatement de la cellule bactérienne et la libération des particules phagiques nouvellement répliquées, leur permettant d'infecter et de se propager dans d'autres cellules bactériennes. Les endolysines se composent généralement d'un ou plusieurs domaines fonctionnels qui travaillent ensemble pour dégrader la couche de peptidoglycane des parois cellulaires bactériennes. Ces domaines contribuent à la structure et à la fonction globales de l'enzyme. Les domaines spécifiques présents dans une endolysine peuvent varier en fonction du phage et de l'hôte bactérien qu'ils ciblent. Dans cette étude, nous avons exploré l'activité lytique et les caractéristiques structurelles de deux endolysines : DAH67913.1 (DAH67), provenant du groupe de bactériophages *Caudoviricetes* sp. identifié à partir des métagénomes humains, et son homologue proche Lys1358, qui utilise *Lactococcus lactis* comme hôte. Notre analyse par cristallographie a révélé des similitudes remarquables dans les structures des deux endolysines, caractérisées par une architecture partagée comprenant un domaine CHAP enzymatiquement actif à l'extrémité N-terminale et un domaine de liaison à la paroi cellulaire, SH3b, à l'extrémité C-terminale. Notamment, contrairement aux autres domaines CHAP, ceux de Lys1358 et DAH67 étaient dépourvus de calcium lié, ce qui a conduit à l'observation sans précédent de conformations inactives distinctes en raison de l'absence de stabilisation d'un motif de type "EF-hand" par cet ion. Ces découvertes apportent un nouvel éclairage sur le rôle régulateur du calcium au niveau moléculaire. De plus, nous avons observé que le Zn2+ inhibe l'activité lytique en se liant aux résidus catalytiques C29 et H89 au sein du domaine CHAP. En outre, nos analyses structurelles ont fourni des informations sur la façon dont le domaine SH3b reconnaît le dipeptide D-Ala-D-Ala, un composant vital du peptidoglycane de la paroi cellulaire de *L. lactis*, à travers des interactions conservées. Les études de mutation ont en outre corroboré l'importance des résidus catalytiques et de la poche de liaison au D-Ala-D-Ala dans la fonctionnalité de ces endolysines. De plus, notre comparaison du mode de liaison de la vancomycine avec le motif D-Ala-D-Ala du peptidoglycane a révélé des mécanismes de reconnaissance distincts employés par le domaine SH3b et les antibiotiques glycopeptidiques. Collectivement, nos découvertes offrent de nouvelles perspectives sur les relations structure-fonction complexes inhérentes à cette famille d'endolysines, fournissant des informations précieuses sur leurs mécanismes d'action et leurs applications potentielles en biotechnologie et en médecine. / **This thesis includes two stories.** **Part 1.** Prokaryotes and eukaryotes possess resistance genes in their genomes, which can be either innate or acquired, protecting against viral infections. At the population level, abortive infection (Abi) serves as one such innate immune defense mechanism against phage invasion. The AbiV antiviral system is prevalent in many bacterial genomes and exhibits diverse characteristics in terms of evolution and genomic composition. Abi systems are considered altruistic traits, as infected cells commit suicide to prevent the phage lytic cycle and protect their community. The protein AbiV belongs to the higher eukaryotic and prokaryotic nucleotide-binding (HEPN) superfamily and may function as a type of endoribonuclease. It can be found in many bacteria, including *Lactococcus lactis, Lacticaseibacillus paracamosus, Streptococcus pneumoniae* and *Streptococcus oralis*. In this study, we used the non-pathogenic *Lactococcus lactis* AbiV system as a model organism, which provides resistance to virulent lactococcal phages belonging to the Skunavirus genus. However, the AbiV protein has a unique sequence, and no structural homologs is available to date. The molecular mechanism of its anti-phage activity also remains unclear. Our exploration of the *Lactococcus* AbiV system has unveiled a novel duo: *abiV1* and *abiV2*, pivotal players in their role as a type III toxin-antitoxin system. The toxin, AbiV (encoded by *abiV1*), emerges as an RNase