La potentialisation synaptique dans les neurones d'hippocampes repose sur l'activation du récepteur NMDA (NMDAR) et l'influx de Ca²⁺. Des changements dans le Ca²⁺ cytosolique sont détectés par des effecteurs tels que la calpaïne et la protéine kinase II Ca²⁺/calmoduline-dépendante (CaMKII), transformant ces informations en signaux qui induisent une potentialisation synaptique. Une fois activée par l'influx de Ca²⁺, la calpaïne clive de nombreuses protéines cytosoliques, récepteurs et protéines d'échafaudage, remodelant ainsi la structure synaptique, ainsi que l'activité et/ou la dynamique de nombreuses protéines. Le rôle de la calpaïne au cours du processus de plasticité synaptique a été documenté, mais le mécanisme moléculaire est loin d'être clair. Dans cette étude, nous avons examiné le lien possible entre la calpaïne et CaMKII dans la médiation de la potentialisation à long terme (LTP). Nous avons utilisé des inhibiteurs pharmacologiques de la calpaïne pour interférer avec son activation lors de la potentialisation synaptique induite chimiquement dans des cultures dissociées d'hippocampe de rat. Nous avons d'abord confirmé que l'activité de la calpaïne est essentielle pour l'induction de la LTP dans les cultures neuronales dissociées. Nous montrons que l'activité de la calpaïne est essentielle pour de nombreux processus moléculaires importants pour la LTP. L'inhibition de l'activité de la calpaïne a bloqué la phosphorylation de ERK et l'insertion des récepteurs synaptiques AMPA; deux processus régulés par CaMKII impliqués dans la potentialisation synaptique. De plus, nous montrons que la calpaïne est essentielle pour l'autophosphorylation de CaMKII en utilisant un anticorps contre pCaMKII (Thr286). En mesurant le temps de vie par fluorescence (FLIM) avec un capteur basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) (Camui) de l'activation de CaMKII, nous montrons que l'inhibition de la calpaïne empêche le changement dépendant de l'activité de la conformation de l'holoenzyme CaMKII et donc l'activation de la kinase. Nous avons aussi utilisé l'imagerie time-lapse et avons découvert que la translocation CaMKII post-synaptique dépendante de l'activité est diminuée par les inhibiteurs de la calpaïne. De plus, nous avons mesuré les taux de diffusion de CaMKII par SPT-PALM en utilisant CaMKII-meos2 et les résultats indiquent que l'inhibition de la calpaïne empêche la diminution dépendante de l'activité de la mobilité de l'holoenzyme. Nos résultats montrent clairement que les inhibiteurs de la calpaïne affectent la dynamique de CaMKII. Cela suggère que la calpaïne affecte directement CaMKII ou agit en amont de CaMKII. En effectuant des expériences dans des cellules HEK qui n'ont pas de CaMKII endogène, nous avons démontré que la calpaïne n'affecte pas directement CaMKII. Nous avons émis l'hypothèse que la calpaïne joue un rôle dans le processus de plasticité en amont de CaMKII. Nous avons étudié l'influx Ca²⁺ dépendant de l'activité en utilisant l'imagerie GCaMP6 et nos résultats indiquent que l'activité de la calpaïne est essentielle pour cette l'augmentation de Ca²⁺. En disséquant davantage la voie de signalisation, utilisant différents protocoles de stimulation (dépolarisation synaptique ou globale), nous montrons que la calpaïne affecte l'afflux de Ca²⁺ dépendant de NMDA et non l'influx de Ca²⁺ dépendant de la dépolarisation. Ainsi, notre étude montre que la calpaïne joue un rôle essentiel dans la LTP d'une manière dépendante du NMDAR et que l'inhibition de la calpaïne interfère dans les premières étapes de la signalisation médiée par le Ca²⁺ conduisant à l'induction du LTP. En discutant de ces résultats, nous fournissons des résultats préliminaires qui peuvent nous éclairer au niveau de l'impact de l'inhibition pharmacologique de la calpaïne sur la fonction des récepteurs NMDA. / Synaptic potentiation in hippocampal neurons relies on NMDA receptor (NMDAR) activation and Ca²⁺ influx. Changes in cytosolic Ca²⁺ are detected by effectors such as calpain and Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), transforming this information into signals inducing synaptic potentiation. Once activated by Ca²⁺ influx, calpain cleaves many cytosolic proteins, receptors, and scaffolding proteins, thereby remodeling the synaptic structure, as well as the activity and/or dynamics of many proteins. The role of calpain during the synaptic plasticity process has been documented, but the molecular mechanism is far from clear. In this study, we examined the possible link between calpain and CaMKII in the mediation of Long Term Potentiation (LTP). We used pharmacological inhibitors of calpain to interfere with its activation during chemically induced synaptic potentiation in rat hippocampal dissociated cultures. We first confirmed that calpain activity is essential for LTP induction in dissociated neuronal cultures. We show that calpain activity is essential for many molecular processes important for LTP. Inhibition of calpain activity blocked ERK phosphorylation and insertion of synaptic AMPA receptors - two CaMKII-regulated processes involved in synaptic potentiation. Further, we show that calpain is essential for CaMKII autophosphorylation by using an antibody against pCaMKII (Thr286). By performing Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based sensor (Camui) of CaMKII activation, we show that calpain inhibition prevents activity-dependent