within the HEPN superfamily, distinguished by the Rx$\mathsf{_{4-6}}$H motif. Through *in vivo* assays and mass spectrometry, we observed AbiV expression irrespective of phage presence, while *in vitro* experiments elucidated its selective degradation of ribosomal RNA, leaving mRNA untouched. Conversely, *abiV2*, the antitoxin component, functions as an RNA molecule, thwarting AbiV's nuclease activity. Structural examination of AbiV reveals a significant positively charged area across its dimer, pivotal for RNA molecule anchoring. Furthermore, our investigation underscores the indispensable role of the N-terminal region (amino acids 1 to 23) of AbiV in its RNase activity; a truncated AbiV lacking this segment exhibited conformational states incompatible with RNA binding. This study offers fresh insights into the operational dynamics of the antiviral AbiV system. **Part 2.** **The study of bacteriophage endolysins**. Endolysins, also known as lysins, are a class of enzymes produced by bacteriophages as part of their replication cycle. These enzymes play a crucial role by facilitating the release of newly formed viral progeny from the host bacterial cells. The primary function of endolysins is to degrade the peptidoglycan layer, which is a major structural component of bacterial cell wall. The peptidoglycan layer provides structural integrity and protection to bacterial cell, and its breakdown by endolysins leads to the lysis or disintegration of the cell wall. This ultimately results in the bursting of the bacterial cell and the release of newly phage particles, allowing them to infect and propagate in other bacterial cells. Endolysins typically consist of functional domains that work together to degrade the peptidoglycan layer. These domains contribute to the enzyme's overall structure and function. The specific domains present in an endolysin can vary depending on the phage and the targeted bacterial host. In this study, we explored the lytic activity and structural characteristics of two endolysins: DAH67913.1(DAH67), originating from a bacteriophage (*Caudoviricetes* class) identified in human metagenomes, and its close homolog Lys1358, from the virulent phage 1358 which infects specific Lactococcus strains. Our analysis using crystallography unveiled remarkable similarities in the structures of both endolysins, characterized by a shared architecture featuring an enzymatically active N-terminal CHAP domain and a C-terminal cell-wall binding domain, SH3b. Notably, unlike other CHAP domains, those of Lys1358 and DAH67 were devoided of bound calcium, resulting in the unprecedented observation of distinct inactive conformations due to the absence of stabilization of an "EF-hand-like" motif by this ion. These findings shed new light on the regulatory role of calcium at the molecular level. Moreover, we observed that Zn$\mathsf{^{2+}}$ inhibited the lytic activity by binding to the catalytic residues C29 and H89 within the CHAP domain. Additionally, our structural analyses provided insights into how the SH3b domain recognizes the dipeptide D-Ala-D-Ala, a vital component of the lactococcus cell wall peptidoglycan, through conserved interactions. Mutation studies further corroborated the significance of catalytic residues and the D-Ala-D-Ala binding pocket in the functionality of these endolysins. Furthermore, our comparison of the binding mode of vancomycin with the peptidoglycan D-Ala-D-Ala moiety revealed distinct recognition mechanisms employed by the SH3b domain and glycopeptide antibiotics. Collectively, our findings offer novel perspectives on the intricate structure-function relationships inherent in this family of endolysins, providing valuable insights into their mechanisms of action and potential applications in biotechnology and medicine.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / p54nrb est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire impliquée dans plusieurs processus cellulaires tels que la transcription, la maturation des ARNm et la rétention des ARNs hyper-édités. Cette protéine multifonctionnelle fait partie de la machinerie d'épissage et participe à ce processus en liant directement le site d'épissage en 5' du pré-ARNm. De plus, p54nrb se concentre dans un corps nucléaire nommé le paraspeckle en liant une fraction riche en G de l'ARNnc NEAT1. Récemment, nous avons démontré que la phosphorylation mitotique de la threonine 15 de p54nrb, située en N-terminal de deux RRMs en tandem, régule négativement sa capacité de liaison aux ARNs excepté pour ceux riches en G comprenant l'ARNnc NEAT1 (Bruelle et al., sous presse, annexe A). Afin de caractériser la liaison des différents RRMs de p54nrb à l'ARN, une dissection moléculaire de son domaine de liaison à l'ARN (DLA) a été réalisée. Cette section contient les deux RRMs de la protéine précédés d'une région riche en H, Q, et P contenant le résidu T15 phosphorylable. Des tests de liaison in vitro à l'ARN du site d'épissage en 5' (5'SS, 11 nucleotides) et à des ARNs de polyguanosines ont permis de démontrer que le RRM1 de p54nrb est responsable de l'affinité de la protéine pour ces ligands. De plus, la cartographie des sites d'interaction du RRM1 avec le 5'SS et avec un ARN de polyguanosines (polyG, 11 nucleotides) a été réalisée par RMN et a révélé un site de liaison unique pour chacune de ces molécules. En effet, nous avons démontré que le RRM1 de p54nrb lie l'ARN polyG par un site de liaison non classique différent du site de liaison classique utilisé par la protéine pour lier le 5'SS. Ces expériences ont aussi permis de voir que le RRM1 de p54nrb avait plus d'affinité pour le polyG que pour le 5'SS. Les résultats obtenus démontrent pour la première fois, à notre connaissance, la possibilité pour un seul RRM de posséder deux sites distincts de liaison à l'ARN. De plus, cette liaison non classique du RRM1 de p54nrb aux ARNs de polyguanosines pourrait potentiellement expliquer pourquoi la liaison de la protéine à ce type d'ARN n'est pas affectée par sa phosphorylation.

L'incidence de maladies neurodegeneratives et systémiques liées au vieillissement, tels la maladie d'Alzheimer (MA) et le diabète, augmente rapidement. Plusieurs études rapportent que les patients souffrant de diabète ont entre 50 et 75 % plus de risque de développer la MA que les gens sains du même âge. La protéine tau hyperphosphorylée est une des composantes majeures des enchevêtrements neurofibrillaires, une composante neuropathologique classique de la MA. L'étude présente examine les modifications de tau dans deux modèles de souris transgéniques développant un diabète de type 2. La phosphorylation de tau est augmentée au niveau de l'hippocampe de ces souris. Le diabète de type 2 provoque aussi la dérégulation de quelques kinases et phosphatases de tau. Cette dérégulation serait résultante de la résistance à l'insuline et l'hypothermie. Le diabète de type 2 provoquerait donc l'accélération de la cascade menant à développer la maladie d'Alzheimer.

L’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6) infecte les enfants en bas âge et sa prévalence est estimée à près de 95% dans la population mondiale. Ce virus se distingue des autres membres de la famille des herperviridae par sa capacité à s’intégrer aux chromosomes cellulaires. On estime qu’environ 1% de la population mondiale serait porteuse d’une copie du génome du HHV-6 par cellule (52, 73, 100, 119, 131). Le mécanisme de cette intégration est toujours inconnu. Nous pensons que la protéine U94 du HHV-6 joue un rôle important dans l'intégration chromosomique du génome viral. Elle serait nécessaire à l'éxécution d'une recombinaison homologue entre les séquences télomériques cellulaires et virales (motif TTAGGG). U94 a une homologie de séquence de 24% avec la protéine Rep68 responsable de l'intégration du génome de l’adeno-associated virus 2 (AAV-2) au chromosome 19 (123). Pour ce faire, quatre activités intrinsèques à la protéine Rep68 lui sont nécessaires : la liaison à l'ADN simple et double brin, l'ATPase, l'hélicase et l'endonucléase (54, 97). Le but de ce projet de recherche était de caractériser les activitités biochimiques de la protéine U94. Tout d’abord, nous avons démontré que la protéine U94A est localisée au noyau en accord avec les résultats obtenus par le laboratoire