change in the conformation of the CaMKII holoenzyme and thus the activation of the kinase. We further used time-lapse imaging and found that activity-dependent post-synaptic CaMKII translocation is decreased by calpain inhibitors. Furthermore, we measured diffusion rates of CaMKII by SPT-PALM using CaMKII-meos2 and the results indicate that calpain inhibition prevents the activity-dependent decrease in the mobility of the holoenzyme. Our results clearly show that calpain inhibitors affect CaMKII dynamics. This suggests that either calpain affects CaMKII directly or is upstream to CaMKII. By performing experiments in HEK cells that do not have endogenous CaMKII, we demonstrated that calpain does not affect CaMKII directly. We hypothesized that calpain plays a role in the plasticity process at an upstream level to CaMKII. We investigated activity-dependent Ca²⁺ influx using GCaMP6 imaging and our results indicate that calpain activity is essential for this increase in Ca²⁺. Further dissecting the pathway, using different stimulation protocols (synaptic or global depolarisation), we show that calpain affects NMDA-dependent Ca²⁺ influx and not the depolarisation dependent Ca²⁺ influx. Thus, our study shows that calpain plays an essential role in LTP in an NMDAR dependent manner and that inhibiting calpain interferes in the early steps of Ca²⁺- mediated signaling leading to LTP induction. In discussing these results, we provide preliminary results that may shed light on the impact of pharmacological inhibition of calpain on NMDA receptor function.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales 2003-2004 / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire grave qui engendre une perte d’autonomie des patients et diminue leur espérance de vie. Cette maladie est la plus fréquente des dystrophies musculaires chez l’adulte avec une incidence mondiale d’une personne atteinte sur 15 000. Au Québec, cette maladie est d’une importance particulière, car elle touche une personne sur 500 dans les régions du Saguenay et de Charlevoix. La DM1 est causée par l’expansion du triplet CTG situé dans la région 3’ non-codante de la myotonine protéine kinase (DMPK). Toutefois, il a été démontré que la grande part des symptômes de la maladie seraient liés à l’accumulation nucléaire de l’ARNm de DMPK portant l’expansion. Ces ARNm mutés se lient à des facteurs nucléaires formant des foci dans les noyaux des cellules DM1, engendrant des effets toxiques sur le métabolisme cellulaire et sur l’épissage alternatif de certains ARNm. Nos travaux avaient comme but premier d’évaluer si la destruction de l’ARNm mutant de DMPK dans des myoblastes provenant de muscle squelettique DM1 permettrait de rétablir certaines fonctions et caractéristiques normales dans ces cellules. Trois technologies à base d’ARNs: les antisens, les ribozymes et les shRNAs ont diminué avec succès ces niveaux d’ARN mutés. Les ARNs antisens et les ribozymes, contrairement aux shRNA, ont permis un ciblage préférentiel des ARNs mutés de DMPK dans le noyau de myoblastes DM1. Ceci permet donc de maintenir un niveau basal de la protéine DMPK dans les myoblastes, un détail important advenant l’utilisation de ces molécules en thérapie génique chez l’humain. En utilisant les ribozymes, nous avons diminué la quantité et l’intensité des foci ce qui a permis de libérer les facteurs cellulaires se liant aux expansions de CUG. Ceci a eu comme effet de corriger un défaut d’épissage alternatif dans le récepteur à l’insuline. En exprimant de longs antisenses à l’ARNm de DMPK par un oncorétrovirus, nous avons constaté une restauration de la fusion cellulaire, de la capture de glucose ainsi qu’une diminution de CUGBP, un facteur d’épissage alternatif. Nous avons également démontré que la surexpression de hnRNP H, un facteur d’épissage liant les expansions de CUG, permettait aussi de diminuer les niveaux de CUGBP et ainsi corriger le défaut d’épissage alternatif du récepteur à l’insuline. Ces résultats démontrent donc pour la première fois le lien direct entre la rétention des ARNs mutés, la déplétion nucléaire d’un facteur d’épissage s’y liant et l’exacerbation de certaines caractéristiques du phénotype DM1. La somme de nos observations a permis deux choses importantes: en premier lieu, d’établir un nouveau modèle détaillé expliquant la pathogenèse de la DM1. En second lieu, nos résultats ont permi de valider la pertinence de détruire spécifiquement les transcrits mutés de DMPK afin de développer une thérapie génique efficace pour la DM1. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe neuromuscular disease that ultimately causes loss of mobility and premature death. DM1 is the most common muscular dystrophy in adults with a world wide incidence of 1 affected individual in every 15 000. This disease is of special relevance in the Saguenay and Charlevoix regions in Quebec, where 1 in every 500 individuals is a carrier of the mutation. DM1 is caused by the expansion of an unstable CTG trinucleotide repeat located in 3’UTR of the DMPK (DM protein kinase) gene. However, it has been shown that most DM1 symptoms are related to the nuclear retention of mutant DMPK mRNA. These mutant transcripts bind to nuclear proteins and form foci in DM1 cell nuclei. This is though to be the leading cause of metabolical disruptions and defective alternative splicing of several mRNAs observed in DM1 cells. Our main project