du Dr. Mori (87). Pour réaliser nos études, nous avons exprimé et purifié U94 chez E. coli en fusion avec la protéine maltose-binding protein (MPB). Nos résultats démontrent que les protéines MBP-U94A et MBP-U94B sont capables de lier préférentiellement l'ADN simple brin avec un motif CCCTAA (complément du motif télomérique TTAGGG). L’essai de liaison sur le Proteon™ XPR36 démontre également que la protéine MBP-U94B lie un ADN double brin ayant le motif télomérique cellulaire. Nos résultats nous ont amenés à vérifier si l'ARN de la télomérase, qui contient un motif CCCTAA, pouvait aussi être lié par les protéines MBP-U94A et MBP-U94B. Les résultats obtenus indiquent que MBP-U94 ne lie pas l'ARN, ni la séquence équivalente en ADN ce qui suggère que la liaison de U94 requiert plus d’une répétition du motif CCCTAA. En se basant sur des études de mutagenèse réalisées sur la protéine Rep68 (128, 129), nous avons générés des mutants U94A et U94B. Les résultats démontrent que la mutation K395A affecte négativement la capacité de liaison à l’ADN de U94. Les essais d'ATPase indiquent que MBP-U94A et MBP-U94B hydrolysent l'ATP en ADP et AMP en présence d'un ADN simple brin ou d’un ADN double brin. Divers mutants des activités d’ATPase/Hélicase et d’endonucléase présumées furent générés et devront être caractérisés. Ces résultats suggèrent que U94 possède les activités biochimiques nécessaires à l'intégration du génome viral aux chromosomes cellulaires. / Human herpesvirus 6 infects young children with an estimated prevalence of 95% in the world population. It differs from the other members of the herperviridae family by its capacity to integrate cell's chromosomes. It is estimated that approximately 1% of the world population carries a copy of the HHV-6 genome per cell (52, 73, 100, 119, 131). The chromosomal integration mechanisms used by HHV-6 are currently unknown. Our hypothesis is that the HHV-6 U94 protein plays an important role in chromosomal integration that we suspect occur through homologous recombination between cellular and viral telomeric sequences (TTAGGG). The U94 gene product shares 24% sequence homology with Rep68, a responsible for the genomic integration of adeno-associated virus 2 (AAV-2) (123). To promote integration, Rep68 relies on four intrinsic activities: binding to single and double stranded DNA, ATPase activity, helicase and endonuclease (54, 97). The goal of this research project is to characterize the biochemical properties of U94 and determine whether it posseses activities similar to Rep68. First, we confirmed the results of Dr. Mori's laboratory by showing that U94 is localized in the nucleus (87). Next, to conduct our studies, we’ve expressed and purified maltose-binding-U94 recombinant proteins (MBP-U94) in E. coli. Our results suggest that MBP-U94A and MBP-U94B preferentially bind single-strandred DNA containing the CCCTAA motif (complement to the TTAGGG telomeric motif). Surface plasmon resonance (SPR) experiments also indicate that MBP-U94B binds double-stranded DNA containing telomeric motifs. Since the telomerease RNA component TERC contains the CCCTAA motif, we investigated whether MBP-U94 could bind a single-stranded RNA molecule containing the CCCTAA motif. SPR analysis clearly indicates that MBP-U94 does not bind such RNA nor a single-stranded DNA molecule having a single CCCTAA motif, suggesting that more than one motif is required for proper binding. Based on published work on Rep68 (128, 129), we generated specific U94 mutants. Our results indicate that the K395A mutation greatly diminishes U94 binding to DNA pointing out the importance of this residue. ATPase assays were also performed and indicate that both MBP-U94A and MBP-U94B possess the ability to hydrolyze ATP into ADP and AMP when incubated in the presence of DNA. Several other mutants targeting the helicase and endonuclease activities were generated and will be tested in the near future. Altogether these results suggest that U94 has biological properties that are consistent with a role for this protein in the process of chromosomal integration of the HHV-6 genome into the host chromosomes.

Le virus de l’hépatite C (VHC) représente un problème majeur de santé publique avec au dessus de 120 millions de personnes infectées et à ce jour aucun traitement capable de contrer de manière efficace ce virus. Le VHC a été découvert en 1989, classé dans la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hepacivirus. Il s’agit d’un virus enveloppé, formé donc d’une bicouche lipidique, d’une capside, et d’un acide nucléique (ARN). La capside virale est formée d’une seule et unique protéine appelée « Core ». Il s’agit d’une protéine de 177 acides aminés sous sa forme mature. Il a été démontré au sein du laboratoire du Professeur Denis Leclerc que la première moitié de la protéine (C82) était suffisante pour générer à la fois in vivo et in vitro la formation de la capside virale. Ayant comme objectif de comprendre les mécanismes régissant l’assemblage viral, nous avons étudié cette protéine d’un point de vue structural. Suite à la mise au point d’un protocole robuste d’expression, de marquage isotopique et de purification, nous avons étudié la Core C82 par dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire. Les données expérimentales obtenues suggèrent que la Core C82 est non structurée et flexible, confirmant ainsi l’analyse de la séquence primaire et les prédictions de structure secondaire de la Core. Nous avons ainsi mis en évidence que la moitié N-terminale de la Core du VHC appartenait à la famille des protéines intrinsèquement non structurées (IUP). Les IUPs sont des protéines peu ou très peu structurées et parfois capables de se structurer en liaison à un partenaire (protéine, acide nucléique, petite molécule). Nous avons donc, dans le but de structurer la Core C82, testé de multiples conditions de sel, détergent, agent lipomimétique et un partenaire protéique (protéine p53). Seul l’ajout d’un agent lipomimétique (2,2,2-trifluoroéthanol, TFE) à la Core C82 est venu modifier sa structure et sa dynamique. Nous avons ainsi pu démontrer que la Core C82 pouvait adopter une structure en hélice α. Nous avons, de plus, confirmé que ce repliement était également présent dans des versions tronquées plus longues de la Core (formes C124 et C170). Enfin, nous avons, parallèlement à son étude structurale, mis au point un test in vitro d’inhibition de l’assemblage. Cet outil nous a permis de découvrir plusieurs peptides dérivés de la séquence protéique de la Core et de la protéine NS5A du VHC, ayant un effet inhibiteur sur l’assemblage viral in vitro de la Core mature (C170). Ces travaux innovateurs représentent une avenue encourageante vers la découverte d’un moyen efficace de soigner l’infection au VHC. Au final, même si la structure 3D de la Core mature reste non déterminée, notre étude structurale de la Core C82 est la plus complète réalisée à ce jour à l’échelle atomique. Par ailleurs, nos travaux préliminaires sur la forme mature de la Core (C170) semblent être très prometteurs et permettraient de déterminer la structure 3D de la protéine Core mature. / The hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem with more than 120 million infected people, and to date no efficient treatment is available. HCV was discovered in 1989, classified in the flaviviridae family, and is the only member of the hepacivirus genus. It is an enveloped virus, consisting in a lipid bilayer, a capsid, and a ribonucleic acid (RNA). The viral capsid is composed by only one protein called “Core” protein. It is a 177 amino acid long protein in its mature form. It was demonstrated in our laboratory that the first half of this protein (C82) was sufficient to generate, both in vivo and in vitro, the assembly of the viral capsid. In order to understand the mechanism controlling the capsid assembly, we have studied the structural aspect of this protein. After developing robust protocols of overexpression, isotope labelling and purification of the protein C82, we studied this truncated form using circular dichroism and nuclear magnetic resonance. The experimental data obtained suggest that Core C82 is an unstructured and very flexible protein, thus confirming primary sequence analysis and secondary structure predictions. We established that the N-terminal half of the Core protein is a member of the intrinsically unstructured protein family (IUP). IUPs are proteins which are totally or partially unstructured, but can sometimes undergo a structural change induced by the binding of a partner (protein, nucleic acid, small molecule). In order to induce a structured form of the C82 protein, we have tested a large range of conditions of salt, detergent, lipomimetic solvent, as well as interaction with a proteic partner (p53). Only the addition of a lipomimetic agent (2,2,2-trifluoroethanol, TFE) to the Core C82 protein resulted in a structural and a dynamical change. In this special condition, we were able to demonstrate that the Core C82 can adopt an α-helix conformation. We have, moreover, confirmed that this conformation was also present in longer truncated form of the Core protein (C124 and C170). We also, along its structural analysis, developed an in vitro test to inhibit the assembly of the Core protein. This tool allowed us to discover several small peptides derived from the HCV Core and NS5A proteins amino acid sequences, with an inhibitory effect on the viral assembly of the mature Core protein (C170). This innovative work is potentially an interesting step towards the development of an efficient treatment against HCV. Ultimately, even if the 3D structure of the mature Core protein remains unsolved, our structural study of the C82 truncated form is the most comprehensive study to date at an atomic resolution. Moreover, our preliminary works on the mature form of the Core protein (C170) are very promising and should eventually lead to the three dimensional structure.