objective was to evaluate whether destruction of mutant DMPK mRNA could restore normal phenotype features in DM1 human skeletal myoblasts. The use of three RNA-based approaches: antisense RNAs, ribozymes and shRNAs, all displayed significant reductions in mutant DMPK mRNA. Antisense RNAs and ribozymes, as opposed to shRNAs, allowed specific targeting and destruction of mutant DMPK mRNAs in the nucleus of DM1 myoblasts. This feature thus allows a basal level of DMPK protein expression which is of particular relevance in the advent of developing a gene therapy for DM1. Ribozymes were effective in reducing the number and intensity of foci present in the nucleus of the myoblasts, thus allowing the release of certain CUG-binding proteins. This resulted in restoration of the defective splicing of the insulin receptor mRNA. Antisense RNAs to the DMPK mRNA expressed by an oncoretrovirus restored myoblast fusion, glucose uptake and lowered nuclear levels of CUGBP, an alternative splicing factor. Over expression of hnRNP-H, an alternative splicing factor that we showed could bind to CUG repeats, also reduces expression of CUGBP and restores defective splicing of the insulin receptor. These results reveal for the first time the intricate link between mutant DMPK mRNA nuclear retention, depletion of a CUG-binding protein that is also a splicing factor and exacerbation of related DM1 features. In conclusion, our work has allowed to better define the mechanisms involved in DM1 pathogenesis and has validated the relevance of developing a gene therapy that specifically targets mutant DMPK mRNAs.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / La question des bases structurales du phénotype et de sa variation est une des questions les plus anciennes de la biologie. Le paradigme actuel stipule que le phénotype est exprimé à partir du génotype au travers de réseaux moléculaires dont l’architecture structure l’information génétique. Cette description mécanistique de la carte génotype-phénotype implique que c’est par la perturbation de l’architecture de ces réseaux que des variations génotypiques mènent à des modifications du phénotype. Les protéines constituant le principal vecteur de l’information génétique, comprendre la carte génotype-phénotype requiert de comprendre comment les variations génotypiques perturbent l’architecture du réseau d’interactions protéines-protéines. Au cours de cette thèse, nous avons développé une méthode permettant d’étudier chez la levure Saccharomyces cerevisiae l’impact de la délétion des gènes sur les interactions entre protéines. Nous avons appliqué cette méthode à l’étude des mécanismes moléculaires de la robustesse par lesquels le réseau d’interactions protéines-protéines filtre les variations génotypiques pour préserver le phénotype. Nous avons mis au jour un mécanisme de compensation fonctionnelle entre gènes paralogues basé sur la compensation des interactions protéines-protéines et expliquant un lien entre génotype et phénotype qui était mal compris jusqu’alors. En outre, en appliquant notre méthode à l’identification des régulateurs de la Protéine Kinase A, nous avons approfondi les connaissances sur la façon dont les maîtres régulateurs coordonnent les processus cellulaires et maintiennent l’homéostasie, une propriété distribuée de la robustesse. Ces résultats, et ceux qui seront produits à l’avenir par l’application de cette méthode, promettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l’information génétique est transmise du génotype au phénotype, condition essentielle à la compréhension du vivant et de son évolution. / The question of the structural bases of the phenotype and of its evolution is one of the oldest questions in biology. The present paradigm states that the phenotype is expressed from the genotype through molecular networks, the architecture from which structures genetic information. This mechanistic description of the genotype-phenotype map implies that it is through by perturbing of the architecture of these networks that genotypic variations lead to phenotypic modifications. Since proteins are the main vector of genetic information, understanding the genotype-phenotype map requires the understanding of how genotypic variations perturb the architecture of the protein interaction network. In the course of this thesis, we developped a methodology that allows to study the impact of gene deletions on the interactions between proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We applied this method to the study of the molecular mechanisms of robustness by which the protein interaction network filters genotypic variations to preserve the phenotype. We uncovered un mechanism of functional compensation between paralogous genes that is based on protein-protein interaction compensation and that explains the poorly understood link between genotype and phenotype. Moreover, we applied our method to the identification of regulators of Protein Kinase A and deepened our knowledge of how master regulators coordinate cellular processes and maintain homeostasis, a distributed property of robustness. These results, and the ones that will be produced in the future by applying this method, promise a better understanding of the molecular mechanisms through which genetic information is transmitted from the genotype to the phenotype, an essential condition for the understanding of life and its evolution.

Le métabolisme des lipides joue un rôle primordial au cœur de l'homéostasie cutanée. Précisément, les acides gras polyinsaturés (PUFAs) n-3 et n-6 sont impliqués dans des fonctions à la fois structurales et métaboliques, essentielles au développement et au maintien de la fonction barrière de la peau. Ces fonctions variables et complexes sont toujours partiellement incomprises à ce jour, et les conséquences qui en découlent sont évidentes et parfois néfastes. En effet, cette incompréhension limite notre capacité à reconstruire des modèles cutanés plus représentatifs de la peau normale humaine, qui sont nécessaires aux études pharmaceutiques. De plus, cette dernière fait partie intégrante de notre incapacité à déterminer les causes de certaines pathologies multifactorielles complexes telles que le psoriasis et, conséquemment, à développer des traitements efficaces pour les soigner. Les modèles de peau humaine sains et psoriasiques produits par génie tissulaire ont été exploités afin de mettre en lumière le rôle des acides gras polyinsaturés dans la fonction barrière de la peau. Au cours de cette thèse, plusieurs objectifs spécifiques ont été étudiés. Les deux premiers objectifs visaient l'optimisation du modèle de peau saine grâce à la supplémentation des milieux de culture avec, dans un premier temps, soit une supplémentation individuelle en acide alpha-linolénique (n-3 PUFAs) ou en acide linoléique (n-6 PUFAs). Dans un deuxième temps, une double supplémentation a été réalisée où l'acide alpha-linolénique et l'acide linoléique ont été ajoutés simultanément. Les résultats issus de ces deux études ont montré que la supplémentation des milieux de culture avec l'acide alpha-linolénique et celle avec les deux acides simultanément permettaient d'améliorer la fonctionnalité des substituts cutanés en diminuant l'absorption percutanée de la testostérone, alors que la supplémentation en acide linoléique seul n'avait pas d'effet. Ces résultats surprenants ont mis en évidence l'importance du ratio de n-3 et de n-6 PUFAs lors de la formation de la barrière cutanée in vitro. Le troisième objectif de cette thèse a été de caractériser l'endocannabinoïdome de la peau normale humaine et des substituts sains reconstruits par génie tissulaire. Cette étude a permis de mieux comprendre les différents acteurs du métabolisme des endocannabinoïdes au sein de la peau. Nos résultats ont aussi montré que les différents endocannabinoïdes présents dans la peau humaine étaient également retrouvés dans les substituts cutanés. De plus, une double supplémentation en acide alpha-linolénique et en acide linoléique a permis de moduler le profil d'endocannabinoïdes, confirmant que les peaux représentent un modèle adéquat pour l'étude du métabolisme des endocannabinoïdes cutanés. Finalement, le dernier objectif spécifique de cette thèse consistait à étudier le potentiel de l'acide alpha-linolénique (n-3 PUFAs) comme traitement pour soigner le psoriasis. Cette étude a permis de confirmer que les n-3 PUFAs pouvaient réguler la prolifération et la différenciation des kératinocytes psoriasiques in vitro afin qu'ils retrouvent un phénotype se rapprochant davantage de celui des cellules saines. Nos résultats montrent que cette régulation est induite par la modulation de la production des médiateurs lipidiques issus des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6 ainsi que par l'activation et l'inhibition subséquentes des cascades de transduction du signal des kinases. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse a permis de faire avancer de manière importante l'état des connaissances en ce qui a trait au métabolisme des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6 au sein des peaux saines et psoriasiques. Ce dernier a également permis l'optimisation de la reconstruction tissulaire d'un modèle de peau dans le but d'obtenir un tissu affichant une barrière cutanée similaire à celle d'une peau normale humaine et, par conséquent, de mener à un modèle répondant davantage aux besoins de l'industrie pharmaceutique. Finalement, cette thèse a contribué à supporter et à promouvoir l'utilisation des n-3 PUFAs en tant que traitement possible pour les patients atteints de psoriasis, ainsi qu'à démontrer la pertinence de poursuivre les recherches dans ce domaine puisqu'elles offrent un potentiel important quant à l'amélioration de la qualité de vie des patients. / Lipid metabolism plays a central role in the skin homeostasis. More specifically, omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids (n-3 and n-6 PUFAs) are involved in both structural and metabolic functions, which are essential for the development and maintenance of the skin barrier function. These highly variable and complex functions are still partially misunderstood to this day, and the resulting consequences are obvious. Indeed, these gaps in knowledge limit our ability to produce reconstructed skin models that are representative of normal human skin, which are necessary for pharmaceutical studies. In addition, improving our knowledge of skin lipids would help understand the causes of certain complex multifactorial pathologies such as psoriasis and would consequently lead to the development of more effective therapies. Tissue-engineered healthy and psoriatic human skin substitutes have been exploited to shed light on the role of polyunsaturated fatty acids regarding the barrier function of the skin. This thesis evaluated several specific objectives. The first two objectives aimed at the optimization of the healthy skin substitutes using first, individual supplementation of culture media with alpha-linolenic acid (n-3 PUFA) or linoleic acid (n-6 PUFA), as well as in a second step, a dual supplementation with both alpha-linolenic and linoleic acids. The results of these two studies showed that supplementation of culture media with alpha-linolenic acid and with the dual supplementation improved the functionality of skin substitutes by reducing the percutaneous absorption of testosterone, whereas the linoleic acid supplementation alone had no effect. These surprising results demonstrated the importance of the ratio of n-3 to n-6 PUFAs in the formation of the skin barrier in vitro. The third objective of this thesis was to characterize the endocannabinoidome of human skin compared to that of healthy tissue-engineered skin substitutes. This study provides a better understanding of the different actors in the metabolism of endocannabinoids within the skin. Our results show that the different endocannabinoids present in human skin were also found in the skin substitutes, and that they were modulated following a double supplementation with alpha-linolenic acid and linoleic acid, confirming that reconstructed skin equivalents are an adequate model for the study of the metabolism of cutaneous endocannabinoids. Finally, the last specific objective of this thesis was to study the potential of alpha-linolenic acid (n-3 PUFA) as a treatment for psoriasis. This study confirmed that n-3 polyunsaturated fatty acids can regulate the proliferation and differentiation of psoriatic keratinocytes so that they adopt a healthier behavior. This regulation is mediated by the modulation of the lipid mediators produced from n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids, as well as by the activation and inhibition of subsequent signal transduction cascades involving kinases. In conclusion, the results reported in this thesis significantly contribute to advancing the state of knowledge regarding the metabolism of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids in healthy and psoriatic skin. This thesis also allowed the optimization of a skin model to be more representative of the functionality of normal human skin, and thus the generation of a more efficient model for the pharmaceutical industry. Ultimately, our work will help to support and promote the use of n-3 polyunsaturated fatty acids as a treatment for patients with psoriasis, which could greatly improve their quality of life.