Introduction. La distribution asymétrique des composantes cellulaires au sein des cellules épithéliales résulte en une polarité apico-basale, laquelle divise la cellule en un domaine apical, un domaine latéral et un domaine basal. Cette polarité est essentielle à la physiologie des tissus épithéliaux et à l’homéostasie des organes. D’ailleurs, la perte de polarité épithéliale favorise la progression tumorale. Crumbs est une protéine de la polarité limitant la progression tumorale. Chez la drosophile, la protéine Yurt, associée au cortex cellulaire, inhibe Crumbs. De plus, les orthologues humains de Yurt – EPB41L5 et EPB41L4B – sont surexprimés dans plusieurs cancers. Leur surexpression amplifie la formation de métastases et est donc associée à un mauvais pronostic. Ces protéines seraient de bonnes cibles thérapeutiques, mais leurs modes de régulation sont peu connus. Nous émettons l’hypothèse que la localisation subcellulaire est importante pour la régulation de Yurt et ses orthologues. Ce projet vise à 1) définir les domaines de Yurt lui permettant de lier le cortex cellulaire et 2) déterminer les mécanismes régissant cette localisation. Méthodologie et résultats. Nous avons procédé à une analyse structure-fonction couplée à des immunofluorescences pour identifier les domaines protéiques responsables de la localisation corticale de Yurt. Diverses troncations et délétions au sein de la protéine nous ont permis d’identifier un motif basique et hydrophobe et un domaine Pleckstrin Homology-like au sein du domaine FERM permettant de cibler Yurt au cortex. Cette association se fait par des interactions électrostatiques avec des lipides membranaires. Conclusion. Nous avons mis en lumière de nouveaux mécanismes régulant la protéine Yurt. Ces connaissances pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en oncologie ciblant les orthologues humains de Yurt. / Introduction. Epithelial polarity is characterized by the asymmetrical distribution of cellular components in epithelial cells, which divides the cell into an apical domain, a lateral domain, and a basal domain. This polarity is essential for proper tissue function and the homeostasis of organs. Indeed, loss of epithelial polarity contributes to cancer progression. Crumbs is a polarity protein that limits tumour progression. In Drosophila, the protein Yurt, which associates to the cell cortex, limits the activity of Crumbs. Moreover, the human orthologs of Yurt – EPB41L5 and EPB41L4B – are overexpressed in many cancers. This overexpression increases metastasis formation and is thus associated with a poor prognosis. These proteins represent potential targets in the treatment of cancer, but little is known about their modes of regulation. We hypothesize that subcellular localization is important for the regulation of Yurt and its human orthologs. The aims of this project are to 1) define which domains of Yurt target it to the cell cortex and 2) determine the mechanisms responsible for this localization. Methodology and results. We performed a structure-function analysis coupled to immunofluorescence to identify the protein domains responsible for the cortical localization of Yurt. Many truncations and deletions were tested and allowed the identification of one basic and hydrophobic motif along with a Pleckstrin Homology-like domain within the FERM domain that are essential for Yurt’s cortical localization. This localization is mediated by electrostatic interactions with membrane lipids. Conclusion. We have successfully identified novel mechanisms regulating Yurt localization. These findings could contribute to the development of new therapeutics in oncology that target the human orthologs of Yurt.