Le tissu musculaire squelettique contribue considérablement au maintien de l’homéostasie du glucose chez l’humain. Que ce soit en situation postprandiale ou lors d’un travail musculaire, le muscle squelettique capte de grandes quantités de glucose sanguin à des fins d’entreposage ou de production d’énergie. Les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation du transport du glucose à l’intérieur de la cellule musculaire sont nombreuses et complexes. En présence de désordres physiologiques et/ou métaboliques, de nombreux médiateurs chimiques et enzymatiques peuvent interagir avec les différentes protéines de ces voies de signalisation et entraîner des perturbations importantes au niveau de l’homéostasie du glucose. Notre première étude nous a permis de confirmer l’implication de la protéine AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire. L’AMPK est un senseur énergétique important activé dans le muscle squelettique au cours d’un effort physique. Toutefois, son rôle dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire demeure controversé. Grâce à un modèle murin d’invalidation génétique de l’AMPK spécifique au tissu musculaire et à l’élaboration d’un protocole de contraction ex vivo approprié, nous avons établi l’importance de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose. Notre seconde étude nous a permis de démontrer que l’incubation ex vivo prolongée du muscle épitrochléen modifie l’expression du transporteur de glucose GLUT1. Nous avons également observé l’induction de la protéine iNOS et la production du NO. Parallèlement, nous avons mesuré une augmentation de l’expression de GLUT1 à la suite d’une exposition au NO dans un modèle de cellules musculaires ainsi qu’une augmentation du transport basal du glucose. L’ensemble de nos résultats nous permet de consolider le lien causal entre la production du NO et la modulation de l’expression de GLUT1 et potentiellement, le développement de perturbations au niveau du métabolisme du glucose musculaire.

La méiose des ovocytes de mammifères débute au stade fœtal puis s’arrête temporairement au stade dictié de la prophase-1. Cet arrêt sera maintenu pendant plusieurs années. In vivo, la méiose des ovocytes ne reprendra que suite au pic de LH (hormone lutéinisante) endogène. Lorsque les ovocytes sont retirés de leur follicule et cultivés in vitro, ils reprennent spontanément leur méiose. Une concentration élevée d’AMPc les maintient en arrêt méiotique caractérisé par le stade de vésicule germinale (GV ou dictié), tandis qu’une diminution de la concentration d’AMPc par l’action des phosphodiestérases (PDEs) permet la reprise méiotique. Cet ouvrage comporte deux volets qui investiguent le rôle joué par deux enzymes, la phosphodiestérase de type 3 et l’AMPK (5’adenosine monophosphate activated protein kinase), dans le mécanisme de la reprise méiotique des complexes-ovocytes-cumulus (COCs) et des ovocytes dénudés (DOs) porcins. / The meiosis of mammalian oocytes begins during fœtal life and stops at the dictyate stage. This stop would be maintained for severals years. LH surge in vivo or culturing oocytes in vitro allows spontaneous meiotic resumption. High intracellular levels of cAMP maintain meiotic arrest, characterized by the germinal vesicle (GV stage), while decreased levels induce meiotic resumption. This study was undertaken to assess the role of phosphodiesterase types 3 and 5’adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) in controlling meiotic resumption in both porcine cumulus-oocytes complexes (COC) and denuded oocytes (DO).

Etant au quatrième rang des cancers les plus fréquents chez l'homme, le cancer de la vessie représente un enjeu médical important. Pourtant, à ce jour, seuls des traitements chirurgicaux handicapants et/ou chimiothérapiques non spécifiques peuvent être envisagés. Le projet de thèse s'inscrit dans le cadre de la recherche de thérapies ciblées du cancer de la vessie en ayant pour objectif le blocage, au niveau moléculaire et de manière sélective, des voies de signalisation mises en œuvre par la tyrosine kinase Tyro3 au sein des cellules cancéreuses. La mise en évidence de la surexpression de ce récepteur membranaire dans la majorité des tumeurs de vessie et son rôle dans la survie des cellules cancéreuses ont en effet permis de valider Tyro3 comme cible thérapeutique pour ce type de cancers. Le projet peut se diviser en trois parties : le développement de nouvelles méthodologies de synthèse autour du motif imidazo[4,5-b]pyridine, la synthèse d'une librairie de candidats inhibiteurs en utilisant les méthodes mises au point et enfin l'étude des relations structure-activité vis-à-vis de la protéine kinase Tyro3. / Bladder cancer is a major medical issue, being the fourth most frequent cancer in men and treatable only with heavy surgery and/or broad-spectrum chemotherapy. This thesis project deals with the discovery of new targeted therapies of bladder cancer by blocking specifically, at a molecular scale in cancer cells, the signaling pathways in which protein kinase Tyro3 is involved. Indeed, its overexpression in most bladder cancers and the major part it plays in cancer cells survival have led to the validation of protein kinase Tyro3 as a therapeutic target for the treatment of bladder cancer. This thesis project can be divided into three main parts: the development of new synthetic methods around the imidazo[4,5-b]pyridine scaffold, the synthesis of a library of compounds using these methods and eventually the study of structure-activity relationships of these compounds versus Tyro3.

Le développement folliculaire est un processus finement régulé au cours duquel d'innombrables interactions se produisent. Cette régulation fine permet la production d'un ovocyte de qualité, précurseur d'un embryon apte à poursuivre les différentes étapes du développement embryonnaire. La production de cet ovocyte est dépendante des interactions avec son environnement, avec les cellules du cumulus, les cellules de la granulosa et de la thèque qui constituent le follicule ovarien. Ces cellules somatiques agissent comme régulateurs du développement ovocytaire et comme médiateurs de l'environnement maternel. Parmi les facteurs qui influencent la folliculogenèse, l'hormone folliculo-stimulante (FSH) et l'hormone lutéinisante (LH), deux principales hormones clés agissent de manière synergique et complémentaire pour assurer la croissance et l'ovulation. En plus de ces signaux hormonaux, le follicule est également sensible au métabolisme maternel qui, via différents métabolites et leurs précurseurs, influence le développement folliculaire. Dans un premier temps cette thèse s'intéresse à la caractérisation des principaux réseaux de signalisation qui sont impliqués dans la stimulation des cellules de la granulosa humaine en culture par les deux principales hormones ; la FSH et la LH. L'objectif étant d'utiliser des outils de génomique tels le séquençage à haut débit pour produire une image globale des différentes voies géniques qui répondent à l'activation des réseaux de signalisation de la protéine kinase A, de la protéine kinase C et de la protéine kinase B, trois voies de signalisation importantes dans la médiation des effets de la FSH et de la LH dans la granulosa. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse également à un autre aspect de l'environnement maternel qui, tout comme les signaux hormonaux, influence le développement folliculaire ; le métabolisme. Le deuxième volet de la thèse a donc comme objectif de décrire à l'aide des mêmes outils de génomique, l'impact des acides gras libres et de l'insuline sur les réseaux de signalisation des cellules de la granulosa humaine. L'utilisation d'un modèle cellulaire in vitro unique nous permettant l'étude des réseaux de signalisation dans un système stable et à un stade folliculaire autrement inaccessible chez la femme, a permis de mettre en évidence un rôle clair de la protéine kinase C dans la médiation des effets de la LH sur les cellules de la granulosa lors de la différenciation et maturation finale du follicule. L'étude plus en profondeur de ces réseaux de signalisation, incluant celui de la protéine kinase B au troisième chapitre, suggère que la protéine kinase A dirigerait majoritairement la différenciation folliculaire précoce alors que la protéine kinase C entrainerait une différenciation terminale impliquant des changements reliés aux processus inflammatoires et à l'ovulation. La protéine kinase B serait quant à elle une voie à caractère permissif agissant sur la survie cellulaire et qui supporterait les deux premières dans leurs actions. La thèse révèle également une certaine sensibilité des cellules de la granulosa au métabolisme maternel. Ainsi dans un contexte de maladie métabolique maternelle et d'exposition à de plus grandes quantités d'acides gras libres et d'insuline, plusieurs voies géniques reliées entre autres à la stéroïdogenèse, au métabolisme, à l'inflammation et au stress seraient perturbées dans la granulosa affectant ainsi le cours du développement folliculaire. En somme, les résultats présentés dans cette thèse suggèrent un aperçu global de l'action de certains des principaux réseaux signalétiques en action au cours de la folliculogenèse au niveau de la granulosa. Les données présentées dans cette thèse révèlent également un premier aperçu de la réponse génomique de ce tissu à certains défis métaboliques dont la prévalence est en augmentation dans la population. En plus de suggérer de nouveaux marqueurs potentiels et de générer de nouvelles hypothèses, les différentes études présentées dans cette thèse permettent l'amélioration de notre connaissance de la signature transcriptomique des cellules de la granulosa humaine en réponse aux gonadotrophines et à l'environnement métabolique maternel contribuant ainsi indirectement à l'amélioration des techniques de procréation assistée. / Folliculogenesis is a finely coordinated process that involves countless interactions which will influence the oocyte's quality and its ability to produce an embryo that will be capable of resuming the different steps of further embryonic development. Production of a good quality oocyte depends intrinsically on the interactions between the different cell types of the follicle and the exchanges with its direct environment. Granulosa cells act as the main coordinator for the follicular development and act as one of the principal mediators between the maternal environment and the oocyte. Among the many factors and hormones that influence folliculogenesis processes, the follicle-stimulating hormone (FSH) and the luteinizing hormone (LH) are both key hormones that regulate growth and ovulation in a complementary fashion. Besides these two hormones, the follicle is also sensitive to several components of the maternal metabolism such as hormones and metabolites that impact follicular development. First, the objective of this thesis was to characterize important signaling pathways involved in human granulosa cells stimulation by both FSH and LH. Using genomic technologies such as high-throughput sequencing, we were able to provide a global picture and a first insight of the three main signaling pathways activated in response to both hormones, namely the protein kinase A, the protein kinase B and the protein kinase C signaling pathways. Then, the thesis work also aims to describe, using the same technologies and the same in vitro model, the impact of maternal metabolism, more precisely of fatty acids and insulin on genomic answer in human granulosa cells. Using an in vitro cellular model allowing the study of the different signaling pathways in a very stable context and the study of a follicular stage otherwise not accessible in women, the work completed in this thesis allowed us to highlight and to specify the role of the protein kinase C as a major mediator of the LH signaling action on granulosa cells differentiation and final follicular maturation. In depth study of the main signaling pathways involved in FSH and LH signaling, including the protein kinase B, suggested that PKA signaling may drive the early differentiation of granulosa cells while PKC is thought to potentially control the "advanced" granulosa cell differentiation, mediating pathways related to inflammation and ovulatory processes. The PKB pathway should be looked at as a permissive signaling pathway that supports cell survival as well as PKA and PKC signaling but that is certainly of no less importance. The results of chapter 4 also revealed the direct sensitivity of granulosa cells to the metabolic context of the female during late folliculogenesis. Globally, when exposed to metabolic challenges such as high concentrations of fat and insulin, human granulosa cells seemed to respond through the modulation of numerous genes and pathways related to mitochondrial biofunctions, energy metabolism, and steroidogenesis and to activate as well a gene expression program linked to the immune response and to inflammatory processes. Ultimately, this thesis presents a first insight of the action of the main kinases involved in the response to gonadotrophin stimulation in human granulosa cells and an overview of the genomic reorganization in these cells triggered by metabolic challenges that are increasing in prevalence in the current population. Providing a great amount of data to potentially target new developmental or quality makers, this work also generates lots of new hypotheses on mechanisms involved in human folliculogenesis contributing to the improvement of our knowledge of human granulosa cells transcriptomic signatures and indirectly to the improvement of medically assisted reproduction techniques.