Notre projet visait en premier à étudier la protéolyse sécrétée par l'endomètre eutopique provenant de femmes atteintes de la maladie et la comparer avec l'endomètre eutopique provenant de femmes saines. Nous avons démontré une augmentation dans l'activité protéolytique et nous avons identifié une augmentation de la sécrétion et de l'expression de la MMP-9 par l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de la maladie. Nous avons par la suite étudié l'effet de l'activité protéasique sur la dégradation de l'IL1 rll. Nous avons démontré que l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de l'endométriose cause la dégradation de l'IL-lrlI. La troisième partie du projet consistait en l'identification de molécules bioactives sécrétées par les cellules endométriosiques qui seraient responsables de l'angiogénèse retrouvée chez les femmes souffrant de la maladie. Nous avons réussi à identifier la nm23b, une protéine qui possède une influence angiogénique chez certains cancers lorsqu'elle est surexprimée.

La superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT) est constituée de glycoprotéines résidant au réticulum endoplasmique et sujettes aux modifications post-traductionnelles (PTM, post-translational modifications). L’enzyme UGT2B7 est d’un intérêt particulier vu son action sur une grande variété de médicaments. La plupart des études actuelles n’ont pour sujet que les variants communs de cette enzyme et n’examinent donc qu’une fraction de la diversité génétique de celle-ci. En effet, les variants rares (fréquence allélique en deçà de 1%) peuvent potentiellement avoir un effet considérable puisqu’ils sont prédits comme étant bien plus nombreux que les variants communs au sein du génome humain. La présente étude fait état de la découverte d’un variant rare d’UGT2B7 possédant un intérêt pharmacogénétique potentiel et encodant une substitution d’acide aminé au codon 121. Cette variation peu fréquente, retrouvée chez deux individus au sein d’une population de 305 sujets sains, mène à la traduction d’une asparagine (Asn) plutôt qu’un acide aspartique (Asp) au codon 121 (UGT2B7 p.D121N). Cette substitution est prédite comme créant un motif de N-glycosylation NX(S/T) subséquemment validé par traitement à l’endoglycosidase de fractions microsomales issues de surexpressions dans des cellules HEK293 et par inhibition à la tunicamycine de la N-glycosylation d’UGT2B7 produites de façon endogène dans des HEK293. De plus, la présence d’un oligosaccharide additionnel sur l’enzyme UGT2B7, affectant potentiellement son repliement, résulte en la diminution, respectivement par 49 et 40%, de la formation de glucuronides à partir de la zidovudine et de l’acide mycophénolique. Une analyse de la base de données dbSNP a permis la découverte de 32 variants rares pouvant potentiellement créer ou abolir des motifs de N-glycosylation au sein d’enzymes UGT2B. Ensemble, ces variants ont le potentiel d’augmenter la proportion de la variance de la voie des UGT qui est expliquée par des modifications post-traductionnelles telles la N-glycosylation, affectant ainsi le métabolisme des médicaments. / The UDP-glucuronosyltransferase (UGT) superfamily consists of glycoproteins resident of the endoplasmic reticulum membranes that undergo post-translational modifications (PTM). UGT2B7 is of particular interest because of its action on a wide variety of drugs. Most studies currently survey common variants and are only examining a small fraction of the genetic diversity. However, rare variants (frequency < 1%) might have significant effect as they are predicted to greatly outnumber common variants in the human genome. Here, we discovered a rare single nucleotide UGT2B7 variant of potential pharmacogenetic relevance that encodes a nonconservative amino acid substitution at codon 121. This low-frequency variation, found in two individuals of a population of 305 healthy volunteers, leads to the translation of an asparagine (Asn) instead of an aspartic acid (Asp) (UGT2B7 p.D121N). This amino acid change was predicted to create a putative N-glycosylation motif NX(S/T) subsequently validated upon endoglycosidase H treatment of microsomal fractions and inhibition of N-glycosylation of endogenously produced UGT2B7 with tunicamycin from HEK293 cells. The presence of an additional N-linked glycan on the UGT2B7 enzyme, likely affecting proper protein folding, resulted in a significant decrease, respectively by 49 and 40%, in the formation of zidovudine and mycophenolic acid glucuronides. A systematic survey of the dbSNP database uncovered 32 rare and naturally occurring missense variations predicted to create or disrupt N-glycosylation sequence motifs in the other UGT2B enzymes. Collectively, these variants have the potential to increase the proportion of variance explained in the UGT pathway due to changes in PTM such as N-linked glycosylation with consequences on drug metabolism.