Le développement folliculaire est un processus finement régulé au cours duquel d'innombrables interactions se produisent. Cette régulation fine permet la production d'un ovocyte de qualité, précurseur d'un embryon apte à poursuivre les différentes étapes du développement embryonnaire. La production de cet ovocyte est dépendante des interactions avec son environnement, avec les cellules du cumulus, les cellules de la granulosa et de la thèque qui constituent le follicule ovarien. Ces cellules somatiques agissent comme régulateurs du développement ovocytaire et comme médiateurs de l'environnement maternel. Parmi les facteurs qui influencent la folliculogenèse, l'hormone folliculo-stimulante (FSH) et l'hormone lutéinisante (LH), deux principales hormones clés agissent de manière synergique et complémentaire pour assurer la croissance et l'ovulation. En plus de ces signaux hormonaux, le follicule est également sensible au métabolisme maternel qui, via différents métabolites et leurs précurseurs, influence le développement folliculaire. Dans un premier temps cette thèse s'intéresse à la caractérisation des principaux réseaux de signalisation qui sont impliqués dans la stimulation des cellules de la granulosa humaine en culture par les deux principales hormones ; la FSH et la LH. L'objectif étant d'utiliser des outils de génomique tels le séquençage à haut débit pour produire une image globale des différentes voies géniques qui répondent à l'activation des réseaux de signalisation de la protéine kinase A, de la protéine kinase C et de la protéine kinase B, trois voies de signalisation importantes dans la médiation des effets de la FSH et de la LH dans la granulosa. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse également à un autre aspect de l'environnement maternel qui, tout comme les signaux hormonaux, influence le développement folliculaire ; le métabolisme. Le deuxième volet de la thèse a donc comme objectif de décrire à l'aide des mêmes outils de génomique, l'impact des acides gras libres et de l'insuline sur les réseaux de signalisation des cellules de la granulosa humaine. L'utilisation d'un modèle cellulaire in vitro unique nous permettant l'étude des réseaux de signalisation dans un système stable et à un stade folliculaire autrement inaccessible chez la femme, a permis de mettre en évidence un rôle clair de la protéine kinase C dans la médiation des effets de la LH sur les cellules de la granulosa lors de la différenciation et maturation finale du follicule. L'étude plus en profondeur de ces réseaux de signalisation, incluant celui de la protéine kinase B au troisième chapitre, suggère que la protéine kinase A dirigerait majoritairement la différenciation folliculaire précoce alors que la protéine kinase C entrainerait une différenciation terminale impliquant des changements reliés aux processus inflammatoires et à l'ovulation. La protéine kinase B serait quant à elle une voie à caractère permissif agissant sur la survie cellulaire et qui supporterait les deux premières dans leurs actions. La thèse révèle également une certaine sensibilité des cellules de la granulosa au métabolisme maternel. Ainsi dans un contexte de maladie métabolique maternelle et d'exposition à de plus grandes quantités d'acides gras libres et d'insuline, plusieurs voies géniques reliées entre autres à la stéroïdogenèse, au métabolisme, à l'inflammation et au stress seraient perturbées dans la granulosa affectant ainsi le cours du développement folliculaire. En somme, les résultats présentés dans cette thèse suggèrent un aperçu global de l'action de certains des principaux réseaux signalétiques en action au cours de la folliculogenèse au niveau de la granulosa. Les données présentées dans cette thèse révèlent également un premier aperçu de la réponse génomique de ce tissu à certains défis métaboliques dont la prévalence est en augmentation dans la population. En plus de suggérer de nouveaux marqueurs potentiels et de générer de nouvelles hypothèses, les différentes études présentées dans cette thèse permettent l'amélioration de notre connaissance de la signature transcriptomique des cellules de la granulosa humaine en réponse aux gonadotrophines et à l'environnement métabolique maternel contribuant ainsi indirectement à l'amélioration des techniques de procréation assistée. / Folliculogenesis is a finely coordinated process that involves countless interactions which will influence the oocyte's quality and its ability to produce an embryo that will be capable of resuming the different steps of further embryonic development. Production of a good quality oocyte depends intrinsically on the interactions between the different cell types of the follicle and the exchanges with its direct environment. Granulosa cells act as the main coordinator for the follicular development and act as one of the principal mediators between the maternal environment and the oocyte. Among the many factors and hormones that influence folliculogenesis processes, the follicle-stimulating hormone (FSH) and the luteinizing hormone (LH) are both key hormones that regulate growth and ovulation in a complementary fashion. Besides these two hormones, the follicle is also sensitive to several components of the maternal metabolism such as hormones and metabolites that impact follicular development. First, the objective of this thesis was to characterize important signaling pathways involved in human granulosa cells stimulation by both FSH and LH. Using genomic technologies such as high-throughput sequencing, we were able to provide a global picture and a first insight of the three main signaling pathways activated in response to both hormones, namely the protein kinase A, the protein kinase B and the protein kinase C signaling pathways. Then, the thesis work also aims to describe, using the same technologies and the same in vitro model, the impact of maternal metabolism, more precisely of fatty acids and insulin on genomic answer in human granulosa cells. Using an in vitro cellular model allowing the study of the different signaling pathways in a very stable context and the study of a follicular stage otherwise not accessible in women, the work completed in this thesis allowed us to highlight and to specify the role of the protein kinase C as a major mediator of the LH signaling action on granulosa cells differentiation and final follicular maturation. In depth study of the main signaling pathways involved in FSH and LH signaling, including the protein kinase B, suggested that PKA signaling may drive the early differentiation of granulosa cells while PKC is thought to potentially control the "advanced" granulosa cell differentiation, mediating pathways related to inflammation and ovulatory processes. The PKB pathway should be looked at as a permissive signaling pathway that supports cell survival as well as PKA and PKC signaling but that is certainly of no less importance. The results of chapter 4 also revealed the direct sensitivity of granulosa cells to the metabolic context of the female during late folliculogenesis. Globally, when exposed to metabolic challenges such as high concentrations of fat and insulin, human granulosa cells seemed to respond through the modulation of numerous genes and pathways related to mitochondrial biofunctions, energy metabolism, and steroidogenesis and to activate as well a gene expression program linked to the immune response and to inflammatory processes. Ultimately, this thesis presents a first insight of the action of the main kinases involved in the response to gonadotrophin stimulation in human granulosa cells and an overview of the genomic reorganization in these cells triggered by metabolic challenges that are increasing in prevalence in the current population. Providing a great amount of data to potentially target new developmental or quality makers, this work also generates lots of new hypotheses on mechanisms involved in human folliculogenesis contributing to the improvement of our knowledge of human granulosa cells transcriptomic signatures and indirectly to the improvement of medically assisted reproduction techniques.

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire. / Anti-obesity therapies mostly focused on development of centrally-acting drugs, which also promote weight loss properties. Many studies have documented the relevance of neuroendocrine peptides in the hypothalamus and their influence on the regulation of energy balance. Some neuropeptides have been reported to be expressed and secreted by the adipose tissue where they modulate lipid metabolism, reflecting the importance between hypothalamus and adipose tissue. Among neuropeptides that regulate appetite, QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides) was reported to have hyperphagic properties associated with an increase of adipose mass over lean mass in mice. Both QRFP and its receptor GPR103 are expressed in the hypothalamus of many spices. However, whether QRFP peptides and its receptor are involved in peripheral lipid metabolism is still unknown. This thesis focused on the peripheral effects of QRFP and the role of its receptor on adipose tissue. The results presented here show that QRFP-43 and -26 have direct adipogenic effects on both 3T3-L1 adipocytes and isolated adipocytes from white adipose tissue (WAT). Indeed, we found that prepro-QRFP and the GPR103B receptor, which is one of the two GPR103 sub-types found in mice, are expressed in 3T3-L1 adipocytes and in WAT isolated adipocytes. When mice are fed with high-fat diet, prepro-QRFP expression was reduced whilst GPR103B was increased in different WAT. In human omental adipocytes, both prepro-QRFP and GPR103 are expressed. QRFP treatment on 3T3-L1 adipocytes inhibits isoproterenol (ISO) induced-lipolysis and promotes adipognesis trought fatty acid uptake and expression of key adipogenic transcription factors, PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) and C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha). The functionality of the GPR103B receptor was studied using short hairpin RNA to knock down its expression in 3T3-L1 adipocytes. Knockdown of GPR103B resulted in complete loss of QRFP peptides antilipolytic effects and fatty acid uptake. GPR103B signaling pathways in antilipolytic effects of QRFP-43 were investigated using 3T3-L1 adipocytes model. Stimulation of GRP103B induced PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B) pathway. QRFP-43 attenuates lipolysis by inhibiting ISO induced-phosphorylation of perilipin A (PLIN1a) and hormone sensitive lipase (HSL). Moreover, we have underscored the mechanisms of GPR103B mediating inhibition of PLIN1a in 3T3-L1 adipocytes. Activation of GPR103B prevents the translocation of caveolin 1 and the catalytic subunit of PKA induced by ISO on lipid droplets. This latter mechanism is the result of the inhibition of Src kinases and PKC induced by ISO following QRFP-43 treatment in 3T3-L1 adipocytes. In conclusion, the work conducted in this thesis demonstrates a new role of QRFP peptides and the receptor GPR103B as modulator of lipid metabolism in adipose tissue. We have also underscored GPR103B signaling pathways leading to inhibition of lipolysis in adipocytes.